Gibberella zeae ascospores production et la collecte d'expériences sur biopuces.

Published 11/30/2006
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Biology

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Summary

Pour étudier les processus de développement des ascospores dans Gibberella zeae, une procédure de collecte dans des conditions stériles est filmé afin de générer le plus haut niveau de l'information pour la description du protocole. Ceci devrait faciliter la reproductibilité de l'expérience, un aspect crucial lorsqu'il est plein des tests d'expression du génome profil sont mis en œuvre.

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Pasquali, M., Kistler, C. Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.. J. Vis. Exp. (1), e115, doi:10.3791/115 (2006).

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Abstract

Fusarium graminearum Schwabe (téléomorphe Gibberella zeae) est un agent pathogène des plantes causant la gale sur le blé et l'orge qui réduit le rendement des récoltes et la qualité du grain. F. graminearum provoque aussi pourrit tige et épi de maïs et est un producteur de mycotoxines telles que les trichothécènes qui contaminent grain et sont nocifs pour les humains et le bétail (Goswami et Kistler, 2004). Le champignon produit deux types de spores Les ascospores, les propagules résultant de la reproduction sexuée, sont la principale source de l'infection primaire. Ces spores sont forcément déchargé de périthèces matures et dispersées par le vent (Francl et al 1999). Les infections secondaires sont principalement causées par macroconidies qui sont produites de manière asexuée sur la surface de la plante. Pour étudier les processus de développement des ascospores dans ce champignon, une procédure pour leur collection en grande quantité dans des conditions stériles a été nécessaire. Notre protocole a été filmé afin de générer le plus haut niveau de l'information pour comprendre et reproductibilité; aspects cruciaux quand il est plein de profils d'expression génétique du génome sont générés et interprétés. En particulier, la variabilité de la germination des ascospores et l'activité biologique sont dépendants de la manipulation préalable de la matière. L'utilisation de la vidéo pour documenter chaque étape de production d'ascospores est proposé afin d'accroître la normalisation, se conformer aux exigences plus strictes pour l'analyse des microréseaux. La procédure ne requiert que du matériel de laboratoire standard. Des mesures sont indiquées pour prévenir la contamination et la synchronisation de l'heure faveur des ascospores.

Protocol

  1. Agar Carotte (Klittich et Leslie, 1988) a été préparé en 9 cm de diamètre des boîtes de Petri.
  2. Un cube de 2 mm d'agar contenant du mycélium frais cultivés sur Potato dextrose agar a été appliquée au centre de chaque boîte de Pétri.
  3. Les cultures ont été cultivées à 25 ° C et une photopériode de 12 h à 96 heures.
  4. Un ml de solution aqueuse à 2,5% de Tween 60 a été appliqué à la surface de la culture (Trail et communes, 2000) et la propagation à travers la culture avec une tige en plastique, en appuyant délicatement.
  5. Tir périthèces ascospores développés 7-10 jours après ce traitement d'induction lorsqu'il est maintenu dans un environnement très humide à 25 ° C avec la photopériode mêmes.
  6. Collecte de Spore est effectué en changeant le couvercle de la plaque de Petri, laissant périthèces à tirer pour un temps limité (par exemple 12 heures) dans l'obscurité.
  7. L'eau stérile est ajouté au couvercle, la suspension par les ascospores doucement l'eau en mouvement sur la surface.
  8. Les ascospores sont recueillis dans des tubes Falcon stériles, lavées et utilisées pour une analyse ultérieure.

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Discussion

Le protocole présenté ici est basé sur les procédures utilisées précédemment pour la production de périthèces pour Fusarium spp. (Klittich et Leslie, 1988; Trail et communes, 2000). Normalisation de la procédure par laquelle une grande quantité d'ascospores (suffisant pour l'analyse des microréseaux) ont été générés était essentielle pour la reproductibilité de l'expérience. Il a été rapporté que les différences des facteurs environnementaux, l'âge et le substrat peut changer le caractère biologique des ascospores (Beyer et Verreet, 2005). Par conséquent, l'utilisation de la vidéo peut mettre en évidence les petits détails dans la façon dont les spores sont produites et recueillies qui devrait faciliter la reproductibilité. En particulier la vidéo de la procédure devrait permettre d'améliorer le niveau de standardisation entre les laboratoires et faciliter la comparaison des études de l'ensemble de la transcription du génome qui nécessitent la production d'ascospores. La quantité d'ARN nécessaire à la procédure expérience est relativement élevé pour un grand nombre de boîtes de Petri doivent être traités de façon synchrone. La vidéo est un outil particulièrement adapté lorsqu'il est nécessaire de mettre en œuvre des études sur le génome entier de la transcription nouveaux matériels biologiques, établir une norme pour des expériences futures.

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Acknowledgements

Les auteurs remercient Karen Hilburn pour le soutien technique excellente. Ce projet a été soutenu par l'Initiative Nationale de la Recherche de l'USDA Cooperative State Research, Education and Extension Service (Prix # 2004-35604-14327). Matias Pasquali est soutenu par Branco Weiss Bourse. Le blé américain et l'Initiative tavelure L'orge est également reconnu pour le soutien continu de recherche.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri dish 9 cm diameter Tool
Tween 60 (20%) Reagent
Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. (2005).
  2. Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. (1999).
  3. Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. (2004).
  4. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
  5. Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. (2000).
  6. Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. 67-1101 (1975).
  7. Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. (1976).

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