Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

이 프로토콜은 해부하다하는 방법을 보여줍니다

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107, doi:10.3791/1107 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

당신이 시작하기 전에

  1. 모든 문화가 25 ° C.에 성장한다
  2. HL3.1 해부 버퍼는 사전에 준비 수 있습니다. HL3.1 50 ML의 나누어지는을 가지고하고 얼음에 보관하십시오.
  3. HL3.1에 ​​신선한 3.5 %의 포름 알데히드의 15 ML을 준비합니다. 그 얼음 보관하십시오.

애벌레 해부

  1. 해부 접시에 감기 HL3.1 한 방울을 넣어. 이것은 쉽게 사용할 수 있도록 동물을 건조하고 기절에서 동물을 유지합니다.
  2. 긴 집게를 사용하여 떠도는 셋째 instar의 유충을 선택하고 HL3.1의 드롭에 놓으십시오.
  3. 첫째, minutien 핀을 파악하기 위해 짧은 집게를 사용합니다. 뒷부분 spiracles 사이에 핀을 놓습니다. 동물은 보통 자체를 스트레칭하고 입 후크 근처 유충의 머리에 정면 핀 배치하는 것이 쉽게 핀 멀리 크롤 링을 시도합니다. 길이 동물 내밀 어라. 이것은 당신이 절삭하는 동안 얻을 수 있습니다 노출된 신체 벽의 양을 최대화하는 데 도움이됩니다. 참고 : 먼저 머리를 핀을 선택하면, 동물은 핀 주위의 시신을 포장하거나 어려운 핀 수 있도록 앞뒤로 그 몸에 채찍 수 있습니다. 당신은 일반적으로 HL3.1를 제거하고 다시 멋진 새로운 감기 드롭 동물을 넣어 이것을 카운터 수 있습니다. 양손 잡이 과학자는 단지 동물을 잡고 제자리에 고정하실 수 있습니다.
  4. 를 사용하여 스프링 가위는 유충의 등의 측면에서 사후 핀 단 앞쪽에 수평 절개를합니다. 절개에 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고 유충의 주동이의 끝을 향해 등의 정중선을 따라 수직으로 절단합니다. 동물의 연단에서 오른쪽 핀의 왼쪽 및 수평 incisions는합니다. 참고 : 완성된 결과가 rostrocaudal 축을 따라 유충의 지느러미 측면에 나처럼 보이게한다.
  5. 장기를 제거합니다. 유충에 HL3.1 여러 추가 방울을 넣어 시작합니다. 이것은 장기가 더 쉽게 제거할 수 있도록 신체의 밖으로 최대 부동 수 있도록합니다. 첫째, tracheal 시스템을 제거합니다. 둘째, 장기의 나머지 부분을 움켜 포셉를 사용하여 그들을 제거합니다.
  6. 3 단계 동안 시체는 벽에서 왼쪽 및 오른쪽 플랩 플랩을했다. 모두 수직 및 수평 몸을 벽을 스트레칭해야하고 시계 방향 순서로 펄럭를 핀.

정치

25 분 HL3.1에서 3.5 %의 포름 알데히드의 각 동물을 수정. 5 분 두 번 HL3.1에있는 동물을 씻으십시오.

저장

핀을 제거하고 1X PBS를 포함하는 1.5 ML 튜브에 애벌레를 전송할 수 있습니다. 이 이미지를 융합 형광 태그를 사용하여 NMJ를 계획하는 경우 이틀 이내에 이미지가 동물을해야합니다. 당신은 4 ° C. 한 주일에 대한 해부 애벌레를 저장할 수 있습니다

대표 결과

제대로 해부 Drosophila의 유충 몇 가지 주요 구성 요소가 있습니다. 첫째, 하나는 특히 근육, 근육 4, 6, 7을 손상하지 않도록 여분의 처리한다. 이러한 연구에 가장 인기있는 근육이며, 그들이 손상된 경우 등심 준비를 버리고 다른 동물을 해부하다. 둘째, 하나는 동물 maximally 각 근육 NMJ가 구분할 수 있도록 뻗어 있는지 확인합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 동영상에서 보여주 절개 기법은 실험 기법의 다양한 Drosophila의 애벌레를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 단백질 태그가 존재하는 경우, 애벌레가 탑재 바로 몇 군데 있습니다. 그렇지 않으면, immunostaining는 특정 신경 구획을 표시하기 위해 수행할 수 있습니다. 또한, 전기 생리학 쉽게 neurotransmission의 기능을 평가할 수있는 해부 애벌레에서 수행할 수 있습니다.

Drosophila의 NMJ의 기본 구조와 기능을 조명 초기 연구부터 큰 인기를 얻고있다. 1-4은 Drosophila NMJ의 개발 연구에 확인된 분자의 대부분은 척추 동물에 보존되어있다. 4 따라서, 많은 Drosophila NMJ 연구를 통해 배운 지식은 모든 생명체의 신경 생물학에 적용됩니다. 몇 가지 응용 프로그램은 축삭지도에 관련된 분자의 연구, 모터 신경 질환, 학습, 및 메모리를 포함합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000 Carl Zeiss, Inc. 495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD Carl Zeiss, Inc. 000000-1063-181
3mm Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-0
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11200-33 Long forceps
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Short forceps
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 Used to make dissection plates
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549-25ML
Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter Fine Science Tools 26002-10
HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.


Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  2. Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
  3. Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
  4. Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73-1137 (1993).
  5. Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, (2), 377-402 (2004).

Comments

2 Comments

  1. Hi. I wonder if the fixation using formaldehyde is fine for any ulterior immunohistochemistry assay. Have you any experience if there is necessities for performing the fixation with other fixative? I´m asking this regarding the preservation of cytoskeletal proteins

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2009 - 4:07 PM
  2. Very well done Mr. Brent. You have a have steady hand !    

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 17, 2009 - 10:47 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics