इसके साथ ही वायरस विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं और वायरस से संक्रमित कोशिकाओं कल्पना के लिए एक तकनीक स्वस्थानी में

Biology
 

Summary

सीटू tetramer धुंधला में और स्वस्थानी संकरण (ISTH) में संयोजन तकनीक वायरस विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं उनके वायरस से संक्रमित लक्ष्य को स्थानिक निकटता के दृश्य, मानचित्रण और विश्लेषण, और इन प्रतिरक्षा effectors और लक्ष्यों के बीच मात्रात्मक संबंधों का निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है संक्रमण परिणामों के लिए.

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Li, Q., J. Skinner, P., Duan, L., Haase, A. T. A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ. J. Vis. Exp. (30), e1561, doi:10.3791/1561 (2009).

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Abstract

की संख्या और स्थानों वायरस विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं और उनके संक्रमित कोशिका लक्ष्य की संख्या और स्थानों के लिए रिश्तेदार परिणामों मंजूरी से पुरानी लगातार संक्रमण के लिए है कि सीमा का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण माना जाता है. हम यहाँ प्रतिरक्षा effector (ई) वायरस के विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं और संक्रमित लक्ष्य (टी) है कि सीटू tetramer धुंधला (आईएसटी) में जोड़ती करने के लिए वायरस विशेष + CD8 टी कोशिकाओं का पता लगाने में सीटू के बीच स्थानिक और मात्रात्मक संबंधों का आकलन करने के लिए विधि का वर्णन संकरण (ISH) ऊतकों जहां प्रतिरक्षा सुरक्षा साधनों और संक्रमण के बीच लड़ाई की जगह लेता में वायरल शाही सेना + कोशिकाओं का पता लगाने. टी अनुपात के संयोजन IST धुंधला हो जाना और ISH, संक्षिप्त ISTH, दृश्य और effector प्रतिरक्षा कोशिकाओं और लक्ष्यों, और ई के सतही दृढ़ संकल्प के स्थानों के मानचित्रण के लिए सक्षम बनाता है. बारी में इन मानकों तो स्थानिक निकटता के बीच संबंधों को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और समय और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि जल्दी संक्रमण में परिणाम की भविष्यवाणी के परिमाण.

Protocol

इस विधि में रिपोर्ट अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया था ली एट अल, विज्ञान 323, 1726-1729 (2009) .

सीटू tetramer धुंधला में और स्वस्थानी संकरण प्रक्रियाओं (ISTH) में संयुक्त

ISTH प्रक्रियाओं 4 कदम में विभाजित किया जा सकता है: 1) CD8 प्रतिजन विशेष के IST धुंधला + ऊतकों में टी कोशिकाओं, 2) वायरस के संक्रमित-शाही सेना + कोशिकाओं का पता लगाने ISH; 3) hrs IST, के दाग कोशिकाओं और वायरल - शाही सेना के confocal सूक्ष्म इमेजिंग + कोशिकाओं, 4) छवि montages के निर्माण और tetramer + और वायरस + शाही सेना कोशिकाओं के मानचित्रण सहित छवि विश्लेषण,.

1. CD8 विशिष्ट प्रतिजन की IST धुंधला हो जाना + टी कोशिकाओं ऊतक वर्गों में.

  1. 200 उम मोटी एक vibratome या स्केलपेल का उपयोग कर वर्गों में कट ताजा ऊतकों.
  2. चिल बाँझ पीबीएस - एच के साथ vibratome स्नान और 0-2 करने के लिए ठंड डिग्री सेल्सियस बल्कि एक खड़ी 27 ° vibratome ब्लेड कोण सेट. जब भी संभव हो, ऊतकों बर्फ पर ठंडा क्रम में गिरावट को कम से कम रखना. ताजा ऊतक भी है अनुभाग एक vibratome का उपयोग कर जब यह ठंडा है करने के लिए आसान है.
  3. शल्य कैंची या 0.25 सेमी लंबा टुकड़े छोटे लगभग 0.5cm विस्तृत में स्केलपेल के साथ ऊतक कट. एक नाव वजन या छोटे पकवान में ऊतक के टुकड़े रखो और ~ 40 के साथ कवर ° सी पिघल 4% पीबीएस agarose पिघल कम buffered. सुनिश्चित करें कि ऊतक पकवान के नीचे के साथ संपर्क में है. ऊतक टुकड़े नीचे पुश अगर वे नाव. बर्फ पर जमना. यह आमतौर पर 3-5 मिनट लगते हैं.
  4. लॉकटाइट गोंद के साथ कोट vibratome ऊतक ब्लॉक. ऊतक के आसपास के साथ एक स्केलपेल, और फिर एक संदंश का उपयोग agarose कट, ध्यान से एक vibratome ब्लॉक गोंद में लेपित नाजुक ऊतक एम्बेडेड agarose हस्तांतरण. ऊतक का टुकड़ा कदम एक बार यह ऊतक खंड पर सेट है मत करो. चलो सूखी बर्फ पर लगभग 10 मिनट.
  5. माउंट vibratome में ऊतक ब्लॉक और 200um मोटी वर्गों में एक मरा हुआ धीमी गति से आगे गति और अपेक्षाकृत उच्च आयाम का उपयोग ऊतक में कटौती. गति और आयाम सेटिंग्स प्रत्येक vibratome के साथ बदलती हैं. यदि vibratome उपलब्ध नहीं है, या ऊतक सेक्शनिंग vibratome उत्तरदायी नहीं है, पतली स्ट्रिप्स में एक स्केलपेल का उपयोग ऊतकों में कटौती.
  6. 24 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति ठंडा पीबीएस - एच 1 मिलीलीटर युक्त थाली का अच्छी तरह से में स्थापित एक ऊतक के चेंबर में एक तूलिका के साथ वर्गों का स्थानांतरण. प्रत्येक ऊतक चेंबर में चार ऊतक वर्गों के लिए रखो. लेबल प्रयोगात्मक नमूना जानकारी और एक रबर बैंड के साथ थाली करने के लिए सुरक्षित ढक्कन के साथ टिशू कल्चर की थाली के ढक्कन.
  7. वैकल्पिक रूप से, ऊतकों कि अच्छी तरह से vibratome साथ में कटौती नहीं है के लिए, पेट की तरह, स्केलपेल या रेजर ब्लेड के साथ संभव स्ट्रिप्स के रूप में पतली के रूप में कटौती कर सकते हैं. स्केलपेल कट वर्गों के लिए अच्छी तरह से प्रति केवल एक अनुभाग रखो.
  8. काटने के ऊतकों समाप्त के तुरंत बाद धुंधला हो जाना करने के लिए आगे बढ़ें. सभी समय पर गिरावट कम से कम जब तक तय करने के लिए ठंडा वर्गों रखें. चलो वर्गों बाहर सूखी मत. ठंडा बाँझ पीबीएस - एच में वर्गों रखें.
  9. रात से अधिक 0.5 मिलीग्राम / एमएल FITC संयुग्मित tetramers के साथ ऊतक वर्गों सेते हैं. माउस या गैर खरगोश इस ऊष्मायन में कोशिकी epitopes, जैसे विरोधी CD8 एंटीबॉडी, समाधान को रोकने में 1:200 पतला में निर्देशित एंटीबॉडी शामिल कर सकते हैं. इस और बाद के सभी incubations के लिए एक अच्छी तरह से प्रति मिलीलीटर समाधान का प्रयोग करें, और यह और 4 पर सभी बाद incubations ° सी प्लेटों के साथ एक कमाल मंच पर प्रदर्शन. विभिन्न प्रयोगात्मक अच्छी तरह से बाद के चरणों में समाधान के पार संदूषण को रोकने के लिए कम से कम एक खाली द्वारा अलग नमूने युक्त ऊतक कक्षों रखें.
  10. प्राथमिक ऊष्मायन के बाद, ठंडा पीबीएस एच दो बार (2X) के साथ 20 मिनट के लिए वर्गों धोने. 24 अच्छी तरह से एक अलग ऊतक संस्कृति ठंडा पीबीएस - एच युक्त प्लेट के ऊतक कक्षों के हस्तांतरण के द्वारा इस करो. एक प्रयोगात्मक नमूना से दूसरे में सामग्री नहीं ड्रिप सावधान रहो, जब ऊतक कक्षों चलती. बाद के सभी incubations और washes के लिए इसी तरह एक स्वच्छ थाली करने के लिए उचित समाधान युक्त ऊतक कक्षों हस्तांतरण. ऊतक कक्षों में प्रक्रिया के दौरान वर्गों को मॉनिटर करने के लिए यकीन है कि वर्गों ऊतक कक्षों के पक्ष नहीं अटक मत हो.
  11. ताजा पीबीएस के साथ फिक्स वर्गों कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde buffered. ठंड 2X पीबीएस एच 5 मिनट प्रत्येक के साथ धोएं.
  12. एक से तीन दिन के लिए समाधान को रोकने में 10,000: खरगोश विरोधी FITC एंटीबॉडी, Biodesign1 जैसे के साथ सेते हैं. सह लेबलिंग के लिए, गैर - खरगोश इस ऊष्मायन में epitopes पर intracellular के रूप में अच्छी तरह से निर्देशित एंटीबॉडी शामिल कर सकते हैं. इस विकल्प के लिए, epitopes बेनकाब अगर जरूरत है और चूना और कोशिकाओं को ब्लॉक करने से पहले दूसरा ऊष्मायन.
  13. यदि का उपयोग एंटीबॉडी intracellular epitopes कि formaldehyde के निर्धारण से प्रतिजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता पर निर्देशित, एक माइक्रोवेव ओवन में 0.01M यूरिया में उबलते 3 बार, 10 सेकंड हर बार द्वारा epitopes, बेनकाब. प्रत्येक हीटिंग के बीच 2 मिनट रुको. बहुत सावधान के रूप में उबलते समाधान वर्गों कुओं से बाहर मजबूर कर सकते हैं. यदि ऐसा होता है, एक पेंट ब्रश का उपयोग करेंऊतक चैम्बर की तरफ से वर्गों को पुश करने के लिए या उचित ऊतक चैम्बर के तल में वापस थाली के ढक्कन से. यदि एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है प्रतिजन पुनर्प्राप्ति इस कदम को छोड़ देते हैं.
  14. यदि epitopes पर intracellular निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करने से पहले दूसरा ऊष्मायन, permeabolize, और ऊतक वर्गों में पीबीएस - एच 0.3% Triton एक्स 100, और 2% सामान्य बकरी सीरम युक्त एक घंटे के लिए के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक. फिर शेष पीबीएस - एच में एंटीबॉडी incubations 0.3% TRITON X-100 और 2% सामान्य बकरी सीरम युक्त प्रदर्शन.
  15. दूसरा ऊष्मायन के बाद, पीबीएस - एच में कई घंटे के लिए 20 मिनट के लिए वर्गों धोने. तीन washes के एक कुल के लिए दो बार दोहराएँ. उपयुक्त fluorescently लेबल एंटीबॉडी के साथ एक अंतिम ऊष्मायन प्रदर्शन. उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी खरगोश Cy3 और बकरी 488 विरोधी माउस Alexa अवरुद्ध समाधान में प्रत्येक 1:1000 पतला. एक से तीन दिनों के लिए सेते हैं. वर्गों टिन पत्र में इस ऊष्मायन के दौरान प्लेटें और लपेटन उसके बाद प्रकाश quenches fluorophores के रूप में, प्रकाश से सुरक्षित रखें.
  16. पीबीएस - एच में कई घंटे के लिए 20 मिनट के लिए वर्गों का धो लें. तीन washes के एक कुल के लिए दो बार दोहराएँ.
  17. ISH बाद तय के बाद 1 घंटे के लिए सुरक्षित जगह में tetramers और एंटीबॉडी के लिए 4% paraformaldehyde में तय अनुभागों के साथ संयुक्त IST, तो पीबीएस - एच के साथ वर्गों को फिर से कुल्ला और माउंट.
  18. एक तूलिका का प्रयोग एक खुर्दबीन स्लाइड के लिए वर्गों को हस्तांतरण. कोट ग्लिसरॉल / जिलेटिन युक्त 4mg/ml n - propyl gallate या अन्य बढ़ते coverslip के साथ एक fluorophore परिरक्षक और कवर युक्त मीडिया के साथ प्रत्येक अनुभाग. -20 डिग्री पर प्रकाश संरक्षित स्लाइड कंटेनर में स्टोर स्लाइड. टिशू कल्चर प्लेटें कुल्ला और शराब के साथ lids पर लेबल हटा. प्लेटों का पुन: उपयोग कर सकते हैं.
  19. एक confocal खुर्दबीन के साथ दाग ऊतक वर्गों का विश्लेषण. फिर ISH आगे बढ़ सकते हैं.

2. स्वस्थानी संकरण में वायरस से संक्रमित शाही सेना + कोशिकाओं का पता लगाने.

स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में यह हमारे पहले प्रकाशित निम्नानुसार 4,5 प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था:

  1. पुन कटौती से सीटू tetramer दाग वर्गों में मोटी 5 8 माइक्रोन मोटी sectionss.
    1. 200 माइक्रोन मोटी वर्गों 70 में गरम कर रहे हैं अनुभाग डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए स्लाइड से अलग करने के लिए.
    2. अनुभाग तो सूखी बर्फ पर अक्टूबर में एम्बेडेड है.
    3. 8 माइक्रोन वर्गों cryostat के साथ मोटी वर्गों से काट रहे हैं और silanized स्लाइड्स के लिए पालन.
    4. स्वस्थानी संकरण में -80 डिग्री सेल्सियस बाद के लिए एक मोहरबंद बॉक्स में स्लाइड्स संग्रहीत किया जा सकता है.
  2. स्वस्थानी संकरण में
    1. 90% इथेनॉल और DEPC पानी का इलाज में 3 मिनट प्रत्येक के लिए स्लाइड्स को डुबो कर ऊतक वर्गों rehydrate.
    2. हीटिंग द्वारा ऊतक वर्गों 10mm साइट्रेट बफर (6.0 पीएच) में 15 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में Permeabilize 98 पर.
    3. 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्म, सेक्सी ऊतक वर्गों.
    4. DEPC इलाज पानी में 3 मिनट के लिए दो बार धोएं.
    5. 0.25% 0.1 एम चाय (triethanolamine, pH8.0) में 10 मिनट के लिए एसिटिक एनहाइड्राइड में स्लाइड्स डुबो से ऊतक अनुभाग Acetylate.
    6. 0.1 एम चाय (pH8.0) में 5 मिनट के लिए स्लाइड्स का स्थानांतरण.
    7. वर्गों 35 एस लेबल वायरस विशेष (जैसे एचआईवी -1, SIV) antisense जांच या भावना (एचआईवी -1 के लिए नकारात्मक नियंत्रण, SIV), या 35 एस लेबल LCMV riboprobes (जमा भावना और antisense). संकरण
    8. वर्गों दो बार 2xSSC के साथ 42 पर धो रातोंरात संकरण के बाद 5 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस
    9. 5 मिनट के लिए Ste में अनुभागों (0.5 एम NaCl, 1mm EDTA, 20 Tris - एचसीएल मिमी, 7.5 पीएच) धो लें.
    10. 30 मिनट के लिए 37 पर एक और Ste में T1 RNases ° सी के साथ वर्गों का डाइजेस्ट
    11. 2x एसएससी में वर्गों से अधिक 5 मिनट के लिए 50% formamide धो लें.
    12. 1x एसएससी 10 मिनट में वर्गों धो लें.
    13. 0.5 x एसएससी 15 मिनट में वर्गों धो लें.
    14. निर्जलीकरण में 70 वर्गों, 80 और 100% इथेनॉल युक्त 0.3 एम अमोनियम एसीटेट, प्रत्येक 5 मिनट.
    15. परमाणु ट्रैक पायसन के साथ कोट वर्गों
    16. 1 घंटे के लिए एक अंधेरे कमरे में सूखी.
    17. 4 में वर्गों बेनकाब डिग्री सेल्सियस 11 (SIV) दिन और 3 दिन (LCMV) के लिए.
    18. वर्गों D19 में 3 मिनट के लिए विकास (कोडक, बिल्ली 4593 # 146), dH2O 30 सेकंड में धोने, रैपिड फिक्सर में 4 मिनट के लिए ठीक (कोडक, बिल्ली 4106 # 146), dH2O 5 मिनट x 3 बार में धो लो.
    19. 70%, 80% और निरपेक्ष इथेनॉल, 5 मिनट प्रत्येक में निर्जलीकरण.
    20. फ्लोरोसेंट संगत Permount मध्यम में माउंट स्लाइड्स.

3. Confocal खुर्दबीन छवियों मोल.

  1. एक जैव - रेड MRC 1000 confocal खुर्दबीन, या Epi2 ब्लू परावर्तन डिवाइस के साथ किसी भी अन्य confocal खुर्दबीन के साथ ISTH छवियों कैद करो.
  2. लाल tetramer, fluorochrome Epi2-522 के लिए हरी CD8 fluorochrome DF32, और चांदी अनाज के लिए परावर्तन Epi2 ब्लू (विकसित radioautographs में ISH संकेत) 20x पर (SIV के लिए) या 60x के लिए Epi1-605 का उपयोग करें (LCMV के लिए)
  3. क्रमिक रूप से प्रत्येक क्षेत्र के तीन चैनलों में 1 माइक्रोन अंतराल पर जेड धारावाहिक छवियों को इकट्ठा.
  4. बाएँ से प्रत्येक अनुभाग से छवियों का मोलठीक है, और ऊपर से नीचे, और नाम प्रत्येक छवि और एक Excel फ़ाइल में पंक्ति और स्तंभ के अनुसार.
  5. अपने पड़ोसी छवियों के साथ एक ~ 20% ओवरलैप के साथ एक छवि पर कब्जा खंगाला असेंबल छवि में अंतराल से बचने के.

4. छवि विश्लेषण: असेंबल छवि पुनर्निर्माण, सेल केन्द्रक गणना और स्थानिक विश्लेषण.

  1. परियोजना Confocal सहायक (संस्करण 4.02) के साथ प्रत्येक चैनल के लिए एक एकल छवि में जेड धारावाहिक छवियों.
  2. तीन चैनलों से स्वचालित रूप से एक आरजीबी छवि में अनुमानित छवि मर्ज Photoshop 7.0 लड़ाई प्रक्रिया का उपयोग कर.
  3. मर्ज किए गए छवियों Photoshop 7.0 में परतों में एक साथ सिलाई के द्वारा एक असेंबल छवि को उत्पन्न करता है.
  4. एसोसिएट व्यक्तिगत चांदी अनाज और tetramer कोशिकाओं के साथ दाग, और असाइन एक्स, वाई SIV के शाही सेना + और tetramer + कोशिकाओं के केंद्र (centroids) के निर्देशांक, MetaMorph (संस्करण 7.1.3) या फ़ोटोशॉप (लेखक की ओर से उपलब्ध है) का उपयोग
  5. प्रत्येक कक्ष के लिए संख्यात्मक संख्या के रूप में Excel फ़ाइलों में केन्द्रक डेटा निर्यात करें. ई: टी अनुपात tetramer की कुल संख्या + और अनुभाग में वायरल शाही सेना + कोशिकाओं से Excel फ़ाइलों से निर्धारित कर रहे हैं.

- लाल tetramer + और नीले रंग के SIV के शाही सेना के बीच स्थानिक रिश्तों + कोशिकाओं प्रतिलिपि बनाकर और चिपकाकर एक Photoshop दस्तावेज़ में Excel फ़ाइलों से उनके संबंधित भूखंडों द्वारा कब्जा कर रहे हैं. संरेखित करें और ग्रिड पैमाने पर इतना है कि वे मेल खाना, रंग का चयन और नकल और एक नई परत नीले शाही सेना + कोशिकाओं की स्थिति में चिपकाने परत की अस्पष्टता, और तब discarding परत ग्रिड को संरेखित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, पदों को कम करने के बाद tetramer + और वायरल शाही सेना के + कोशिकाओं चपटे छवि में पता चल जाएगा.

5. अतिरिक्त नोट्स

संक्रामक ऊतक काटने यदि:

एक BSL2.5 प्रयोगशाला में कार्य. रेज़र ब्लेड के साथ विशेष सावधानियों ले लो. Vibratome ब्लेड माउंट में एक संदंश के साथ उस्तरा रखो. यदि आप एक संदंश के साथ ब्लेड नहीं डाल सकते हैं, तो यह डाल में स्नान करने के लिए ऊतक जोड़ने के लिए पहले, और ब्लेड की जगह नहीं है. जब समाप्त काटने, एक संदंश के साथ ब्लेड हटाने. 70% EtOH या DMQ के साथ स्प्रे को हटाने के लिए पहले ब्लेड. हमेशा की तरह, एक sharps कंटेनर में ब्लेड के निपटान. बाहरी दस्ताने बदलें या ऊतक या टैंक में दूषित पीबीएस के साथ प्रत्येक संपर्क के बाद निस्संक्रामक में कुल्ला. जब समाप्त हो, यदि संक्रामक सामग्री के साथ काम, Pbs के लिए टैंक में DMQ निस्संक्रामक और जोड़ने के दो मिनट के एक जोड़े को हटाने के लिए पहले बैठने के. नाली नीचे decontaminated पीबीएस को फेंक. फिर पानी के साथ टैंक कुल्ला करने के लिए नमक और निस्संक्रामक हटाने के लिए. स्वच्छ और DMQ साथ कार्यस्थान बर्तन. कुल्ला पानी के साथ बर्तन.

Biotinylated MHC monomers से tetramers करें:

Biotinylated MHC वर्ग मैं इस तरह के रूप में अणुओं प्राप्त एचएलए * 0,201 / बी 2 मीटर / पेप्टाइड अणुओं या तो (SLYNTVATL) चुप, पोल ILKEPVHGV (), या अप्रासंगिक Beckman कल्टर से मार्ट पेप्टाइड (ELAGIGILTV) पेप्टाइड्स के साथ उत्पादन . Biotinylated एचएलए * 0301 / 2 बी मीटर / पेप्टाइड अणुओं या तो (KIRLRPGGK) चुप या NIAID tetramer सुविधा पर NEF (QVPLRPMTYK) के साथ उत्पादन किया जाता है. Tetramers FITC के 6 aliquots लेबल जोड़ने के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं biotinylated मामू ExtraAvidin (सिग्मा) * 01 / बी 2 मीटर / 4.5:1 के एक अंतिम दाढ़ अनुपात करने के लिए 8 घंटे के कोर्स पर पेप्टाइड monomers. Extravidin जोड़ने के पीछे तर्क धीरे है कि जल्दी समय अंक के दौरान monomer के एक बहुतायत है जो भरोसा दिलाते हैं कि Extravidin के सभी सभी चार बायोटिन साइटों बाध्य हो जाता है कहा है. प्रतिक्रिया में बाद में, इस प्रक्रिया को कम कुशल है क्योंकि वहाँ कम monomer छोड़ दिया और एक मौका है कि ExtrAvidin सभी 4 साइटों बाध्य नहीं होगा और अधिक है. यदि एक ही बार में ExtrAvidin के सभी जोड़ी प्रतिक्रिया कम कुशल हो और अधिक Extravidin अणुओं केवल 2 या 3 monomers संलग्न करना होगा.

Discussion

चूंकि वायरस आरएनए रिपोर्ट में इस वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है, संकरण से पहले सभी अभिकर्मकों RNAase मुक्त होना चाहिए. स्वस्थानी संकरण प्रक्रिया यहाँ वर्णित में सीटू tetramer धुंधला में से फ्लोरोसेंट संकेत बनाए रखने के संशोधित किया गया है. स्वस्थानी संकरण द्वारा पता लगाया वायरस संक्रमित कोशिकाओं से radioautographic संकेत के बाद से एक सेल व्यास के बारे में गहराई में है, के लिए इस्तेमाल किया सीटू tetramer धुंधला में मोटी वर्गों को 5 8 माइक्रोन मोटी वर्गों में recut है.

सीटू tetramers में और स्वस्थानी संकरण (ISTH) में संयोजन के इस उपन्यास तकनीक यहाँ वर्णित एक साथ दृश्य, मानचित्रण वायरस विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं और वायरस से संक्रमित लक्ष्य कोशिकाओं स्थानिक संबंधों के और विश्लेषण में सक्षम बनाता है. इस विधि CD8 + टी सेल आधारित टीके का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है और अन्य गैर - वायरस रोगज़नक़ और मेजबान बातचीत में. छवि विश्लेषण विधि यहाँ वर्णित भी किसी भी दो सेल बगल में बातचीत आबादी के स्थानिक रिश्तों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है उदाहरण के लिए, हम हाल ही में बंदर प्रतिरक्षा की कमी के nonhuman रहनुमा मॉडल में एचआईवी-1 यौन संचरण के अध्ययन में केन्द्रक मानचित्रण प्रक्रिया का इस्तेमाल किया रीसस के वायरस के संक्रमण 6 मकाक

Acknowledgements

हम चांदी अनाज की छवियों पर कब्जा confocal खुर्दबीन सेटिंग में सहायता के लिए जे Sedgewick धन्यवाद, अनुसंधान संसाधन के अनुदान के लिए राष्ट्रीय केन्द्र, NIH अनुसंधान AI48484 अनुदान (ATH) AI20048 (आरए), और AI066314 (CJM) द्वारा भाग में समर्थित है. RR00169 (CNPRC, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस).

Materials

Solutions and Reagents:

  • PBS-H Phosphate buffered saline containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes
  • RPMI tissue culture media containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes
  • 4% low melt agarose in PBS
  • PBS with 2% normal goat serum (or serum from species in which the fluorophore conjugated antibodies were made).
  • PBS with 2% normal goat serum and 0.3% triton X-100
  • MHC class I tetramers conjugated to FITC
  • Anti-FITC antibodies, e.g. BioDesign rabbit anti-FITC
  • Fluorophore conjugated anti-rabbit IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling, e.g. goat-anti-rabbit-Cy3
  • Fluorophore conjugated anti-mouse IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling
  • Fresh PBS buffered 4% paraformaldehyde
  • 0.01M Urea
  • Glycerol/gelatin containing 4mg/ml n-propyl gallate

Special equipment

  • Vibratome
  • Scalpel
  • Razor blades
  • Surgical scissors
  • Loctite Quick Set Instant Adhesive (product # 46551)
  • Forceps
  • #2 camel hair paint brushes. Can trim with razor blade to desired thickness
  • 24-well flat bottomed tissue culture plates e.g. Falcon catalog #353226
  • Tissue chambers
  • Tin foil
  • Cardboard slide folder e.g. Fisher catalog#12-587-10
  • Confocal Microscope

IST Reagents Quick Reference

PBS-H (phosphate buffered saline with heparin)

  • 450 ml 1X PBS
  • 50 ml 1X PBS + 10X heparin

1x PBS + 10X heparin

  • 500 ml 1X PBS
  • 500 mg heparin powder (found on dry chemical storage shelf)

PBS-H/ 2% NGS (normal goat serum)

  • 49 ml PBS-H in Falcon tube
  • 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 2% NGS/ 0.3% Triton X-100

  • 49 ml PBS-H/ 0.3% Triton X-100 in Falcon tube
  • 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 0.3% Triton X-100

  • 500 ml PBS-H
  • 1.5 ml Triton X-100 (this is a thick liquid found on dry chemical storage shelves)

4% LMP Agarose

  • 2 g LMP agarose powder
  • 50 ml PBS
  • Shake until mixed, microwave until powder dissolves.

GG-NPG (glycerol gelatin with n-propyl galate

  • Place a bottle of glycerol gelatin in 50 degree water bath to melt
  • Add 0.06 g of propyl galate (found on Terri's shelf), shake well
  • Keep in water bath, shaking occasionally until dissolved.
  • Aliquot into 1 ml tubes (brown tubes)

4% paraformaldehyde

  • 4 g paraformaldehyde powder (found on dry chemical storage shelves)
  • Put about 10 ml PBS-H in a graduated cylinder, add pf powder
  • Add some water until volume reaches about 70 ml
  • Add one dropper of NaOH.
  • Stir until dissolved (usually about 20-30 minutes)
  • Add HCl until pH reaches between 7-8.
  • Bring volume to 100 ml with water.

Urea 0.01 M

  • 0.3 g urea (found on dry chemical storage shelves)
  • 500 ml water

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References

  1. Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  2. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).
  3. Qingsheng, L. i, Skinner, P. J., Ha, S. -J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2008).
  4. Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue. Science. 274, 985-989 (1996).
  5. Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells. Nature. 434, 1148-1152 (2005).
  6. Li, Q. ingsheng, Estes, J. acobD., Schlievert, P. atrickM., Duan, L. ijie, Brosnahan, A. mandaJ., Southern, P. eterJ., Reilly, C. avanS., Peterson, M. arnieL., Schultz-Darken, N. ancy, Brunner, K. evinG., Nephew, K. arlaR., Pambuccian, S. tefan, Lifson, J. effreyD., &, J. ohnV. C. arlis, Haase, A. shleyT. Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission. Nature. (2009).

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