La disección de cerebro de los primates no humanos en el espacio estereotáxica

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Los primates no humanos es una importante especie de traslación para nuestra comprensión del proceso normal del cerebro. La organización anatómica del cerebro de los primates puede proporcionar información importante sobre las condiciones normales y patológicas en los seres humanos.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J. Vis. Exp. (29), e1259, doi:10.3791/1259 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

El uso de primates no humanos proporciona un excelente modelo de traslación para nuestra comprensión de los procesos de desarrollo y el envejecimiento en los seres humanos

Protocol

Parte 1: Pre-procesamiento de tejidos

  1. Tejido debe ser buena perfusión con paraformaldehído, glutaraldehído, o formalina. Esto se puede lograr a través de la perfusión estándar transcardial normalmente se utiliza para la cosecha de otros órganos. En el presente estudio el tema fue profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente exsanguinated.This es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro).

Parte 2: estereotáxica bloqueo

  1. Antes de colocar la cabeza en el marco estereotáxico las coordenadas del plano cero Horsley-Clarke/interaural hay que tener. Este es el punto medio teórico entre las orejas. Para medir este plano, las barras del oído deben ser igualmente instalado en el aparato, coloque una hoja de bisturí en el brazo manipulador estereotáxica y medir el punto medio entre las barras de oído. Esto es importante para determinar dónde para bloquear el tejido sobre la base de las necesidades de investigación. Una vez completado el cráneo tiene que estar preparado para la fijación en el aparato estereotáxico.
  2. Con el fin de colocar la cabeza en el marco estereotáxico la mandíbula inferior tendrá que ser removido con pinzas para los huesos y un bisturí. Además de la piel, músculo y tejido conjuntivo debe ser removido para exponer el cráneo. Una vez que el tejido conectivo es extraído del cráneo, exponer el cerebro por socavando la bóveda craneal (la parte de tabla del hueso occipital, así como el parietal, huesos anuncio frontal). En la parte experimento de la bóveda craneal tiene todo listo ha eliminado. Tenga cuidado de no eliminar por completo los huesos temporales, porque los canales del oído tendrá que estar intacto para colocar la cabeza en el marco estereotáxico. El resto de la materia dura debe ser removido desde el cerebro al descubierto. El cráneo está listo para ser colocado en el marco estereotáxico.
  3. De la misma manera en la que se podría realizar una cirugía estereotáxica, ajustar el ojo, el paladar y bares del oído de tal manera que la cabeza esté bien fija en el aparato estereotáxico. Coloque el manipulador estereotáxica en las coordenadas predeterminadas anterior / posterior (A / P) y mover el manipulador de la cara lateral del cerebro. Baje lentamente la hoja en el cerebro, completamente levantar la hoja del cerebro, entonces se mueven en sentido medial e inferior de la hoja de nuevo. Repita estos dos pasos hasta que la hoja se ha llegado a la parte lateral del hemisferio opuesto. Con esto se completa el bloque de la corona en primer lugar. Para su posterior bloques coronal mover el manipulador de 1 cm en el eje A / P y repetir hasta que todo el cerebro ha sido bloqueado.

Parte 3: Extracción del cerebro en el cráneo

  1. Retire el cabezal del marco estereotáxico y mantener el cerebro expuestos en la palma de su mano. Tratar de asegurar el cerebro ligeramente la colocación de mimos en el cerebro en la palma de su mano y coloque el dedo meñique a través de los lóbulos frontales, este movimiento reduce al mínimo del cerebro en el cráneo. A fin de evitar el secado de la superficie pial del cerebro, coloque un trozo de gasa humedecida PBS a través del cerebro. Mantenga la cabeza firme por el cráneo y socavar el resto de los huesos occipital y temporal, junto con la columna vertebral. Esto expone a los aspectos de base y laterales del cerebro. Por último eliminar cualquier resto de hueso frontal y el hueso nasal, lo que permitirá el acceso a los bulbos olfatorios. Es importante quitar el hueso frontal último porque, como se quita la base del cráneo, el cerebro se mueve un poco y los lóbulos frontales se pueden dañar en los bordes irregulares del hueso fontal. Cortar y retirar la restante materia dura. Levante con cuidado la parte frontal del cerebro, deslice el bisturí en el cerebro y el cerebro sin la del cráneo.

Parte 4: Medidas

  1. Hay una serie de medidas útiles que se pueden hacer antes de la congelación. Por ejemplo, el eje A / P del cerebro con un calibrador. Además, la densidad específica puede ser medida por el peso del cerebro, la medición del volumen por el desplazamiento de agua en una probeta dividiendo el peso por el desplazamiento de volumen (Tabla 1).

Parte 5: Termina bloqueo en el cerebro.

  1. Normalmente, cuando la hoja del bisturí se introduce en el cerebro no es lo suficientemente largo para penetrar por completo la totalidad de dorsal-ventral medida del cerebro. Una vez que se remueve el cerebro y las mediciones son brutos obtenidos, tomar un pañuelo de papel, corte la hoja y terminar bloqueando el cerebro a través de la parte ventral del cerebro (Figura 2).
  2. Antes de la congelación de los bloques, es necesario cryoprotect el tejido de graduado soluciones de sacarosa PBS buffer (10, 20, y 30%) se mantiene a 4 ˚ C hasta que se hunde el cerebro. Normalmente se tarda una noche de incubación en el 10%, 2-3 días en el 20% y más de 3-5 días en el 30% de los bloques que se hunden hasta el fondo del recipiente. A cambio diario de the 30% de solución de sacarosa se recomienda.

Parte 6: Resultados de Representante

Hay una serie de graves medidas morfológicas que se puede hacer una vez que el cerebro ha sido extraído del cráneo. Estos incluyen una longitud / P, el peso y la densidad específica (Tabla 1). Por lo general, bloquear el cerebro en 6.7 medición de los bloques de 1 cm (Figura 1). Cada pieza se fotografiaron (Figura 2) y pueden ser más diseccionado en función de las necesidades de investigación o preparados para la congelación de soluciones de sacarosa calificado.


Tema
A Longitud / P
(Mm)
Peso
(Gramos)
Desplazamiento de agua
(Ml)
Densidad específica
(G / ml)
O2303-2-1-1 64.3 28.1 24 1.171
O5180-1 71.3 38.7 34 1.138
O2708-3-1 62.8 28.7 26 1.104
O9184-4-2 65.3 29.5 24 1.229
N459-1-14-2 68.2 31.6 26 1.215
PROMEDIO 66.38 31.32 26.8 1.171
ETS DEV 3.38 4.33 4.17 0.052

Tabla 1. Bruto mediciones morfológicas del hemisferio derecho de 5 meses de edad monos verdes

la figura 1
la figura 1.5
Figura 1. Esquemas de los planos coronal utilizado para bloquear el cerebro. Este es un ejemplo de un cerebro adulto vervet externalizados. Ejemplo del procedimiento de bloqueo. Las líneas verticales aquí están espaciados a 1 cm, por lo general producen siete bloques de la corona de cada hemisferio.

la figura 2
Figura 2. Los bloques de tejido cerebral en el espacio estereotáxico.
Cada bloque se producen aproximadamente 200 secciones tomadas a 50 micras. Con este esquema de muestreo de más de 1200 secciones a través de la corteza será tomado, y un adicional de 400 a 500 del cerebelo en rodajas en el plano coronal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El San Cristóbal mono verde (Chlorocebus aethiops sabeus) es un primate del viejo mundo con patrones similares y las tasas de desarrollo del cerebro cortical y subcortical a la de los seres humanos. Esta especie ha sido utilizada para modelar complejos trastornos de la conducta humana como un comportamiento ansioso, hipertensión 8, 9 hemisferectomía, la enfermedad de Parkinson 10, la enfermedad de Alzhemier de 11, y el abuso del alcohol 12. Más recientemente, esta especie se ha utilizado para estudiar los efectos neuroanatómica de la exposición prenatal al alcohol naturalista. Los monos verdes embarazadas se les permitió beber el equivalente a 3-5 bebidas estándar cuatro veces por semana durante el tercer trimestre, y nos informan de que hay una reducción del 35% de las neuronas en la corteza frontal 13. Los cerebros de este estudio fueron bloqueadas stereotaxically de tal manera que sólo 3 de 7 bloques necesarios para ser seccionados para completar la evaluación estereológicos de la corteza frontal. Esta técnica en particular no se limita al cerebro de los primates no humanos, pero puede extenderse al cerebro de los roedores también. Por ejemplo, si la corteza somatosensorial de la rata es la región de interés, una reducción estereotáxica anterior y posterior a esa región se pueden hacer usando el marco estereotáxico roedores. Esto proporciona una pequeña región de la sección y un plano coronal estándar entre los animales. Es importante tener en cuenta que la hoja debe estar completamente retraído en el cerebro antes de cualquier movimiento medio-lateral se realiza con el manipulador estereotáxica de lo contrario la hoja será innecesariamente dañar el cerebro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Ikiel Ptito por su apoyo técnico continuo. NSERC otorgar a MP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blades Fine Science Tools 10011-00
Scissors Fine Science Tools 14090-11 Any surgical scissors are sufficient
Rongeurs Fine Science Tools 16121-14
Forceps Fine Science Tools 11027-12
Filter paper Fisher Scientific 09-924-150
Stereotaxic Frame Kopf Instruments
Tissue slicing blade Thomas Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gallagher, M., Rapp, P. R. The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48. 339-370 (1997).
  2. Clancy, B., Darlington, R., Finlay, B. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  3. Nowakowski, R. S., Rakic, P. The site of origin and route and rate of migration of neurons to the hippocampal region of the rhesus monkey. J Comp Neurol. 196, 129-154 (1981).
  4. Rakic, P., Bourgeois, J. P., Eckenhoff, M. F., Zecevic, N., Goldman-Rakic, P. S. Concurrent overproduction of synapses in diverse regions of the primate cerebral cortex. Science. 232, 232-235 (1986).
  5. Granger, B., Tekaia, F., Le Sourd, A. M., Rakic, P., Bourgeois, J. P. Tempo of neurogenesis and synaptogenesis in the primate cingulate mesocortex: comparison with the neocortex. J Comp Neurol. 360, 363-376 (1995).
  6. Zecevic, N., Rakic, P. Development of layer I neurons in the primate cerebral cortex. J Neurosci. 21, 5607-5619 (2001).
  7. Ervin, F. R., Palmour, R. M., Young, S. N., Guzman-Flores, C., Juarez, J. Voluntary consumption of beverage alcohol by vervet monkeys: population screening, descriptive behavior and biochemical measures. Pharmacol Biochem Behav. 36, 367-373 (1990).
  8. Palmour, R. M., Mulligan, J., Howbert, J. J., Ervin, F. Of monkeys and men: vervets and the genetics of human-like behaviors. Am J Hum Genet. 61, 481-488 (1997).
  9. Boire, D., Théoret, H., Ptito, M. Stereological evaluation of neurons and glia in the monkey dorsal lateral geniculate nucleus following an early cerebral hemispherectomy. Exp Brain Res. 142, 208-220 (2002).
  10. Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Redmond, D. E. J. r, Elsworth, J. D., Roth, R. H., Cornelius, S. K., Snyder, E. Y., Sladek, J. R. Jr Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 211, 362-369 (2008).
  11. Lemere, C. A., Beierschmitt, A., Iglesias, M., Spooner, E. T., Bloom, J. K., Leverone, J. F., Zheng, J. B., Seabrook, T. J., Louard, D., Li, D., Selkoe, D. J., Palmour, R. M., Ervin, F. R. Alzheimer's disease abeta vaccine reduces central nervous system abeta levels in a non-human primate, the Caribbean vervet. Am J Pathol. 165, 283-297 (2004).
  12. Mash, D. C., Staley, J. K., Doepel, F. M., Young, S. N., Ervin, F. R., Palmour, R. M. Altered dopamine transporter densities in alcohol-preferring vervet monkeys. Neuroreport. 7, 457-462 (1996).
  13. Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics