Gibberella zeae子囊孢子生产和收集微阵列实验。

Published 11/30/2006
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Biology

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Summary

研究Gibberella zeae,收集过程中的子囊孢子发育过程的无菌条件下的拍摄,以产生最高水平协议描述的信息。这应有助于重现性的实验,全基因组表达谱测试实施时的一个关键方面。

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Pasquali, M., Kistler, C. Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.. J. Vis. Exp. (1), e115, doi:10.3791/115 (2006).

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Abstract

镰刀菌施瓦布(有性型Gibberella zeae)是一种植物,降低了作物产量和粮食质量的小麦和大麦的黑星病的病原。禾谷镰刀菌引起的玉米秸秆和耳朵腐烂,如霉菌毒素污染粮食和有害人类和牲畜“(哥斯瓦米和奇石,2004)的trichothecenes的生产。这种真菌产生两种类型的孢子。子囊孢子,从有性繁殖的繁殖,是原发感染的主要来源。这些孢子被强行出院,从成熟的子囊壳和分散风(Francl等1999)。 macroconidia这是无性手段在植物表面产生主要是由于继发感染。为了研究这种真菌的子囊孢子在发育过程中,他们在无菌条件下收集大量的程序是必要的。我们的协议是拍摄全基因组基因表达谱的生成和解释时,以产生最高水平的理解和再现性的信息;关键方面。子囊孢子的萌发和生物活性的变化,特别是依赖于材料事先操纵。建议使用的视频记录在子囊孢子生产的每一步,以提高标准化,符合微阵列分析的要求越来越严格。这个过程只需要标准的实验室设备。所示的步骤,以防止污染和有利于子囊孢子的时间同步。

Protocol

  1. 胡萝卜琼脂(Klittich和莱斯利,1988年)准备在直径9厘米的培养皿。
  2. 一个2毫米的立方体,含有马铃薯葡萄糖琼脂上生长的新鲜菌丝体琼脂是适用于每个培养皿的中心。
  3. 文化生长在25 ° C和12 h光照为96小时。
  4. 水溶液2.5%吐温60毫升,适用于文化的表面(径及常见,2000年),跨文化传播与塑料棒,轻轻按压。
  5. 子囊壳拍摄子囊此诱导治疗后7-10天保持在25 ° C时,在高湿度环境中相同的光照。
  6. 孢子的收集是通过改变的Petri板盖,留下子囊壳为在有限的时间(例如12小时)在黑暗中拍摄。
  7. 添加无菌水的盖子,暂停轻轻移动表面上的水的子囊孢子。
  8. 子囊孢子在无菌猎鹰管收集,洗净,用于进一步的分析。

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Discussion

这里介绍的协议是基于以前的程序,用于镰刀菌的perithecial生产。 (Klittich和莱斯利,1988年;径和通用,2000)。标准化的过程,产生大量的子囊孢子(足够的微阵列分析)实验的可​​重复性是必不可少的。据报道,环境因素,年龄和基板上的差异可以改变的子囊孢子的生物学特性“(Beyer和Verreet,2005年)。因此,使用视频可能突出孢子产生和收集的方式,应有助于可重复性的小细节。特别是视频的过程中应提高实验室间的标准化水平,方便的全基因组转录的研究,需要子囊孢子生产进行比较。实验过程所必需的RNA的量是比较高的,所以应同步处理大量的培养皿。视频是一个特别合适的工具,在必要时实施的整个基因组转录研究新的生物材料,设置一个未来的实验标准

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Acknowledgements

作者感谢卡伦Hilburn优秀的技术支持。这个项目是由美国农业部合作的国家研究,教育和推广服务(#2004-35604-14327奖)的国家研究计划的支持。马蒂亚斯Pasquali支持布兰科魏斯奖学金。美国小麦和大麦赤霉病倡议也承认研究的继续支持。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri dish 9 cm diameter Tool
Tween 60 (20%) Reagent
Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. (2005).
  2. Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. (1999).
  3. Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. (2004).
  4. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
  5. Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. (2000).
  6. Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. 67-1101 (1975).
  7. Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. (1976).

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