Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

Biology
 

Summary

Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

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Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115, doi:10.3791/1115 (2009).

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Abstract

Uma das vantagens de estudar zebrafish é a facilidade e velocidade de manipular os níveis de proteínas no embrião. Morpholinos, que são oligonucleotídeos sintéticos com complementaridade antisense para RNAs alvo, podem ser adicionados para o embrião para reduzir a expressão de um produto gene particular. Por outro lado, mRNA processados ​​podem ser adicionados para o embrião para aumentar os níveis de um produto gene. O veículo para a adição ou mRNA ou morfolino a um embrião é microinjeção. Microinjeção é eficiente e rápida, permitindo a injeção de centenas de embriões por hora. Este vídeo mostra todos os passos envolvidos na microinjeção. Resumidamente, os ovos são recolhidos imediatamente após terem sido definidos e alinhados contra uma lâmina de microscópio numa placa de Petri. Em seguida, uma agulha de ponta fina carregado com material de injecção é conectado a um microinjetor e uma fonte de ar, e os controles microinjetor são ajustados para produzir um volume de injeção desejável. Finalmente, a agulha é mergulhado em gema do embrião e do morfolino ou mRNA é expulso.

Protocol

Parte 1: A produção de ovos e cobrança

  1. A noite antes da injeção, os peixes criados em tanques de criação com divisórias no lugar. Para aumentar a produção total de ovos, peixes pode ser configurado em uma proporção de duas fêmeas para um macho, se desejar.
  2. Na manhã seguinte, depois de as luzes da sala ligar, puxe os divisores de vários tanques e permitir a cerca de 20 minutos de tempo de acasalamento imperturbável.
  3. Usando um filtro, recolher os ovos das gaiolas de criação e enxaguar com água de ovo. Despeje os ovos em uma placa de Petri com água do ovo e remova ovos não fertilizados e detritos com uma pipeta. Os peixes podem ser reagrupados em tanques maiores para produzir rodadas adicionais de ovos para injeção. Ajustar o tempo de coleta de ovos para permitir número máximo de ovos a ser produzida sem deixá-los passar o estágio unicelular.
  4. Coloque uma lâmina de microscópio invertido na tampa de uma placa de Petri de 100mm. Use uma pipeta para alinhar os ovos contra a lateral da lâmina formando uma única coluna. Retirar a água em excesso do ovo a partir do slide pressionando uma Kimwipe contra o lado oposto os ovos. (Figura 1A)

Parte 2: Agulha puxando, carregamento e preparação

  1. Com um puxador de micropipeta, puxe um copo OD 1,0 milímetros capilar em duas agulhas e armazenar em uma placa de Petri 150 milímetros colocando sobre rampas bolinha de borracha. Agulhas pode ser puxado com antecedência.
  2. Agulha de protelar o com 3 mL de material de injecção utilizando uma pipeta microloader. Agitar o bolo em direção à ponta da agulha até que haja poucas ou nenhuma bolha restantes.
  3. Ligue a fonte de ar e microinjetor. Inserir a agulha no microinjetor e garantir uma perfeita vedação dentro da caixa. Verifique se o micromanipulador está em uma posição adequada para permitir uma ampla gama de movimentos e de ajuste. Traga a ponta da agulha no plano de visão do microscópio de alta fora do palco, e concentrar-se na região mais fina da ponta. Use uma pinça afiada para beliscar fora a agulha em um ponto que deixa a agulha fina o suficiente para furar o córion e gema, mas ainda capaz de fornecer um tamanho consistente talão. Uma gota de óleo mineral em um micrômetro pode ser usado para calcular o volume de cada injeção. Quando injetado no petróleo, um cordão com um diâmetro de 0,1 mm contém 500 pL de material de injeção (figura 1B); volumes de injeção de 500 pL ou 1nL são normalmente utilizados. Pressione o pedal e monitorar o tamanho do grânulo ao aparar a agulha e ajustando a pressão de injeção, conforme necessário. Volumes de injeção ideal vai preencher cerca de 10% do volume de ovos. A qualidade da ponta da agulha é crucial para ambos, a facilidade da injeção ea qualidade e consistência dos resultados.

Parte 3: Injeção

  1. Garantir os embriões não se desenvolveram após o estágio de quatro células. Idealmente, os embriões devem estar no estágio de uma célula.
  2. Abaixe a agulha em direção à coluna de ovos, segurando o prato no lugar com a mão oposta.
  3. Pierce superfície do córion e introduzir a gema de um só golpe suave enquanto assiste a qualquer esmagamento ou rompimento do saco vitelino. Injetar o material de injecção a gema (figura 1C). Evite injetar bolhas de ar ou esticar a gema ou como pode ser letal para o embrião. Trabalhando para baixo da linha, ajustar a pressão conforme necessário para manter um tamanho consistente talão e, usando uma ponteira, remover os ovos não fertilizados que parecem ou são destruídas durante o processo de injeção.
  4. Depois de completar uma coluna de ovos, use um jato suave de água do ovo para mover os ovos injetado em uma placa de Petri limpa. Repita conforme necessário. Manter vários embriões uninjected como controle. No final do dia, remova embriões mortos e gravar o número de embriões injetados. Substitua a água dos ovos no prato periodicamente para reduzir a chance de infecção.

Parte 4: Os resultados representativos

Dependendo do que está sendo injetado, os embriões podem sobreviver a uma taxa inferior do que seus irmãos uninjected. Felizmente, é fácil para injetar um grande número deles, então isso raramente é um problema. É normal que morphants para expor o desenvolvimento ligeiramente atrasado.

Para ilustrar os resultados da microinjeção, utilizamos esse protocolo para manipular os níveis da proteína Coração de Vidro (Heg). Heg é uma proteína transmembrana necessário para o desenvolvimento normal do coração. Na sua ausência, os embriões se desenvolvem corações com extensões entrada gigante e câmaras 1. Injetamos dois morpholinos anteriormente não descritas contra HEG, heg_e3i3_egfr1 e heg_e4i4_egfr2, em uma concentração de 500 mM. Menos 2 dias após a fertilização, os controles irmão uninjected aparecem normal, como esperado (Figura 2A e B). Embriões injetados com heg_e3i3_egfr1 têm edema cerebral (figura 2C). Embora os corações da maioria destes morphants ter alterado a morfologia, suas câmaras são normalmente de tamanho (figura 2D). Embriões injetadoscom heg_e4i4_egfr2 apresentam defeitos cardíacos variável. Alguns parecem normais, enquanto outros têm folhetos grande influxo e átrios moderadamente aumentado (Figura 2E e F). O mutante HEG, conforme relatado anteriormente 1, tem uma via de entrada extremamente alargada e do átrio (Figura 2G e H).

Também injetou embriões tipo selvagem com 400 mRNA ng / mL transcrito de full-length HEG cDNA. Enquanto os controles uninjected desenvolver normalmente (figura 3A e B), embriões injetados com HEG mRNA exibem um espectro de fenótipos que vão desde a aparência do tipo selvagem para ciclopia grave, encurtamento do eixo do corpo principal, necrose da cabeça e do corpo, e defeitos da linha média (figura 3C e D).

Figura 1. Embriões a ser injetado estão alinhados contra uma lâmina de microscópio numa placa de Petri (A). Volume de injeção é determinada pela injeção em óleo mineral colocado em um micrômetro. Um volume de injeção de 500 pL, que é comumente usado, tem um diâmetro de 0,1 mm (B). Imediatamente após a injeção, o morfolino ou mRNA é visível como uma mancha pontuam na gema (C).

Figura 2. Em 2 dias após a fertilização, os embriões não têm defeitos uninjected bruto (A) ou fenótipo coração (B). Embriões injetados com a heg_e3i3_egfr1 morfolino têm edema cerebral (C, seta), mas as câmaras cardíacas de tamanho normal (D). Alguns embriões injetados com a heg_e4i4_egfr2 morfolino têm extensões entrada alargada e átrios (E, F). HEG mutantes têm extensões entrada severamente alargada e átrios (G, H). (A), (C), (E) e (G) são 4x imagens DIC; (B), (D), (F) e (H) são 20x imagens DIC. um átrio = it = via de entrada.

Figura 3. Às 24 horas após a fertilização, os embriões uninjected ter um corpo longo e reto, sem necrose ou defeitos da linha média (A) e dois olhos bem definidos com um tubo neural entre eles (B). Alguns embriões injetados com mRNA HEG, em contrapartida, exibem um eixo do corpo encurtado, necrose, somitos deformado (C), e ciclopia (D). (A) e (C) são 4x imagens DIC; (B) e (D) são 20x imagens DIC.

Discussion

Um dos pontos fortes do sistema de modelo peixe-zebra é a facilidade com que produtos de genes específicos podem ser adicionados ou eliminados do embrião por microinjeção. Para ubiquitously superexpressam uma proteína particular, a codificação de mRNA é injetado na gema na fase 1-célula. Durante o desenvolvimento posterior do embrião, o RNA é distribuído por todo o organismo e traduzido. Por outro lado, para eliminar uma determinada proteína, morpholinos são usados. Morpholinos são oligonucleotídeos sintéticos projetados com a complementaridade de RNAs antisense específico. Como mRNAs, morpholinos são injetados na gema na fase 1-célula. Dentro do embrião que se ligam RNAs seu alvo, prevenindo tradução.

A principal modificação que precisa ser feita para cada morfolino ou mRNA é a concentração de material injetado. Uma concentração demasiado elevada de qualquer morfolino ou mRNA pode causar toxicidade não-específica, enquanto cada morfolino deve ser testado empiricamente para determinar a concentração ideal, normalmente morfolino concentrações entre 200 e 500 mM mM derrubar a atividade do gene de forma eficaz, sem causar defeitos não-específica. O tamanho exato da abertura da agulha não é crucial. Dentro de uma gama de tamanhos de agulha, pressão de injeção e tempo de injeção pode ser ajustado para produzir um bolo de o volume correto.

Morpholinos têm muitas aplicações, incluindo a dissecção funcional de domínios dentro de uma proteína. Quando se destinar a meta específica exon-intron cruzamentos, morpholinos impedirá splicing ocorra lá. Nós examinamos os efeitos de duas morpholinos que se ligam exon-intron junções na pré-mRNA de HEG. O heg_e3i3_egfr1 morfolino liga a junção entre exon 3 e intron 3, impedindo a maquinaria de splicing do exon 3 incorporando em transcrições maduro. O heg_e4i4_egfr2 morfolino semelhante remove exon 4. Ambos os exons 3 e 4 codificam domínios contendo EGF-like repete. Alguns embriões injetados com heg_e4i4_egfr2 moderadamente fenocópia o mutante; novos experimentos serão necessários para entender o papel do exon 4 Heg no desenvolvimento do coração. Surpreendentemente, os embriões injetados com heg_e3i3_egfr1 têm edema cerebral, uma característica não observada em mutantes HEG. Isto pode ser devido à capacidade de morpholinos para ligar transcrições materna que não seria afetada em mutantes zigóticos.

Acknowledgments

Reconhecemos os membros do laboratório de Mably e Storer Narie por sua assistência técnica, e da American Heart Association (NCRP Scientist Desenvolvimento Grant 0635363N) e do National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) para financiamento.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI 100
Micromanipulator Tool Narishige International MN 153
Needle Puller Tool Sutter Instrument Co. P 97
Glass Capillaries Tool World Precision Instruments, Inc. TW100 F6
Microloader Pipettes Tool Eppendorf 5242956.003
Needle Holder Tool World Precision Instruments, Inc. MPH310

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References

  1. Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).

Comments

19 Comments

  1. Request:           Respested sir/ madam                                Please can you send the protocol of DNA isolation, RAPD, and Procedure, culture media composition etc for protoplast culture. thanks.

    Reply
    Posted by: atanu d.
    April 2, 2009 - 5:09 AM
  2. You must have posted on the wrong protocol.  Ours is for zebrafish embryo microinjection.  Good luck finding the information you need!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 2, 2009 - 3:24 PM
  3. My translation-blocking morpholino is carboxy-fluoresecin tagged but I don't see the fluorescence under the microscope after injection? Can the concentration be too low? How dŒs the tag work? Thank you 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:05 PM
  4. Because the fluorescence of carboxyfluorescein dŒs not require any morpholino-related mechanism, I would verify that the injection material alone is fluorescing under your microscope. The tag is simply attached to the morpholino during manufacturing to ensure the presence of the morpholino in the injected tissue. The final concentration within the embryo would have to be extremely low to not be visible at all.    

    Reply
    Posted by: Michael S.
    April 21, 2009 - 10:47 AM
  5. Hey guys do you see any intergration events when injecting into the yolk? Would you expect to see a greater number intergration events if you injected directly into the cell? Have you seen yolk glowers when injecting reporter genes (e.g RXP/GFP) and if so what do you think is occuring here? Intergaration?

    Regards

    Giles

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 22, 2009 - 3:40 AM
  6. Hi Giles,
    When you inject DNA into the yolk, you get some integration, but not as much as when you inject into the cell. If you use the tol² system and inject DNA with particular flanking sequences and transposase RNA, you get a huge amount of integration. We do see yolk glowers; we're not sure whether this is due to maintenance of the plasmid as an episome, or whether integration has occured.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 24, 2009 - 1:11 PM
  7. Hi, Jonathan Rosen
    First of all thanks for such an informative presentation. I really liked it a lot and I am highly impressed with the techniques which has been used by your lab.Could you send the protocol for the microinjection of zebrafish embryo to analyse gene function. Also can you please let me know which equipment you use to displace embryos from one place to another inside the petridish or in agarose gel.
    I shall be thankful to you
    Kind Regards
    Avdesh
    chaudharyavdesh@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 23, 2009 - 10:18 AM
  8. dŒs the orientation of the embryo matter prior to injection? i always thought that the needle should pierce opposite to the cell, through the yolk sac. also, can a thick, firm needle damage the embryo, as opposed to a thin unsupported one?
    thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2010 - 9:16 PM
  9. I find it easiest to inject without going through the cell. Too thick a needle can definitely damage the embryo; if you're seeing a lot of yolk leak out after you inject, the needle is too thick.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 17, 2010 - 6:06 PM
  10. Sir i would like to know a simple study using wild type embryos of the Zebra fish with out using GFP

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 25, 2010 - 2:20 AM
  11. Sir i would like know a simple invitro study on the wild type embryos of Zebrafish with out GFP

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 25, 2010 - 2:22 AM
  12. Hi, Thanks for this video! Other protocols suggest injecting DNA/RNA/morpholino dissolved in KCl or Danieau's. Do you use one of these or just miliQ water, and do you think the solution makes a difference for survival? Thanks!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 10:21 AM
  13. Hi. Glad the video was helpful. Although KCl or Danieau's solution are often used, we haven't found that either improves embryo survival over just water. I believe Gene-Tools recommends dissolving the stock morpholino in water now, rather than Danieau's solution as they recommended in the past. They may have done a more thorough comparison of the different solutions and their influence on embryo development.

    Good luck with your studies.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 25, 2012 - 4:26 PM
  14. I am trying micro injection of EGFP-N3 vector to standardize the injection protocol. But in all my attempts, embryos are dying. what might be the reason. I am using methylene blue as a tracker. Please help me out.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 7:23 AM
  15. I have never tried it with methylene blue. I would use phenol red. I have also found that I get more lethality from DNA injection than from RNA injection. If you want to globally over-express a gene early in embryonic development, RNA is better anyway because it will go into every cell, whereas DNA will be mosaic.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 10:55 AM
  16. I WAS WONDERIN IF U HAVE EXPERIENCE USING TH PARASITE BLASTOCYST HOMINIS AS THE SHELL TO INJECTED OTHER PARASITES INTO AS MEANS OF PROTEIN PRODUCTION IF SO IWAS INTERESTED IN UR FININDINDS TO COMPARE TO THE THE VERY STRANG FINDINS FROM MY PROJECT

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 27, 2012 - 8:07 PM
  17. How to prepare egg water

    Reply
    Posted by: Yumei C.
    July 22, 2012 - 11:25 PM
  18. http://staff.missouriwestern.edu/users/daggett/PR1D.ZF.E3.pdf

    Reply
    Posted by: Michael S.
    November 6, 2012 - 6:38 PM
  19. Hello,
    I am currently using a Hsp70I promoter in the Tol² system for generating transgenic zebrafish. Any suggestions for the best time and condition to do heat shock after microinjecton ? Is Hsp70I promoter leaky after recovery from heat shock? Your suggestions and comments will be highly appreciated.

    Reply
    Posted by: Hsu k.
    March 6, 2013 - 3:19 AM

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