Gibberella zeae Ascosporen Produktion und Sammlung für Microarray-Experimente.

Published 11/30/2006
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Biology

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Summary

Zur Untersuchung der Entwicklungsprozesse von Ascosporen in Gibberella zeae, ein Verfahren für die Sammlung unter sterilen Bedingungen gefilmt wird, um ein Höchstmaß an Informationen für die Protokoll-Beschreibung zu generieren. Dies sollte die Reproduzierbarkeit der Experimente, ein entscheidender Aspekt, wenn sie voll Genom Expressionsprofil Tests durchgeführt werden.

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Pasquali, M., Kistler, C. Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.. J. Vis. Exp. (1), e115, doi:10.3791/115 (2006).

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Abstract

Fusarium graminearum Schwabe (Teleomorph Gibberella zeae) ist eine Pflanzenart Erreger Schorf Krankheit an Weizen und Gerste, die Ernteerträge und Kornqualität reduziert. F. graminearum verursacht auch Stiel und Ohr verrottet von Mais und ist ein Hersteller von Mykotoxinen, wie die Trichothecene, dass das Getreide verunreinigen und sind schädlich für Mensch und Vieh (Goswami und Kistler, 2004). Der Pilz produziert zwei Arten von Sporen. Ascosporen werden die Ableger, die sich aus der sexuellen Fortpflanzung, die Hauptquelle der primären Infektion. Diese Sporen werden gewaltsam aus reifen Perithecien entladen und verteilt durch den Wind (Francl et al 1999). Sekundäre Infektionen werden vor allem durch Makrokonidien die durch ungeschlechtliche bedeutet auf der Pflanze produziert werden verursacht. Zur Untersuchung der Entwicklungsprozesse von Ascosporen in diesem Pilz wurde ein Verfahren für ihre Sammlung in großen Mengen unter sterilen Bedingungen erforderlich. Unser Protokoll wurde gefilmt, um ein Höchstmaß an Informationen für das Verständnis und die Reproduzierbarkeit zu erzeugen; entscheidende Aspekte, wenn sie voll Genom Genexpressionsprofile generiert und interpretiert werden. Insbesondere sind die Variabilität der Ascosporen Keimung und die biologische Aktivität abhängig von der vorherigen Manipulation des Materials. Die Verwendung von Video zu dokumentieren jeden Schritt in Ascosporen Produktion wird vorgeschlagen, um die Standardisierung zu erhöhen, die Einhaltung der immer strengeren Anforderungen für die Microarray-Analyse. Das Verfahren erfordert nur Standard-Laborgeräte. Schritte gezeigt, um Verunreinigung und für die Zeitsynchronisation von Ascosporen zu verhindern.

Protocol

  1. Carrot-Agar (Klittich und Leslie, 1988) wurde in 9-cm Durchmesser Petrischalen vorbereitet.
  2. A 2 mm Kantenlänge von Agar mit frischem Mycel auf Kartoffel-Dextrose-Agar gewachsen war, die Mitte jeder Petrischale aufgebracht.
  3. Die Kulturen wurden bei 25 ° C gezüchtet und eine 12-h Photoperiode für 96 Stunden.
  4. Ein ml wässrige 2,5% Tween 60 wurde auf die Oberfläche der Kultur (Trail und Common, 2000) aufgetragen und über die Kultur mit einem Kunststoff-Stab, durch leichtes Drücken.
  5. Perithecien Dreharbeiten Ascosporen entwickelt 7-10 Tage nach dieser Induktionstherapie, wenn in einer Umgebung mit hoher Feuchtigkeit bei 25 ° C gehalten mit der gleichen Photoperiode.
  6. Spore Kollektion zeichnet sich durch die Änderung der Petrischale Deckel durchgeführt, so dass Perithecien für eine begrenzte Zeit (zB 12 Stunden) in der Dunkelheit zu schießen.
  7. Sterilem Wasser auf den Deckel gegeben, die Aussetzung Ascosporen durch vorsichtiges Bewegen Wasser auf der Oberfläche.
  8. Ascosporen werden in sterile Falcon-Röhrchen gesammelt, gewaschen und zur weiteren Analyse.

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Discussion

Das Protokoll hier vorgestellte auf früheren Verfahren für perithecial Produktion für Fusarium spp verwendet wird. (Klittich und Leslie, 1988; Trail und Common, 2000). Die Standardisierung der Verfahren, mit dem große Mengen von Ascosporen (ausreichend für Microarray-Analyse) generiert wurden war wesentlich für die Reproduzierbarkeit der Experimente. Es wurde berichtet, dass Umweltfaktoren, Alter und Substrat Unterschiede kann die biologische Charakter der Ascosporen (Beyer und Verreet, 2005) zu ändern. Daher ist die Verwendung von Video kann Highlight kleinen Details in den Weg Sporen produziert und gesammelt werden, die Reproduzierbarkeit zu erleichtern sollten. Insbesondere das Video des Verfahrens sollte das Niveau der Standardisierung von Labor zu Labor und erleichtern den Vergleich der gesamten Genoms Transkription Studien, die Ascosporen Produktion erfordern. Die Menge an RNA, die für Experiment Verfahren ist relativ hoch, so eine große Anzahl von Petrischale synchron verarbeitet werden sollten. Video ist ein besonders geeignetes Werkzeug, wenn es notwendig, ganze Genom transkriptionelle Studien zu neuen biologischen Material zu implementieren ist, einen Standard für zukünftige Experimente.

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Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich Karen Hilburn für einen ausgezeichneten technischen Support. Dieses Projekt wurde von der National Research Initiative des USDA Cooperative State Research, Education and Extension Service (Preis # 2004-35604-14327) unterstützt. Matias Pasquali wird von Branco Weiss Fellowship unterstützt. Die US-Weizen und Gerste Scab Initiative ist auch für die fortgesetzte Unterstützung der Forschung anerkannt.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri dish 9 cm diameter Tool
Tween 60 (20%) Reagent
Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. (2005).
  2. Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. (1999).
  3. Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. (2004).
  4. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
  5. Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. (2000).
  6. Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. 67-1101 (1975).
  7. Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. (1976).

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