Dissecção de 6,5 embriões de camundongos dpc

Biology

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Summary

Isolamento de pós-implantação de embriões em estágio permite uma padronização para estudar e analisar genes de células de linhagem processos de decisão durante o desenvolvimento embrionário, mas dissecção adequada do embrião em estágio inicial pode ser um desafio. Este protocolo descreve um método para isolar muito primitiva raia-estágio-embriões (~ 6,5 dias pós coitum [dpc]).

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Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

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Abstract

Análise dos padrões de expressão genética durante as fases iniciais do desenvolvimento embrionário de mamíferos pode fornecer pistas importantes sobre a interação gene função, célula-célula e mecanismos de sinalização que patterning guia embrionárias. No entanto, a dissecção do embrião de rato a partir da decídua, pouco após o implante pode ser um processo desafiador, e documentação passo-a-passo detalhado desse processo é inexistente.

Aqui demonstramos como pós-implantação (6,5 dpc) embriões são isolados pela primeira dissecando o útero de um rato grávidas (detecção do plug vaginal foi designado coitum poist dias 0,5) e, posteriormente, dissecando o embrião da decídua materna. A dissecção da membrana Reichert é descrito, bem como a remoção do cone ectoplacental.

Protocol

Dissecação de órgãos reprodutivos de uma fêmea

  1. As fêmeas grávidas são sacrificados por asfixia CO 2, utilizando gás comprimido.
  2. Coloque o animal em decúbito dorsal almofada absorvente e mergulhe-o em etanol 70% para reduzir o risco de contaminação a dissecção com cabelo mouse.
  3. Aperte a pele e fazer uma pequena incisão lateral na linha média com tesouras cirúrgicas regulares. Segure a pele firmemente acima e abaixo da incisão e puxar a pele para além em direção à cabeça e cauda para expor o abdômen.
  4. Segure o peritônio com uma pinça e corte para expor a cavidade abdominal.
  5. Localize os órgãos reprodutivos na região dorsal da cavidade do corpo: dois cornos uterinos, o oviduto e os ovários.

Primitive Streak estágio Dissection (6,5 dpc)

  1. Remover o corno uterino, segurando o útero abaixo do oviduto e cortá-la livre ao longo da mesométrio. Lugar útero dissecado em PBS gelado.

    Figura 1

    Figura 1

  2. Separe cada embrião cortando entre locais de implantação ao longo corno uterino.

    Figura 2

    Figura 2


  3. Segure o revestimento muscular uterina, deslizando forceps relojoeiro entre a camada muscular circunvizinho e do tecido envolvido decídua. Retire a camada muscular, expondo a decídua.

    Figura 3

    Figura 3

  4. Clipe de fora de uma parcela da decídua expostas no ápice (aproximadamente 1 / 5 do tecido decídua), que irá expor a ponta midventral ou distal do embrião fechado.

    Figura 4

    Figura 4

  5. O embrião pode ser descascado, utilizando as pontas de uma pinça. Pierce a decídua com uma pinça em torno do embrião e uma pinça aberta a lágrima decidua distante.

    Figura 5

    Figura 5

  6. Uma vez que embrião é removido, a membrana Reichart ainda pode ser anexado, bem como o cone ectoplacental (trofoblasto). O embrião pode ser dissecada ainda por dissecção cuidadosa.

    Figura 6
    Figura 6

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Discussion

Pós-implantação em ratos ocorre entre 4,5 dpc e nascimento. Este método de dissecação pode ser aplicada, essencialmente como descrito, para isolar mais cedo ou mais tarde embriões em estágio 5,5-8,5 dpc.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

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References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

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