Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض
Chapters
Summary June 4th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
هنا، نقدم بروتوكول للتصور، والكشف، وتحليل وتتبع الاتجار بالحمض النووي الريبي في غرفة البيض الحية Drosophila melanogaster باستخدام منارات الجزيئية، وقرص الغزل المجهرية البؤرية، وتحليل مفتوح المصدر البرمجيات.
Transcript
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا RNA حول آلية ووظيفة تعريب الحمض النووي الريبي المستقطب. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصور في الوقت الحقيقي للاتجار بالرنا الداخلي في الأنسجة الحية. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو العلاج من الأمراض ذات الصلة بالرنا لأنه لديه القدرة على الكشف عن أهداف علاجية جديدة.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في عمليات الحمض النووي الريبي في غرفة بيض ذبابة الفاكهة ، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى مثل في حمار وحشي أو الخلايا الثقافية. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال بسبب التحديات المرتبطة تصميم وتسليم الدعائم منارة الجزيئية. بالنسبة للضنان المجهري للناارة الجزيئية، حدد هدف الزيت 40X وقم بتركيب غطاء مع غرفة البيض التشريحية على مرحلة المجهر.
حدد مكان غرفة البيض في مرحلة التطوير منتصف إلى وقت متأخر التي يتم توجيهها بشكل صحيح للضين الدقيق. ثم اقامة حاقن صغير مع الحقن المناسبة والضغوط التعويض. باستخدام عصا التحكم المتلاعبة الصغيرة ، قم بخفض إبرة محملة برفق بمتجر صغير واحد من محلول المنارة الجزيئي في قطرة الزيت.
جلب تلميح في التركيز نحو محيط مجال الرؤية. قم بإجراء وظيفة نظيفة لإزالة الهواء من طرف الإبرة وضمان تدفق الإبرة من الإبرة وإحضار الإبرة إلى موضع المنزل. التركيز على غرفة البيض أن microinjected وجلب الإبرة مرة أخرى إلى التركيز بالقرب من حافة غرفة البيض.
إجراء تعديل دقيق من موضع ض من الهدف بحيث الغشاء الذي يفصل الخلايا المسامية من الخلايا ممرضة هو في التركيز. أدخل الإبرة في خلية ممرضة لحقن المنارات الجزيئية على مدى فترة من ثانيتين إلى خمس ثوان. لضمان نجاح الحقن المجهري القابل للتكاثر ، ركز بعناية على الغشاء الذي يفصل خلايا الجريب وخلايا الممرضة التي سيتم حقنها أثناء التركيز على طرف الإبرة مع المتلاعب الصغير.
عندما تم حقن جميع منارات الجزيئية، وإزالة بلطف الإبرة والتراجع عنها إلى موقف المنزل. تغيير الهدف إلى التكبير المطلوب للحصول على صورة. ثم التركيز على غرفة البيض تحت الهدف الجديد والبدء في الحصول على صورة.
للكشف عن بقعة من منارات الجزيئية، فتح الصور في J.استخدام صورة تحويل إلى ICY أداة لتحويل الصور مرة أخرى إلى ICY. سيتم تلقائياً تراكب شريط مقياس على المكدس. قم بتحرير شريط المقياس عبر نافذة المفتش حسب الضرورة.
ثم قم بإلغاء تنشيط رمز العين لشريط المقياس تحت علامة تبويب الطبقة لإزالة شريط المقياس من المكدس الأصلي. حدد الكشف والتتبع والكشف عن الكشف عن الموقع، وتأكيد الكشف عن مدخلات التسلسل الحالي والقناة صفر يتم تحديد لمعلمات الإدخال والمعالجة المسبقة على التوالي. بالنسبة للكشف، حدد اكتشاف النقطة المضيئة على خلفية داكنة باستخدام استخدام القوة لأطوال موجية 2D لـ 3D فقط إذا لم يكن هناك ما يكفي من شرائح z في المداخن لإجراء التحليل.
حدد المقاييس والحساسية لكل مقياس إضافة المزيد من المقاييس للبقع الأكبر والتأكد من تعيين منطقة الاهتمام من التسلسل لمنطقة ذات أهمية. للتصفية، تأكد من أنه لم يتم تعيين أي تصفية وحدد تنسيق الملف المناسب ضمن الإخراج. إذا كان من المقرر استخدام نتائج الكشف الموضعي لتحليل التتبع، حدد التصدير إلى حمام السباحة.
لتحليل التكلس، كرر الكشف عن البقعة للقناة الأخرى. لتتبع بقع المنارة الجزيئية، حدد الكشف والتتبع، والتتبع، والتتبع الموضعي، وتشغيل كاشف البقعة باستخدام نفس المعلمات كما بالنسبة للكشف عن البقعة. انقر فوق معلمات تقدير وحدد الحركة المستهدفة المطلوبة في نافذة منبثقة تقدير المعلمات.
ثم انقر فوق تشغيل تتبع. لتصور المسارات، حدد الكشف عن وتعقب، وتتبع، وتتبع، ومدير المسار. بالنسبة لمعالج المسارات الملونة، حدد تمكين وحدد لونًا للمسارات.
من إضافة معالج المسار، حدد المسار المسار المعالج مقطع الوقت. في إطار clipper الاختيار، أدخل عدد عمليات الكشف التي سيتم إظهارها قبل وبعد نقطة الوقت الحالية. احفظ معلومات المسار كملف مسار XML واستخدم رمز الكاميرا للحصول على لقطة شاشة للنتائج.
لعرض المكدس على طول الاتجاه ي، استخدم شريط البحث للعثور على البرنامج المساعد وحدد الإسقاط الأقصى من القائمة المنسدلة. في نافذة المفتش، حدد علامة تبويب التسلسل، ولوحات القماش، والتدوير لضبط الصورة حسب الاتجاه المطلوب والحصول على لقطة شاشة للصورة المتناوبة. ثم حدد منطقة الاهتمام ، منطقة 2D من الفائدة ، واختيار منطقة من الشكل الفائدة ، وحدد المنطقة ذات الاهتمام على الصورة لاقتصاص.
تثبيت البرنامج المساعد تراكب الطابع الزمني وإضافة الطابع الزمني التالية الإرشادات في النافذة المنبثقة للحصول على الاتجاهات حول كيفية وضع وتنسيق الطابع الزمني. لتغيير الفاصل الزمني أو إضافته، انقر فوق تحرير في إطار خصائص التسلسل. قم بتنشيط أيقونة العين لإضافة شريط المقياس مرة أخرى أسفل علامة تبويب الطبقة في نافذة المفتش.
ثم الحصول على لقطة من النتائج المُستَدَنّة من وقت، واحفظ الصورة في كل من تنسيقات TIFF و AVI. وباستخدام هذه الطريقة كما هو موضح، يمكن تصور أنماط النقل والتوطين في الـ MRNAs الذاتية عن طريق المنارات الجزيئية في مراحل مختلفة من تكوين الخلايا التناسلية، ولا سيما عند منتصف تولد الخلايا العصبية وبعده. عندما حقن بشكل فردي في غرف البيض المرحلة نفسها، ومختلف منارات جزيئية محددة oskar تقديم نفس النمط من التعريب.
المنارات الجزيئية حقن في سيتوبلاسم من خلية ممرضة سوف تنتشر بحرية في خلايا ممرضة المجاورة وكذلك في البويض. وهكذا، فإن المنارات قادرة على التهجين مع أهدافها وتوليد إشارات الفلورنس في مواقع أخرى غير موقع الحقن المجهري. في غرف البيض المعدلة وراثياً في منتصف تكوين الخلايا التناسلية، يظهر تحليل بيانات الاستحواذ تحللًا واسع النطاق لإشارة الفلوريسنس لـ GFP الموسومة وراثياً بعلامة أوسكار ميرنا مع إشارة الفلورسي التي تم اكتشافها باستخدام منارات جزيئية.
وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل مداخن 5D لتحديد مسارات ناسكا MRNA للنقل لمسافات طويلة في كل من خلية ممرضة وبويضة السيتوبلاسم. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي لاستكشاف نقل الأمهات والأمهات والأمهات المحلية في غرفة البيض Drosophila.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
