عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي (HUVEC)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا البروتوكول فيديو يوضح العزلة وثقافة الإنسان الخلايا البطانية الوريد السري (HUVEC) من الحبل السري البشري. مرة واحدة معزولة يمكن استخدام هذه الخلايا لتكوين الأوعية الدموية في المختبر فحوصات مثل الفحص الفايبرين محسن الخرزة جل أظهرت أيضا من قبل مختبر هيوز.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Davis, J., Crampton, S. P., Hughes, C. C. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183, doi:10.3791/183 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الأوعية الدموية هي عملية معقدة متعددة الخطوات العملية ، حيث استجابة لمحفزات عائية ، يتم إنشاء السفن الجديدة من الأوعية الدموية الموجودة. وتشمل هذه الخطوات : تدهور انتشار الطابق السفلي ، والغشاء والهجرة (تنبت) من الخلايا البطانية (EC) في المصفوفة خارج الخلية ، والمحاذاة من المفوضية الأوروبية في الحبال ، وتشكيل التجويف ، مفاغرة ، وتشكيل الغشاء القاعدي الجديد. وقد وضعت العديد من فحوصات المختبر لدراسة هذه العملية ، ولكن معظم فقط تحاكي مراحل معينة من الأوعية الدموية ، وتتشابه هذه السفن غالبا ما لا تشبه السفن في الجسم الحي. نحن هنا تدل على وجود الأمثل في المختبر فحص الأوعية الدموية التي تستخدم الإنسان السري EC الوريد والليفية. يلخص هذا النموذج جميع المراحل المبكرة من الأوعية الدموية الرئيسية ، والأهم من السفن عرض شمعة البراءة بين الخلايا محاطة EC الاستقطاب. ويمكن ملاحظتها بسهولة السفن على النقيض من المرحلة المجهري ومرور الزمن ، وانتعشت في شكل نقي للتطبيقات المصب.

Protocol

إجراء

  1. وضع الحبل على لوحة نظيفة وربت قبالة الدم الزائد. إجراء تخفيضات جديدة على طرفي الحبل.
  2. إدراج 21 02/01 إبرة G مع غمد إبرة بلاستيكية ON ، في الوريد. (وريد هو أكبر الافتتاح ، وتلك هي أصغر الشرايين 2)
  3. المشبك الإبرة في مكان مع مرقئ ونعلق 20cc المحقنة من الإبرة إلى هانكس.
  4. دفع هانكس عن طريق الوريد مع الضغط المعتدل. جمع النفايات في الدورق مع التبييض. (القابضة الإبرة والحبل بيد واحدة بينما يدفع من شأنه أن يمنع الإبرة تفرقع من الوريد). إذا كان هناك الكثير من الدم في الوريد ، ويغسل مرة ثانية.
  5. وضع الحبل على وسادة والمشبك في الطرف الآخر من الوريد. ملء مع قليل من مل هانكس لفحص للكشف عن التسربات على طول الحبل. سحب 5 مل وقطع الشبك السفلي.
  6. قطع المحقنة 20cc. إزالة المكبس من المحاقن 10cc. نعلق حقنة 10cc إلى الإبرة ، وتصب في كولاجيناز 10ML واستبدالها المكبس. دفع كولاجيناز في الوريد حتى ترى المبلغ الأول خروج من نهاية مفتوحة. إعادة المشبك نهاية مفتوحة وتمتلئ كولاجيناز حتى يكون هناك انتفاخ معتدلة من الوريد. النتائج انتفاخ كثيرا في تلوث العضلات الملساء.
  7. تدليك الحبل بلطف.
  8. الحبل احتضان (مع الإبرة ، والمحاقن المرقأة المرفقة) في DPBS عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  9. في حين يحتضنها ، ومواصلة الخطوات 1-8 مع الحبل الثانية 2.
  10. بعد مرور فترة الحضانة ، واتخاذ الحبل من الدورق وبينما يمسك الحبل على خفض أنبوب 50mL نهاية فوق الشبك السفلي. تأكد من جمع كل شيء في الأنبوب. دفع كولاجيناز المتبقية من خلال الحبل السري ، ثم نعلق المحقنة 20cc هانكس ، ودفع من خلال الضغط مع المعتدلين.
  11. إذا كنت لا حاجة لخلايا العضلات الملساء ، تجاهل الحبل في هذا الوقت. خلاف ذلك ، وضع نفسه في سلك أنبوب 50mL الثانية مع كولاجيناز ~ 5ml واحتضان لفي 37 دقيقة 30-60 درجة مئوية.
  12. إبقاء الأنبوب حتى تتم جميع الحبال.
  13. تدور الأنابيب في 1200 دورة في الدقيقة ~ لمدة 5 دقائق.
  14. نضح طاف (باستثناء 1-2 مل ~). Resuspend لبيليه في PHEC 5mls + و لوحة في T25.
  15. احتضان عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5 ٪ بين عشية وضحاها.
  16. اليوم التالي إزالة طاف واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة. إذا كان هناك العديد من كرات الدم الحمراء ، ويغسل مرة واحدة مع M199 ، ثم إضافة + PHEC. مواصلة احتضان كالمعتاد حتى يتم لوحة متموجة (1-4 أيام). انقسمت الى T75 gelatinized.
  17. T75 بمجرد متموجة ، تنقسم إلى ثلاثة T75s. تجميد two القنينات في القارورة.

ملاحظة : الخلايا البطانية (unactivated) لها مظهر الحصوه. أحيانا يتم تنشيط خلايا بطانة الأوعية الدموية (طويل ومدبب) اليمين بعد العزلة ، وبعد بضع يمر عادة عودتهم الى دولة unactive.

تنظيف

  1. بعناية شديدة ، والتخلص من الإبر الحادة في حاويات.
  2. تخلص من المحاقن في حاوية بيولوجية كبيرة.
  3. تطرح جميع أنسجة واقية في كيس صغير. إغلاق الكيس والتجميد في -20 درجة حتى الحرق.
  4. نقع في جميع الصكوك مبيد للفيروس على الأقل 10 دقيقة.
  5. إضافة إلى وسائل الإعلام حضانة النفايات دورق / التبييض. اسمحوا الجلوس لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
  6. تجاهل منصات مقاعد البدلاء إلى نفايات بيولوجية.
  7. رذاذ باستمرار داخل وخارج الأكواب ، أعلى مقعد وغطاء حمام مائي مع vircide. اسمحوا الجلوس 10 دقيقة ، ثم تمسح.
  8. الأكواب وأدوات الشطف بالماء الدافئ ومعلقة على الرف حتى يجف (وصمة عار قبالة الصكوك حتى لا الصدأ).
  9. التخلص من النفايات تطهير اسفل الحوض.
  10. عودة إلى البراد وسائط غير مستخدمة.
  11. التخلص من النفايات في قفازات واقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Collagenase 10ml per cord, warmed to 37°C
Tissue culture flasks T75, one per cord.
Hanks medium
scissors sterile
beaker sterile
50 ml tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

10 Comments

  1. may you tell me wath kind of collagenase do you use? thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 16, 2008 - 5:47 AM
  2. hi   i have been using dispase to isolate cells. iam succeeding in getting the cells but they are not spreading properly . even after two days iam not able to see  the typical cobble stone appearance. can you help.  Rathna  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 1, 2008 - 11:25 AM
  3. hallo,can you tell me what's the  PHEC+ ?thank you !

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 6:27 AM
  4. Hi, do you have any idea how many cells I can get from a 90% confluent flask (²5 or 75 qcm)? Many thanks in advance, Karin

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 26, 2009 - 8:06 AM
  5. From my experience working with HUVEC, a confluent T²5 flask has about 400,000 to 600,000 million cells while a confluent T75 flask has approximately ²-4 millions cells. From this, you can probably roughly deduce how many cells are in a 90% confluent T²5/T75 flask. I hope this help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2009 - 5:45 AM
  6. hi
    how to i prepare collagenase for HUVEC isolation

    Reply
    Posted by: swati s.
    October 22, 2009 - 1:45 PM
  7. Hi,

    I was a synthetic organic chemist and am trying to conduct a bio-organic project. I will be very thankful if you would share some info with me about how to lysate the HUVECs.

    Ge

    Reply
    Posted by: Ge Z.
    January 11, 2010 - 6:56 PM
  8. To answer Ge's question, our lab lysate the HUVEC by adding lysate buffer 1x either in DPBS or water.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 20, 2010 - 2:54 PM
  9. Thank you so much for the answer. May I have more info regarding the components of your lysate buffer and at what condition do you lysate HUVECs?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 20, 2010 - 3:09 PM
  10. hi,

    Very Intresting way, but I wonder how many passages they can be usefull?
    Is there any difference between commercially available ones and freshly isolated ones(these ones)?
    Thanks in advance:-)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 3, 2012 - 11:57 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics