تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

التقنية اللازمة لوضع الرؤية والقلب النابض في اليرقات وتعليم الكبار

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the Beating Heart in Drosophila. J. Vis. Exp. (31), e1425, doi:10.3791/1425 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

و

Protocol

قبل أن تبدأ

قلوب الكبار

  1. تعد طازجة الدملمف الاصطناعي (ه) محلول يحتوي على 108mM نا + ، 5mM K + ، 2mm وكا 2 + ، 8MM MgCl 2 ، 1MM ناه 2 ص 4 ، 4mM NaHCO 3 ، السكروز 10MM ، طرهالوز 5mm ، و HEPES 5mM (الرقم الهيدروجيني 7.1 ، كل الكواشف من كيماويات سيغما). وينبغي أن يضاف إلى السكروز وطرهالوز الهجري من الحلول الأسهم المبردة فقط قبل استخدامها من أجل منع التلوث الجرثومي.
  2. ه لتحقيق درجة حرارة الغرفة والأوكسجين الحل بواسطة فقاعات في الهواء لا يقل عن 15 دقيقة.
  3. سحب الشعيرات الدموية الدقيقة عدة (مثل الزجاج الشعيرات الدموية ، 100ul ، VWR) المطلوبة لإزالة الدهون.

اليرقات قلوب

  1. Sylgard المغلفة coverslips : استخدام المسواك ، ونقل عن 70μl - 50 من الصعود إلى حل Sylgard ساترة 22x22mm. السماح لتتصلب Sylgard عند 65 درجة مئوية خلال الليل.
  2. إعداد Broadie والعازلة للباتي (135mM كلوريد الصوديوم ، بوكل 5mm ، و 4mM MgCl 2 ، 2mm وCaCl 2 ، TES 5mm ، و السكروز 36mM ؛ الحموضة 7.15 انظر Broadie وباتي ، 1993).
  3. إعداد الأدوات اللازمة لتطبيق histoacryl الغراء. أولا ، سحب الشعيرات الدموية الدقيقة عدة (مثل العلوم منتجات GB100T8P). توصيل الطرف ماصة 1.5ml مع أنابيب بلاستيكية صغيرة (Tygon ، 1 / ​​32 ") وذلك بإضافة أصغر في نهاية الأنبوب. إدراج الشعرية مع فتح على نطاق واسع إلى الطرف الآخر. تحميل الشعرية مع الغراء Histoacryl بواسطة غمس الشعرية في قطرة من الصمغ وطيف الامتصاص في غيض من البلاستيك. عند العمل مع الغراء ينبغي للمرء أن يكون الزجاج second الشعرية في متناول اليد لإزالة الغراء الزائد من غيض من الغراء الشعرية. الصمغ السائل حتى يلامس مخزنة المالحة حيث انها سوف تتصلب في غضون بضع ثوان. ومع ذلك ، فإنه لا يزال عادة من البلاستيك طويلة بما يكفي لإزالتها من طرف الغراء الشعرية أو إلى حين تطبيقه على العينة.

شبه سليمة القلب من ذبابة الفاكهة ذبابة الكبار

  1. الكبار الذباب ذبابة الفاكهة وذبابة تخدير مع قيلولة (كارولينا البيولوجي شركة التموين) لمدة 2-5 دقائق. ويجب الحرص على عدم ترك الذباب يطير في قيلولة لمدة التعرض. ويمكن أيضا التعرض للبرد على المدى القصير يمكن استخدامها لتخدير الذباب ولكن لا ينصح CO 2 كما انها تعد تأثيرات دائمة على معدل ضربات القلب والنظمية.
  2. توضع الذباب تخدير الجانب الظهري أسفل ، في صحن بيتري مغلفة بطبقة رقيقة من الفازلين. إهاب مسعور في الأجنحة والجسم عكسية "العصا" لجيلي ولكن يمكن أن يكون repositioned الذبابة إذا لزم الأمر. هذا يصبح من المهم خصوصا خلال التلاعب اللاحقة.
  3. يتم إجراء خفض الأولية باستخدام زوج المنحني من مقص الربيع (Roboz # 5611). توضع شفرات مقص تحت الساقين وأسفل الزاوية نحو السطح الظهري من الصدر بالقرب من الرقبة. تتم إزالة الرأس والحبل البطني العصب ، والساقين مع خفض واحد. ثم الغارقة في إعداد الدملمف ، الاوكسيجين الاصطناعي (ه) حل.
  4. باستخدام مقص الربيع هو إزالة غيض الخلفي من البطن (يتألف من شرائح البطن 7 و 8) مع خفض واحد. هذا يوفر وصولا لجعل التخفيضات الجانبية على طول حافتي البطن ويعمل على قطع الاتصال بين الوتر الخلفي وبشرة البطن. ثم تتم إزالة رفرف تحررت من بشرة البطن البطني.
  5. في الخطوات 3 و 4 وقطعت الاتصالات الأمامي والخلفي من القناة الهضمية حتى تقام الآن في مكان أعضاء البطن فقط tracheols. ويمكن عادة في الأمعاء وأعضاء أخرى في البطن يمكن إزالة باعتبارهم كتلة واحدة باستخدام الملقط المجوهرات (Roboz ، # 55) ولطيف التجاذبات. إزالة الأحشاء الداخلية يكشف عن أنبوب القلب النابض لا تزال تعلق على بشرة الظهرية محاطا بالجثث الدهون.
  6. الهيئات الدهون غير شفافة تماما في ضوء المجهر بالتالي فإنه غالبا ما يكون ضروريا لإزالة بعض هذه الدهون من أجل أن نرى الأنبوب القلب بشكل واضح. ويتم تحقيق هذا عن طريق شفط الدهون باستخدام تقنية الزجاج مرسوم بدقة الشعيرات الدموية. الشعيرات مصنوعة باستخدام ماصة القياسية مجتذب (مثلا سوتر P - 97 الماصة بولير) ويتم إدراجها بعد ذلك في أنابيب بلاستيكية (Tygon ، 1 / ​​16 ") المرفق مصدر فراغ. ويستخدم هذا النظام لشفط الدهون الزائدة من خارج الأنبوب حول القلب. قوة الشفط يتناسب مع القطر تلميح لذلك ينبغي ألا ماصات مع نصائح أكبر من 40 ميكرون في القطر يتم استخدامها. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب لمس القلب نفسه ، ولأن الجزء الخلفي من القلب لا يزال هشا للغاية وينبغي تجنب المنطقة تماما.
  7. يتعرض الآن للقلب الكبار أنبوب ذبابة الفاكهة ، وينبغي أن يكون الضرب. إذا لزم الأمر يمكن أن يكون repositioned قلب بشرة والتي توليها رفع بلطف إهاب من الفازلين وتدك بعناية أسفل الظهر ، وتجنب مجددا وجود أي اتصال مع أنسجة القلب. في روينبغي أن يكون محل وجهة نظره في حل الاستحمام مع إعداد AHL الطازجة. وينبغي أن يسمح هذا الإعداد للتوازن لمدة 20-30 دقيقة مع الأوكسجين قبل أي تلاعب. وينبغي إذا إعداد أن تستمر لفترة أطول من 60 دقيقة يكون perfused مع AHL الطازجة.

يرقات ذبابة الفاكهة شل حركة لتسجيل البصرية

  1. وضع قطرة من الصمغ Histoacryl على مقربة من كل ركن من أركان coverslips Sylgard. إضافة 50μl من B & B العازلة إلى قطرات الغراء التي من شأنها أن تزيد على الفور. ملء الفراغ بين بقع لصقها مع B & B -- الغراء سيبقي عازلة على الشريحة.
  2. أخذ يتجول يرقة L3 وضعه على قطعة من المناديل الورقية المبللة على الجليد لمدة 2 دقيقة. هذا وسوف تبطئ حركتها. ثم نقل اليرقة إلى العازلة وتوجيهه مع الجانب الظهري حتى (وهذا هو جانب من اليرقة التي تفتقر إلى أحزمة سنينة). بسرعة تطبيق بعض الغراء بين منطقة الرأس وSylgard و. سوف الغراء تتصلب بسرعة كبيرة ، ومنع رئيس اليرقة من التحرك.
  3. باستخدام الملقط انتزاع بعناية من قبل الحيوان spiracles الخلفي وتمتد برفق. إصلاح يرقة في هذا الموقف من خلال تطبيق الغراء على طول جانبي يرقة في النصف الخلفي. للحد من حركة مزيد من إهاب من عضلات جدار الجسم ، وإضافة المزيد من الغراء في جنباته من الحيوان. هو ثابت الآن يرقة في هذا الموقف. يمكن وضعها في ساترة طبق بيتري صغيرة مليئة AHL أو برنامج تلفزيوني. ويمكن الآن أن تسجل دقات القلب دون تدخل من الحركات جدار الجسم.

ممثل النتائج :

وشبه سليمة القلب ذبابة الفاكهة الكبار فاز إيقاعي لعدة ساعات بعد تشريح عند الاحتفاظ بها في ه ، طازجة الاوكسيجين (انظر البيانات إضافي ، Ocorr ، وآخرون ، 2007). ويرد في الفيلم الممثل سبيل المثال 1. قلوب من 3 يرقة الذباب طور مرحلي الثالثة والشباب (1 -- 3 أسابيع eclosion آخر) يحمل عموما ضربات القلب منتظمة في معدلات بين 1 -- 3 هرتز. الذباب مضى عليها أكثر من 3 أسابيع ، عادة ، أكثر عدم اتساق نبضات القلب ، ومع ذلك ، فإن هذه القلوب لا تزال قادرة على ضرب عفويا لساعات في AHL الاوكسيجين. الذباب في قلوب الكبار التي تضررت نتيجة لإجراء تشريح عادة ما تظهر مناطق المترجمة من انقباض المتطرفة التي هي غير قادرة على الاسترخاء. ونادرا ما لاحظت معدلات ضربات القلب أبطأ من 1 هرتز في الذباب الأصغر سنا من 3 أسابيع من العمر ، وبالتالي تعتبر هذه الأعمال التحضيرية للتلف ويتم التخلص منها.

انقر هنا لتحميل الفيلم 1. -- A أسبوع واحد البالغين من العمر wildtype ذبابة (ث سلالة المختبرية 1118) تبين تعرض أنبوب القلب البطن (الأمامية إلى اليسار). علما العادية ، والانقباضات الإيقاعية. مناطق معتمة في الزاوية اليمنى العليا هي ما تبقى من هيئات الدهون في منطقة البطن ؛ الخلايا جولة على جانبي من القلب هي خلايا التامور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد أثبت نموذج ذبابة الفاكهة إلى أن تكون أداة قوية الجينية التي تم استخدامها لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة العلمية التي تتراوح بين التنمية الجنينى على التعلم والذاكرة. وقد تم مؤخرا استخدام هذا النموذج الحي تنوعا للتحقيق في علم الوراثة وظيفة القلب في الطيران. وقد اعتمد عدد من المحاولات لتحديد فسيولوجيا القلب في ذبابة الفاكهة الكبار على الملاحظات التي أبديت في الذباب سليمة من خلال بشرة البطن. وقد اعتمد معظم هذه المناهج على الملاحظة البصرية أو تسجيلات للتغيرات في الارسال شدة الضوء من خلال البطن لتحديد معلمة واحدة ، معدل ضربات القلب. هذه الأساليب العديد من القيود : عادة فقط يمكن ملاحظتها في نهاية الأمامي للقلب ، ولاحظ ما يجري هو حركة الأجسام الدهنية الثانوية للانقباضات القلب ، وإدخال العصبي للقلب سليم. الكبار شبه سليمة إعداد عرضا أكثر تفصيلا لجزء كبير من عمل القلب الكمي التي تسمح لعدد من المعلمات بالإضافة إلى معدل ضربات القلب. ويمكن استخدامه لالكهربية أو الضوئية (انظر المادة إن الرب ، 1435) إجراءات التسجيل. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الإعداد هو مناسبة للتلاعب النسيجي (راجع المقالة إن الرب ، 1435). يمكن أيضا أن يكون استخراجه على عينة أنسجة القلب النظيف نسبيا لPCR ، غرب النشاف ، وتحليل [ميكروأري ، الخ.

قلب الكبار في ذبابة الفاكهة هو ، لأغراض هذا التشريح ، ثابتة ملائم للبشرة الظهرية من البطن بواسطة شبكة من العضلات alary. وبالتالي فمن الممكن بعيدا تشريح الرأس والحبل البطني العصب الكذب ، ومن ثم لإزالة الأعضاء الداخلية دون الإضرار القلب. ومع ذلك ، ينبغي الحذر الشديد أن تؤخذ في الخطوة 3 لخفض سوى غيض جدا من البطن والقلب يمتد إلى الجزء البطن 06/05 وخلية تنظيم ضربات القلب أو خلايا موجودة بلا شك في هذه المنطقة.

ويجب أيضا الحرص على تجنب لمس القلب أثناء تشريح. وينبغي إذا اشتبه اتصال مع القلب يمكن تجاهل الإعداد. شفط معتدلة يكفي عادة لإزالة بعض من الدهون وtracheols التي تحيط القلب لأفضل تصور للأنبوب الشفط ولكن الإفراط في القلب يمكن أن تلحق الضرر أيضا القلب. يتم التحكم في قوة الشفط في المقام الأول حسب حجم رأس ماصة تستخدم لشفط الدهون ، وينبغي تجنب نصائح أكبر من ما يقرب من 40 ميكرون.

على عكس الكبار ، وأنبوب القلب في يرقة ذبابة الفاكهة خالية نسبيا على التحرك تجويف الجسم. وهكذا شبه سليمة إعداد القلب اليرقات صعوبات للتقنيات التسجيل البصري. نظرا لشبه الشفافية في إهاب من الممكن تصور القلب في يرقة سليمة باستخدام brightfield المجهري. تقنية الغراء وصفها هنا يشل أي مرحلة اليرقة التنموية وتحافظ على القلب في وضع ثابت. هذا يسمح بتسجيل أنبوب القلب ثابتة نسبيا. يمكن انقباضات القلب التي سجلتها هذه اليرقة يجمد تحليلها في وقت لاحق من تقنيات التسجيل البصري إن الرب وصفها في 1435.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ويدعم KO عن طريق منحة من جمعية القلب الاميركية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved) Roboz Surgical Instruments Co. RS-5611 Good for gross cuts (Step 3)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight) Roboz Surgical Instruments Co. RS-5620
Dumont #55 forceps Fine Science Tools 11295-51
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11295-10
Glass Capillaries, 100ul VWR international 53432-921
Glass Capillaries, fine Science Products GB100T8P
Pipette Puller Sutter Equipment P-97 Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing Tygon 1/16” inner diameter for 100μl capillaries
Plastic tubing Tygon 1/32” inner diameter for small capillaries
Histoacryl® tissue adhesive B. Braun Medical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
  2. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics