בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Thalhofer, C. J., Graff, J. W., Love-Homan, L., Hickerson, S. M., Craft, N., Beverley, S. M., Wilson, M. E. In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host. J. Vis. Exp. (41), e1980, doi:10.3791/1980 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מינים שונים של

Protocol

1. זיהום של חיות קטנות עם מהונדס שושנת יריחו

1. טפיל קווי

טראנסגנטי שושנת יריחו spp. טפילים להביע בלוציפראז נוצרות באמצעות episomal או וקטור שילוב כפי שדווח. 1 2 קווי המשובטים עדיפים. שתי נקודות חשובות:

(א) בלוציפראז משולבת היא המועדפת על בלוציפראז episomal, שכן התיאוריה שורות אלו הטפיל צריך יותר לשמור על transgene בהעדר כלומר הלחץ, התרופה לאחר הקדמה לתוך היונק. Transgenes עם זאת משולב גם יכול ללכת לאיבוד בשיעורים נמוכים, 3 כל כך חיוני כדי לשמור על הלחץ תרופה סלקטיבית על תרבות המניות. בפועל, שושנת יריחו spp. לעתים קרובות לשמר אלמנטים episomal לתקופה בלתי מוגבלת גם in vivo, כי עם וריאציה במספר עותק פלסמיד לכל תא. 4 עבור כל אחד מסוגי מהונדס טפיל, הם צריכים להיות תמיד עבר זמן במבחנה לפני חיסון לתוך חיים כדי למנוע השפעות התרופה פוטנציאליים.

(ב) spp שושנת יריחו. טפילים יכולים לאבד ארסיות במהלך בתרבות חוץ גופית. במינים מסוימים (למשל ל donovani, ל infantum chagasi) הפסד זה יכול להתרחש במהירות מעל שבועות של תרבות. במינים אחרים (למשל, ל הגדולים, ל מקסיקנה) ארסיות נשמר לטווח ארוך יותר, במשך חודשים עד שנים. עם זאת, transfectants המשובטים צריך להיות מוקרן לזהות את ארסיות מלא שמירה על חיות קטנות. מעבדות רבות סדרתי יהיה להעביר את הטפילים מספר פעמים (4 או יותר) באמצעות עכברים או אוגרים כדי להגדיל ארסיות לפני השימוש בניסויים.

2. הכנת metacyclic זיהומיות טפילים הבמה זיהום

צורת זיהומיות של שושנת יריחו spp. אשר מועבר על ידי זבוב החול לארח את היונקים הוא promastigote metacyclic. 5 לפיכך, זיהומים חיה עם סוג זה של הטפיל הם העדיפו כמודל של זיהום טבעי. למרות זבובי חול קשה לשמור, טפילים גדל במבחנה יהיה נוח לעבור metacyclogenesis. אחוז metacyclics נוכח בתרבות תשתנה בהתאם למספר עובר מאז במנותק מן החיה, התקשורת והתרבות המין הטפיל ומתח.

Metacyclics יכול להיות מטוהר על ידי בחירה חיובית או שלילית בהתאם מינים ועל שורה של שושנת יריחו. שינויים בטרמינל או שרשרת צד פחמימות שאריות של משטח lipophosphoglycan בשפע (גפ"מ) של L. חשוב לאפשר לו להיות מטוהרים על ידי אובדן של התלכדות עם הרשות הפלסטינית לקטינים (agglutinin בוטנים). שושנת יריחו 5,6 מינים אחרים או ל מוטנטים חסרי הגדולות metacyclic גפ"מ יכול להיות מטוהרים על שיפוע צעד Ficoll. 7 IVIS יכול להתבצע באמצעות בתפזורת שאינם מטוהרים תרבויות, אבל זה צריך להיות מוכר כי אלה מכילים תערובת של metacyclic וצורות זיהומיות פחות.

בדרך כלל, 15-20% של נפח שלב ל נייח i. תרבויות chagasi הם התאוששו כמו metacyclics באמצעות טפילים כי כבר מבודד בתוך 3 שבועות אוגר או עכבר. טפילים נשטפים על ידי צנטריפוגה, הושעה לריכוז הרצוי חיץ (HBSS או PBS עם או בלי Ca 2 + ו - Mg 2 +), ומתוחזק על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפני חיסון לתוך העכבר.

3. בחירת תוואי חיסון של שושנת יריחו spp. לתוך המארח

הסימנים הקליניים של המחלה leishmaniasis האדם להשתנות בהתאם גם מינים של הטפיל וגורמים המארח. ישנם הבדלים המקביל זיהום Murine, חוקרים מובילים להשתמש במודלים שונים ומסלולים של זיהום. לדוגמה, מינים CL גורם אנושי (למשל ל הגדולים, ל מקסיקנה, ל amazonensis) הם לעתים קרובות מחוסן לעכברים תת עורית של שודד דרכים או intradermally באוזן. 8,9 המינים גורמת VL אדם פוגש לעתים קרובות דרך הווריד באמצעות זנב 10-12 וריד או intradermally באוזן. 13 דלקות ורידים זנב בוצעו גם עם אוגר הנגזרות amastigotes או עם promastigotes. אנו שגרתי להדביק עכברים עם טופס promastigote של L. i. chagasi, או intradermally באוזן או אזור tarsal לרוחב 14 או דרך הווריד.

4. טרום טיפול בעכברים עם הרדמה

עכברים knockout wild-type, או מהונדס גנטי יכול לשמש. אמנם לא רשמית, לכמת, נראה סביר להניח כי עירום או לבקנים כגון BALB / c עכברים לאפשר העברת אור גדולה יותר דרך רקמות לעומת עכברים עם עור כהה פיגמנט בשיער כגון C57BL / 6.

סוכני anesthestic בזריקות כגון תערובת של קטמין פלוס xylazine [80-100 מ"ג / ק"ג + 10 מ"ג / ק"ג, בהתאמה, intraperitoneally (IP)] מדולל מלח הוא אחד השיטה המועדפת, שכן החיות יהיה בהרדמה קלות במשך לפחות 10 דקות עם מנה אחת. 100-200ul הנפח הכולל מוזרק ip באמצעות מחט מד 25-30. חיות הן ידנית מאופקת בחוזקה בעור הגב שלהם עם הבטן שלהם מעלה את הראש כלפי מטה. המחט צריכה להיות ממוצבת עם שפוע מעלה בזווית מעט. קצה המחט צריכה לחדור רק מעט ברבע השמאלי התחתון של דופן הבטן.

נשימתית הרדמה כגון isoflurane יכול לשמש לסירוגין, אבל החיות רק להישאר תחת הרדמה עוד הם שאיפת סוכן הרדמה.

5. זיהום של עכברים עם שושנת יריחו spp. טפילים

לאחר החיות מורדמים קלות, אתרי הזיהום מנקים עם כוהל אתילי או איזופרופיל 70%. המסלול טפיל מינים, זיהום המינון נקבע על ידי החוקר. נפח הזרקה צריך להיות ממוזער כדי למנוע נזק לרקמות מופרז עבור intradermal (10 μl) או תוך שרירית (25-50 μl) נתיבי זיהום. הכרכים הזרקת המותר בעכברים יכול להיות גדול יותר תוך ורידי (100-200 μl), תת עורית (עד 2 מ"ל) או intraperitoneal (עד 2 מ"ל) נתיבי זיהום.

דרכי זיהום כרכים השתמשו בניסויים שלנו כוללים intradermal את האוזן פינה (10 μl), תת עורית בדופן (100-200 μl), intraperitoneal (100-200 μl) או תוך ורידי (100-200 μl). מינונים טפיל נעים בין 10 פבואר - 10 יולי promastigotes.

2. Bioluminescent הדמיה של שושנת יריחו באמצעות IVIS (במערכת הדמיה vivo)

1. הכנת D-luciferin עבור in vivo bioluminescent הדמיה

D-Luciferin (Caliper LifeSciences) הוא מחדש את ריכוז של 15 מ"ג / מ"ל PBS Dulbecco של עם או בלי Mg 2 + ו - Ca 2 +, ו מזרק מסוננים (0.2 מיקרומטר). Aliquots קפואים ב -80 ° C עד השימוש. לפני הזריקה, luciferin הוא חימם עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.

2. הזרקה של D-luciferin

הזריקה היא לנקות luciferin מוחדר חיות בהכרה על ידי זריקה intraperitoneal של פתרון luciferin 15 מ"ג / מ"ל ​​DPBS, במינון של 150 מ"ג / ק"ג. Luciferin גם יכול להיות מוזרק חומר הרדמה, טיפול בבעלי חיים, אבל קינטיקה פליטת אור עשוי להשתנות מעט.

לאחר שהוזרק לתוך חיים, luciferin מסתובב במהירות. כדאי לקבוע באופן אמפירי את הזמן האופטימלי לרכישת נתונים זורח לאחר ההזרקה luciferin עבור כל דגם ניסיוני עבור מיקומים אנטומיים שונים של העכברים, כי קינטיקה של הפצה luciferin עשוי להשתנות. עקומה קינטית מופק על ידי רכישת רצף של תמונות לשכפל.

3. בעלי חיים מורדמים קלות

הרדמה נשימתית או בזריקות ניתן להשתמש בהליך הדמיה. Isoflurane פשוטה לנהל בשלב זה, מאחר שרוב מערכות IVIS יש תא הרדמה מצורף האף הרדמה חרוט סעפת בתוך החדר הדמיה. הרדמה היא הפיצול בין החדר הרדמה סעפת בתוך החדר הדמיה.

החיות ממוקמים הקאמרית פרספקס ברור הרדמה מרדים קלות 2.5-3.5% isoflurane. בעלי חיים מנוטרים חזותית כדי להבטיח תואר יעיל של הרדמה כבר המושרה, וכי הנשימה שלהם באין מפריע. במידה מספקת של הרדמה מאומת על ידי חוסר הנסיגה לחץ כפה כואבת. כמות isoflurane עשוי להיות מופחת 1.5-2% לאחר חיות מורדמים קלות.

4. Bioluminescent הנתונים שנאספו

בעלי חיים הרדים כראוי מועברים מחדר לחדר הרדמה הדמיה ממוצבת כך קונוסים האף מחובר סעפת יהיה לספק זרימה רציפה מוסדר של isoflurane.

תמונה Living תוכנה תוכנית (Caliper מדעי החיים) היא פתחה את IVIS מאותחל. בניסויים שלנו, אנו משתמשים Xenogen IVIS 200 המערכת (Caliper מדעי החיים). מצלמת CCD יהיה מקורר באופן אוטומטי נשמר בטמפרטורה המתאימה לאחר אתחול IVIS. מערכת המצלמה ההתקנה רכישת פרמטרים בתמונה מוגדרות בלוח הבקרה מערכת IVIS. הפרמטרים רכישת מבוססים במידה רבה על מספר החיות והעוצמה של פליטת אור. פרמטרים חשובים כוללים: מצב הדמיה (זורח או ניאון), זמן החשיפה (הזמן תריס פתוח), binning (קובע את גודל הפיקסלים על ה-CCD), להתמקד בנושא גובה (מישור מוקד), f / stop (גודל הצמצם) ואת שדה הראייה (FOV). מראש FOVs (אזורים תמונה מרובע) עבור סדרה 200 IVIS Imaging System הם 4, 6.5, 13, 20 ו - 25 ס"מ (רוחב של FOV).

לחיצה לרכוש או לרכוש תמונות מתמשך בחלון Control System IVIS יוזם התמונה רכישת נתונים על IVIS. פעמים רכישה יכול לנוע בין מספר שניות עד מספר דקות. בניסויים שלנו, אנו משתמשים 60 הגדרה second חשיפה מחדל.

תמונת תקריב (FOV קטן) עשוי לספק רזולוציה גבוהה יותר, אך לא בהכרח רגישות משופרת לעומת התמונה נלקחה באמצעות FOV גדול יותר.

לאחר תהליך הדמיה, בעלי חיים יוסרו מן החדר הדמיה, חזר בכלובים שלהם במעקב עד שהם להתאושש מן ההרדמה.

7. ניתוח נתונים

הנתונים הארה מנותח באמצעות תמונה Living תוכנה (Xenogen) ומתאים עוצמת האור כפי שבאה לידי ביטוי במספר הפוטונים זוהה על ידי מצלמת CCD. נתונים אלו מיוצגים על ידי דמות מדומה צבע כי הוא מעולף על תצלום שחור לבן של החיות. אזורים ספציפיים של התמונה עשויה להיות מנותח על ידי יצירת אזורים של עניין (ROI). התוכנה תמונה Living מספק מגוון רחב של אפשרויות פלט הנתונים. אחת הדרכים הפשוטות ביותר כדי לנתח את הנתונים כדי לבחור אזור של עניין (ROI) ולמדוד את הממוצע של פוטונים # / השני מזוהה. נתונים אלה לאחר מכן ניתן לייצא גיליון להפיץ כגון Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation). GraphPad פריזמה (GraphPad תוכנה) שימש לאחר מכן ליצור גרפים עבור כתב היד הזה.

3. נציג תוצאות

תקציר:

IVIS טכנולוגיה המאפשרת ויזואליזציה של בלוציפראז-לבטא שושנת יריחו spp. טפילים בחיים בהרדמה BALB / c עכברים בזמן אמת. לאחר luciferin המצע מפיצה דרך רקמות, חמצון מהיר של D-luciferin ידי בלוציפראז הביע ידי טפילים מהונדס גורם להיות אור הנפלט. הפוטונים כי אינם נספגים על ידי הרקמות מזוהים על פני השטח של החיה על ידי המצלמה CCD של טכנולוגיית הדמיה IVIS.

1. מודלים של זיהום טפילי הגורם האנושי עורית leishmaniasis הקרביים לעומת האדם.

מודלים Murine של leishmaniasis הקרביים הם בעייתיים יותר מודלים של leishmaniasis עורית, כיוון ההתקדמות של הזיהום מחייב המתת חסד של קבוצות של עכברים בכל נקודת זמן להעריך. הגבלה של IVIS היא פליטת האור הם הרווה ובמידות שונות ברקמות הקרביים שונים, ורקמות עם זרימת דם גבוהה כגון הכבד והטחול עשוי להיות בעייתי יותר מאשר העור. לכן, IVIS לא יכול להיות רגיש כמו זיהוי של בלוציפראז-לבטא טפילים בכבד ו spleens כמו בעור. מומלץ גם כי המון טפיל אין להשוות בין האתרים רקמות. עם זאת, נטען טפיל ברקמות אותו ניתן להשוות בין גיל בהתאמה עכברים נגועים של זן זהה.

האות בלוציפראז זוהה בקלות איברים הקרביים בניסויים שלנו, בהנחיית השוואה של זיהומים בין בעלי חיים. דוגמה זיהום 5 שבועות עם טפיל בלוציפראז-להביע גרימת leishmaniasis הקרביים האדם, Li. chagasi SSU/IR1SAT-LUC (A), מוצג באיור 1. לאחר 5 שבועות של זיהום, טפילים visceralized ניתן לאתר את הכבדים של העכברים ובכל spleens של עכברים 1 ו -2. איור 2 מראה טיטרציה מנה עם הקו אותו טפיל, שעה אחרי הקדמה של הטפיל. דוגמה זיהום האורך עם טפילים גרימת leishmaniasis עורית האדם, ל מקסיקנה SSU/IR1SAT-LUC (A), מוצג באיור 3.

2. קינטיקה של גילוי בלוציפראז.

מחקרים ראשוניים הקינטית חיוניים על מנת למקסם את זיהוי של פוטונים הנפלטים מן טפילים bioluminescent. חשוב לקבוע את זה באופן אמפירי, כמו בפעם הדמיה אופטימלית צפויה להשתנות בהתאם למספר והבהירות של הטפיל לבודד במיקום האנטומי של מיקרואורגניזמים זורח בעכברים. המחקרים הקינטית תלויים בקצב חלוקת luciferin בכל רקמות, רקמת העכבר מחסה בלוציפראז-לבטא שושנת יריחו, וכן את היעילות של פעילות הביטוי / אנזים בלוציפראז ב טפיל כל לבודד. עכברים נגועים ו מחוסן עם luciferin כמתואר לעיל, וכן רצף של תמונות נאסף כל 2 דקות לאחר ההזרקה luciferin. העוצמה של האור הנפלט הוא לכמת בגרף כדי לקבוע את נקודת גילוי מרבי (ראה למשל 1B איור). לאחר תקופה של גילוי האור המרבי נקבע, כל התמונות בניסוי צריך להשתמש באותו זמן של הדמיה לאחר חיסון של luciferin, כמו איור 1 א. מחקרים קינטיים שלנוהפגינו אות בלוציפראז שיא מהכבד של עכברים נגועים iv עם L. i. chagasi בין 10 ל 25 דקות לאחר חיסון ip luciferin (איור 1B).

3. הערכת היעילות של חיסון טפיל.

IVIS ניתן להשתמש כדי להעריך את העקביות והיעילות של זיהום ראשוני עם בלוציפראז-לבטא שושנת יריחו spp. עוד באותו מסלול משמש עבור כל חיה, הפוטונים הנפלטים יכול לשמש הערכה גסה של יעילות חיסון. דוגמה לכך היא שמוצג באיור 2, שבו BALB / c העכברים היו מחוסן עם המספרים המצוין של metacyclic ל i. chagasi promastigotes, זן visceralizing של שושנת יריחו. שעה אחת אחרי עכברים זיהום היו מחוסן עם ip luciferin, ואחרי 20 דקות התמונות צולמו. האיור מציג את התמונה בשחור לבן בלבד (איור 2 א) ואת התמונה ועליהן הארה פסאודו בצבע (תרשים 2B). איור 2C מציג את מספר הפוטונים הנפלטים מאזורים שנבחרו עניין (ROI) מהתמונות העכבר.

הדוגמה באיור 2 ממחיש כי המינון זיהום עומד ביחס ישר הדרגתיות של פוטונים הנפלטים עם מספר גדל והולך של טפילים. הנתונים מראים כי, בדומה ל העיקריים ל מקסיקנה, הדמיה של זיהומים עוריים עם שושנת יריחו spp. רגיש מאוד, מה שמאפשר פחות מ -10 4 טפילים להיות דמיינו בבירור. נתונים כגון אלה ניתן להשתמש כדי לכמת את עוצמת הזיהום. בדוגמה המוצגת באיור 2B, יש פוטונים כ 1 / sec / טפיל.

4. ניטור של זיהום כמובן בעכברים.

מודלים Murine של leishmaniasis עורית אופיינית להשתמש בגודל הנגע כאמצעי לעקוב זיהומים longitudinally. למרות הערכה טובה של התקדמות המחלה, גודל הנגע מושפע ממידת תגובה דלקתית, בנוסף לשיעור של שכפול טפיל ברקמות. עכברים חייב להיות מורדמים בתום הניסוי למעשה למדוד עומס הטפיל. IVIS ניתן להשתמש כדי להעריך את התקדמות המון טפיל longitudinally ברקמה עורית של עכברים נגועים עם מינים שושנת יריחו שגורמים leishmaniasis עורית. הדגימו באיור 3, BALB / c העכברים היו מחוסן תת עורי עם 10 5 ל ביום 0 מקסיקנה להביע בלוציפראז הדמיה על שבועות רציפים לאחר ההדבקה. איור 3 א מציג תמונות נציג ב 10-31 שבועות לאחר ההדבקה. הנתונים מוצגים אותו בצורה כמותית איור 3B. חשוב לציין כי המספרים של טפילים באתר זיהום ניתן לכמת ידי IVIS לפני הנגע הוא לזיהוי בשיטות אחרות.

במשך הזמן, הגידול מתקדמת פליטת אור מקבילה לעלייה במספרים טפיל. עוצמת האות, כלומר פוטונים / טפיל / שנייה, יכול להשתנות כפונקציה של מספרים הטפיל, מיקום רקמות, שלב גדילה טפיל in vivo. לכן, חשוב לכייל את הקשר בין טפילים הארה לפני בהנחה כי פליטת אור עומד ביחס ישר טפיל מספרים. במקרה של L. 15 הגדולים או ל מקסיקנה, 16 נראה כי הנחתה קטנה יחסית של פליטת אור אצל amastigotes בתוך נגעים שודד דרכים ביחס promastigotes. נתונים ראשוניים מצביעים על הנחתה כי עשוי להיות עמוק יותר ל chagasi infantum 17 או ל braziliensis. 15

איור 1
באיור 1. קינטיקה של גילוי בלוציפראז. אנליזה קינטית של הפצה luciferin בוצעה להקים את הזמן האופטימלי עבור זיהום שושנת יריחו הדמיה בכבד. עכברים נדבקו iv עם 10 7 ל i. chagasi pIR1SAT לוק (A). א) ארבעה עכברים נגועים היו צילמו יחד עם העכבר one נגוע לאחר 5 שבועות של זיהום. Luciferin היה מוזרק לתוך ה-IP כל חמש עכברים ותמונות נאספו כל שתי דקות במשך 24 דקות. ההחזר על ההשקעה נבחרו הארה נמדדה לכמת (B).

איור 2
איור 2. הערכת היעילות של חיסון טפיל. הדמיה לכימות bioluminescent טפילים שושנת יריחו במהלך זיהום עם IVIS. Wild-type BALB / c הוזרקו לעכברים intradermally עם HBSS (מדומה) או מהונדס שושנת יריחו ט ב באגף הימני התחתון chagasi ל i. chagasi pIR1SAT לוק (A). העכברים נותחו לאחר מכן עם שעה הדמיה IVIS טכנולוגיה אחת אחרי חיסון. א) תצלום שחור לבן של העכברים נלקח מיד לפני האות זורח (עוצמת האור) נמדדה. החצים האדומים מצביעים על הזריקה על כלבעלי חיים. ב) התמונה פסאודו צבע של הארה היה מעולף על התצלום. ג) אזורי עניין (ROI) נבחרו (עיגולים אדומים) לבין הארה היה לכמת את ההחזר על ההשקעה של כל אחד. הנתונים מייצגים את הארה נטו של ההחזר על ההשקעה נגוע מינוס ROI של מעושה נגוע.

איור 3
איור 3. לטווח ארוך זיהום עם טפיל הגורם האנושי leishmaniasis עורית. טיים כמובן הערכה של נטל טפילי בתוך חיה אחת הזריקו bioluminescent שושנת יריחו מקסיקנה pIR1SAT לוק (A). Wild-type BALB / c העכבר היה מוזרק תת עורי עם 100,000 נייח שלב מהונדס שושנת יריחו מקסיקנה pIR1SAT לוק (א) למשכן. IVIS נתונים שנאספו העכבר נגועים במספר המצוין של שבועות לאחר ההדבקה. א) פסיאודו תמונות צבעוניות של הארה היו מעולף על גבי תמונות בשחור לבן מנקודות הזמן המתאים. ב) החזר ההשקעה נטו נקבע על ידי מדידת הארה בתוך למשכן הנגוע ואת הפחתת ההחזר על ההשקעה רקע מן למשכן נגוע הנגדי היה בגרף. העלילה פיזור מייצג את ההחזר על ההשקעה נטו בנקודות זמן שונות לאחר הפגיעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo מערכת הדמיה (IVIS) מספק שיטה הדמיה חיה כולו או מודלים vivo הדמיה זיהום ניסיוני של צורות שונות של leishmaniasis. 18,16 spp שושנת יריחו. הטפילים יכולים להיות מהונדסים להביע בלוציפראז גחלילית ברמה כי הוא זוהה in vivo עם הטכנולוגיה IVIS הדמיה. אחד היתרונות הגדולים של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה לא פולשנית של שושנת יריחו spp. בתוך לארח את בעל החיים לחיות. שיטה זו יושמה מודלים אחרים למחלות זיהומיות, באמצעות גורמים מזהמים שיכולים לבטא transgenes. 19 20 יתר על כן, IVIS שימש כמודל להעריך טיפול תרופתי של זיהום שושנת יריחו מרכזי בעור C57BL / 6 עכברים. 16,21

יש כמה אזהרות חשובות ואת המגבלות של שיטה זו. עוצמת האות האור זוהה על ידי מצלמת CCD יכול להיות מושפע המיקום של טפילים בתוך הפונדקאי יונקים, מעוצמת הביטוי בלוציפראז של טפילים, לפי הזמינות של שיתוף גורמים לתגובת חמצון של D-luciferin ועל ידי קליטת האור על ידי רקמות שמעליה. יתר על כן, את עוצמת האות ב כבדי ואת spleens חלש ברמה של פוטונים לכל טפיל לשנייה מאשר האות בעור, כנראה בשל מרווה על ידי אספקת הדם המקומית הרקמות שמעליה. כימות של הפוטונים הנפלטים ניתן להשתמש כדי להשוות זיהום מתקדמת חיה יחידה לאורך זמן, או רקמות זהה בין בעלי חיים. 16 אולם עד אופטימיזציה נוספת, אזהרות אלה יגביל את הרגישות ולכן התועלת של השיטה עבור הערכה כמותית של זיהומים עמוק עם visceralizing שושנת יריחו spp. לבסוף, תמונות צפויים להיות חלשים בשחור (למשל C57BL / 6) עכברים מאשר לבן (למשל BALB / ג) בעכברים. גילוח השיער מעל העור שמעל שטח של עניין יכול להיות שימושי בזיהוי האות מעכברים שחור.

שיקולים נוספים הם זקוקים כדי לאמת את IVIS כמדד כמותי של המון טפיל. השוואות בין, מיקרוסקופיה qPCR ו IVIS נעשו כמה מקרים, אבל יהיה צורך עם כל מערכת כדי לאמת את השימוש בשיטה כמדד של התקדמות המחלה. 22 16 שיטות חדשות עבור הדמיה הם מתעוררים, אשר יכול להיות מצמידים את תמונות פליטת אור. 16 בנוסף טפילים מהונדס, המארחים חיה יכול להיות מהונדסים לבטא מולקולות bioluminescent או פלורסנט. מחקרים עתידיים באמצעות טכניקה זו יכולה לכלול חיות להביע transgenes של תאים סלולריים כדי לזהות גורמים ספציפיים מארח מעורב בפתוגנזה וטפילים בעת ובעונה אחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק ההצטיינות סקירה מהמחלקה לענייני יוצאי צבא, על ידי מענקים NIH AI045540, AI067874, AI076233-01 ו AI080801 (מיו), ועל ידי AI29646 (SMB). העבודה בוצעה בחלקה במהלך המימון של CT ו JG ידי NIH T32 AI07511.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
D-Luciferin Potassium Salt Reagent Caliper Life Sciences 122796
IVIS Imaging System 200 Series Equipment Caliper Life Sciences Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capul, A. A., Barron, T., Dobson, D. E., Turco, S. J., Beverley, S. M. Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major. J Biol Chem. 282, 14006-14017 (2007).
  2. LeBowitz, J. H., Coburn, C. M., McMahon-Pratt, D., Beverley, S. M. Development of a stable Leishmania expression vector and application to the study of parasite surface antigen genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9736-9740 (1990).
  3. Mureev, S., Kushnir, S., Kolesnikov, A. A., Breitling, R., Alexandrov, K. Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers. Mol Biochem Parasitol. 155, 71-83 (2007).
  4. Chakkalath, H. R. Priming of a beta-galactosidase (beta-GAL)-specific type 1 response in BALB/c mice infected with beta-GAL-transfected Leishmania major. Infect Immun. 68, 809-814 (2000).
  5. Sacks, D. L., Perkins, P. V. Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science. 223, 1417-1419 (1984).
  6. da Silva, R., Sacks, D. L. Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania promastigote virulence and attenuation. Infect Immun. 55, 2802-2806 (1987).
  7. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99, 97-103 (2001).
  8. Scott, P., Caspar, P., Sher, A. Protection against Leishmania major in BALB/c mice by adoptive transfer of a T cell clone recognizing a low molecular weight antigen released by promastigotes. J Immunol. 144, 1075-1079 (1990).
  9. Belkaid, Y. The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile cure. J Exp Med. 194, 1497-1506 (2001).
  10. Wilson, M. E. Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi. J Immunol. 156, 2231-2239 (1996).
  11. McElrath, M. J., Murray, H. W., Cohn, Z. A. The dynamics of granuloma formation in experimental visceral leishmaniasis. J Exp Med. 167, 1927-1937 (1988).
  12. Ato, M. Loss of dendritic cell migration and impaired resistance to Leishmania donovani infection in mice deficient in CCL19 and CCL21. J Immunol. 176, 5486-5493 (2006).
  13. Ahmed, S. Intradermal infection model for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis. Infect Immun. 71, 401-410 (2003).
  14. Kamala, T. Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections. J Immunol Methods. 328, 204-214 (2007).
  15. Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cell Microbiol. 7, 383-392 (2005).
  16. Brittingham, A., Miller, M. A., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Regulation of GP63 mRNA stability in promastigotes of virulent and attenuated Leishmania chagasi. Mol Biochem Parasitol. 112, 51-59 (2001).
  17. Roy, G. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Mol Biochem Parasitol. 110, 195-206 (2000).
  18. Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
  19. Hardy, J., Margolis, J. J., Contag, C. H. Induced Biliary Excretion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 74, 1819-1827 (2006).
  20. Lecoeur, H. Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model. PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).
  21. Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. Imaging Leishmania development in their host cells. Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).

Comments

3 Comments

  1. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM
  2. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM
  3. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics