Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Screening af sædceller for hurtig isolering af kimlinjeredigeringer hos zebrafisk
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
CRISPR-Cas-teknologier har revolutioneret genomredigering. At finde og isolere den ønskede kimlinjeredigering er dog fortsat en stor flaskehals. Derfor beskriver denne protokol en robust metode til hurtig screening af F0 CRISPR-injiceret zebrafisksæd for kimlinjeredigeringer ved hjælp af standard PCR-, restriktionsfordøje- og gelelektroforeseteknikker.
Transcript
Denne protokol beskriver en metode til hurtigt at screene tusindvis af genomer ved hjælp af F0 CRISPR-injiceret zebrafisksæd. Denne teknik er fordelagtig i dens tilgængelighed. I stedet for dyre, specialiserede sekventeringsbaserede tilgange bruger vores metode PCR-restriktionsenzymer og gelelektroforese til at screene F0-mandlige bærere for indels eller specifikke genomredigeringer.
Den sværeste del af denne procedure er bare at få sædcellerne hurtigt, men det bliver en god teknik til in vitro-befrugtning, hvis vi arbejder med mange dysmorfe fisk, og det er derfor en nem måde for os at krydse fisk, der giver os problemer. Start med at oprette avlstanke til både vildtypen og F0-fisken, og udruger tankene natten over. Efter bedøvelse af hanfisken næste dag, brug en hulske til at overføre den til en stak rene papirhåndklæder.
Rul forsigtigt fisken for at fjerne overskydende vand. Fjern eventuelt vand ved at tørre det tørt med et rent foldet væv. Brug hulskeen til at overføre fisken til den tilberedte svamp.
Placer fiskens ventralside opad og blød forsigtigt området omkring analfinnerne med et rent foldet silkepapir. For at samle sædcellerne skal du bruge et kapillarrør til forsigtigt at flytte bækkenfinnerne væk fra midterlinjen og udsætte cloaca. Placer kapillarrøret nær cloaca.
Med fingrene eller et par filtertang skal du forsigtigt klemme fiskens sider fra gællerne ned. Brug kapillær virkning til at samle sædcellerne i røret og placere det i et PCR-rør indeholdende 40 mikroliter 50 millimolær natriumhydroxidopløsning, og udvis derefter prøven i røret. Efter centrifugering af sædprøverne i en minicentrifuge skal PCR-rørene placeres i en termisk cyklist.
Kør cyklisten ved at opvarme prøverne i 40 minutter ved 95 grader Celsius efterfulgt af afkøling ved 25 grader Celsius. Efter fjernelse af prøverne fra cyklisten neutraliseres pH ved tilsætning af 10 mikroliter af en molær trishydrochlorid med pH otte. Blandingen blandes ved at opsuge suspensionen og derefter centrifugere prøverne.
Indstil den termiske cyklist til 95 grader Celsius for forvarmning. Og i mellemtiden skal du forberede 25 mikroliter PCR-reaktionsblandingen til hver sædprøve. Bland godt ved pipettering op og ned, og drej derefter prøverne.
Anbring prøverne i den forvarmede termiske cyklist, og indstil cyklussen. For at opnå en gelopløsning mikrobølges en 4% agarosegelopløsning fremstillet ved blanding af agarosepulver, gelplet og TBE-buffer. Hæld gelopløsningen i en gelstøberamme og indsæt en kam på den ene side.
Efter gelstørkning skal kammen forsigtigt fjernes. Placer gelen i en elektroforeserig, således at brøndene er tættest på den negative elektrode. Hæld TBE-løbebufferen i riggen, indtil brøndene er helt nedsænket.
Begynd at lægge gelen ved at pipettere fem mikroliter DNA-stige i den første brønd. Fyld de resterende brønde med 5 til 10 mikroliter PCR-produkt. Kør gelen i 1 time ved 150 volt for at sikre tilstrækkelig adskillelse af ampullerne.
Brug gelbilledet til at se DNA-båndene. p2ry12 locus-analyse viste, at vildtype-amplicon viste et enkelt bånd på 250 baseparlængde, mens de F0-injicerede mandlige ampliconer indeholdende indels løb som flere bånd. DNAH10 locus analyse viste, at wild-type amplicon køre som en enkelt 400 base par lange bånd.
F0-injicerede mandlige ampliconer indeholdende indels løb som flere bånd eller som et enkelt bånd med nedsat gelmobilitet. Den F0-injicerede mandlige nummer et havde et ekstra bånd i det fordøjede produkt, som var fraværende i PCR-produktet, hvilket gjorde det til den bedste grundlæggerkandidat til mutant knock-in line-etablering. Hvis en mandlig fisk ikke producerer sæd, når den presses, er det bedst at hvile fisken i en uge og prøve igen i stedet for at klemme dem for hårdt og risikere at skade dem.
Når FC eller den mandlige grundlægger er på tværs, skal allelerne sekvensverificeres i F1-afkommet. Sekventering af F1 amplicons direkte og udførelse af heterozygot allelanalyse er en nem måde at gøre dette på.
Tags
Denne måned i JoVE udgave 192 CRISPR-CAS9 zebrafisk sæd-DNA genomisk redigeringRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
