ट्रांसजेनिक लीशमैनिया परजीवियों की एक लाइव होस्ट में vivo इमेजिंग में

Immunology and Infection

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Thalhofer, C. J., Graff, J. W., Love-Homan, L., Hickerson, S. M., Craft, N., Beverley, S. M., Wilson, M. E. In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host. J. Vis. Exp. (41), e1980, doi:10.3791/1980 (2010).

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Abstract

अलग की प्रजातियों

Protocol

1. ट्रांसजेनिक लीशमैनिया के साथ छोटे जानवरों के संक्रमण

1. परजीवी लाइनों

ट्रांसजेनिक लीशमैनिया एसपीपी. luciferase व्यक्त परजीवी एक episomal या एक एकीकृत वेक्टर के रूप में रिपोर्ट का उपयोग करते हुए उत्पन्न कर रहे हैं 1 2 clonal लाइनों पसंद कर रहे हैं. दो महत्वपूर्ण बिंदुओं हैं:

(क) एकीकृत luciferase episomal luciferase अधिक पसंद है, क्योंकि सिद्धांत में इन परजीवी लाइनों बेहतर एक स्तनपायी में परिचय के बाद दवा दबाव यानी, के अभाव में transgene बनाए रखने चाहिए. हालांकि भी एकीकृत transgenes कम दरों, 3 पर खो दिया जा सकता है तो यह शेयर संस्कृति पर चयनात्मक दवा दबाव बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. अभ्यास में, लीशमैनिया एसपीपी. अक्सर vivo में भी बढ़ाया समय अवधि के लिए episomal तत्वों को बनाए रखने, हालांकि सेल प्रति प्लाज्मिड नकल संख्या में भिन्नता के साथ ट्रांसजेनिक परजीवी के किसी भी प्रकार के लिए 4, वे हमेशा इन विट्रो एक समय में पारित किया जाना चाहिए टीका से पहले पशुओं में संभावित दवा प्रभाव से बचने के लिए..

(ख) लीशमैनिया एसपीपी. परजीवी के दौरान इन विट्रो संस्कृति में डाह खो सकते हैं. कुछ प्रजातियों में (जैसे एल डोनोवनी, एल infantum chagasi) इस नुकसान तेजी से संस्कृति के सप्ताह से अधिक हो सकता है . (जैसे, एल प्रमुख, एल Mexicana) अन्य प्रजातियों में डाह लंबी अवधि बनाए रखा है साल के लिए महीने के लिए. बहरहाल, clonal transfectants के उन छोटे जानवरों के लिए बनाए रखना है पूरा डाह की पहचान के लिए जांच की जानी चाहिए. कई प्रयोगशालाओं serially परजीवी कई बार पारित करेंगे (4 या अधिक) चूहों या hamsters के माध्यम डाह बढ़ाने से पहले के प्रयोगों में उपयोग करने के लिए.

2. संक्रामक metacyclic चरण परजीवी के संक्रमण के लिए तैयार

संक्रामक लीशमैनिया एसपीपी के रूप में. कि स्तनधारी मेजबान रेत मक्खी द्वारा फैलता है metacyclic promastigote 5 इसलिए है, परजीवी के इस फार्म के साथ पशु संक्रमण प्राकृतिक संक्रमण के एक मॉडल के रूप में पसंद कर रहे हैं. हालांकि बालू मक्खी बनाए रखने के लिए मुश्किल हैं, इन विट्रो में हो परजीवी सुविधा metacyclogenesis से गुजरना होगा. एक संस्कृति में मौजूद metacyclics के प्रतिशत पशु, संस्कृति, मीडिया और परजीवी प्रजातियों और तनाव से अलगाव के बाद से गुजरता की संख्या के साथ अलग अलग होंगे.

Metacyclics सकारात्मक या नकारात्मक और लीशमैनिया की प्रजातियों की लाइन पर निर्भर करता है चयन के द्वारा शुद्ध किया जा सकता है है. टर्मिनल में परिवर्तन या एल के प्रचुर मात्रा में सतह lipophosphoglycan (एलपीजी) की ओर श्रृंखला कार्बोहाइड्रेट अवशेषों प्रमुख लेक्टिन PNA (मूंगफली agglutinin) के साथ समूहन की हानि के द्वारा शुद्ध की अनुमति 5,6 अन्य लीशमैनिया प्रजातियों या एल. प्रमुख metacyclic एलपीजी की कमी म्यूटेंट एक Ficoll कदम ढाल पर शुद्ध किया जा सकता है 7 IVIS थोक गैर शुद्ध संस्कृतियों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह मान्यता प्राप्त होना चाहिए कि इन metacyclic और कम संक्रामक रूपों का एक मिश्रण होते हैं.

आमतौर पर, थोक स्थिर चरण एल के 15-20% i. chagasi संस्कृतियों metacyclics परजीवी है कि एक हम्सटर या माउस से 3 सप्ताह के भीतर पृथक किया गया है का उपयोग कर के रूप में बरामद कर रहे हैं. परजीवियों centrifugation द्वारा धो रहे हैं, में वांछित बफर एकाग्रता (HBSS या के साथ या 2 Ca बिना + और ​​पीबीएस मिलीग्राम + 2), और 4 पर बनाए रखा ° 2 बजे तक के लिए माउस में टीका से पहले सी को निलंबित कर दिया .

3. लीशमैनिया एसपीपी की टीका के लिए मार्ग के विकल्प . मेजबान में

मानव लीशमनियासिस के नैदानिक ​​रोग अभिव्यक्तियाँ परजीवी और मेजबान कारकों के दोनों प्रजातियों के आधार पर बदलती हैं. Murine संक्रमण में इसी मतभेद, अग्रणी करने के लिए विभिन्न मॉडल और संक्रमण के मार्गों का उपयोग जांचकर्ताओं हैं. उदाहरण के लिए, मानव सी.एल. (जैसे एल प्रमुख, एल Mexicana, एल amazonensis) कारण प्रजातियों अक्सर चूहों में subcutaneously लुटेरा में या कान में intradermally 8,9 प्रजाति मानव वीएल के कारण अक्सर एक पूंछ के माध्यम से नसों के द्वारा शुरू कर रहे हैं inoculated. 10-12 नस या कान में intradermally 13 पूंछ नस संक्रमण हम्सटर - व्युत्पन्न amastigotes के साथ या promastigotes के साथ किया गया है या तो प्रदर्शन किया . हम नियमित रूप से एल के promastigote फार्म के साथ चूहों संक्रमित i. chagasi, या तो intradermally कान या पार्श्व tarsal 14 क्षेत्र या नसों के द्वारा में.

4. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के साथ चूहों के पूर्व उपचार

जंगली प्रकार ट्रांसजेनिक या जीन पीटा चूहों का इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि मात्रा निर्धारित नहीं औपचारिक रूप से, यह सबसे अधिक संभावना लगता है कि नग्न या BALB / ग चूहों जैसे सूरजमुखी मनुष्य अधिक से अधिक ऊतक के माध्यम से प्रकाश C57BL / 6 के रूप में अंधेरे त्वचा और बालों वर्णक के साथ चूहों की तुलना में संचरण के लिए अनुमति देते हैं.

Ketamine प्लस xylazine [80-100 मिलीग्राम / किग्रा क्रमश: + 10 मिलीग्राम / किग्रा, मिश्रण, intrap जैसे इंजेक्शन anesthestic एजेंट(आईपी) eritoneally] खारा में पतला एक पसंदीदा तरीका है, के बाद से पशुओं के एक खुराक के साथ कम से कम 10 मिनट के लिए हल्के anesthetized जाएगा. 100 200ul कुल मात्रा आईपी अंतःक्षिप्त है एक 25-30 गेज सुई का उपयोग. जानवरों मैन्युअल रूप से अपने पेट के साथ पृष्ठीय त्वचा के द्वारा दृढ़ता से रोका ऊपर और सिर नीचे बताया. सुई ऊपर और थोड़ा angled बेवेल के साथ तैनात किया जाना चाहिए. सुई की नोक बस थोड़ा कम पेट की दीवार के बाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग में घुसना चाहिए.

Isoflurane रूप में inhalant चतनाशून्य करनेवाली औषधि एकांतर से, इस्तेमाल किया जा सकता है हो सकता है, लेकिन जानवरों के रूप में लंबे समय के रूप में वे संवेदनाहारी एजेंट inhaling रहे हैं के लिए केवल संज्ञाहरण के तहत रहेगा.

5. लीशमैनिया एसपीपी के साथ चूहों के संक्रमण. परजीवी

एक बार जानवरों हल्के anesthetized हैं, संक्रमण साइटों को 70% एथिल या isopropyl शराब के साथ साफ कर रहे हैं. परजीवी प्रजातियों, खुराक, और संक्रमण के मार्ग अन्वेषक द्वारा निर्धारित किया जाता है. intradermal (10 μl) या इंट्रामस्क्युलर (25-50 μl) संक्रमण मार्गों के लिए अत्यधिक ऊतकों को नुकसान को रोकने के इंजेक्शन की मात्रा कम से कम किया जाना चाहिए. चूहों में स्वीकार्य इंजेक्शन मात्रा (100-200 μl) नसों में, चमड़े के नीचे (2 मिलीग्राम) या intraperitoneal (2 एमएल) संक्रमण मार्गों के लिए बड़ा किया जा सकता है.

कान (10 μl) पंख, चमड़े के नीचे दिशा में (100-200 μl), intraperitoneal (100-200 μl) या नसों (100-200 μl) में संक्रमण मार्गों और मात्रा हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया intradermal शामिल हैं. परजीवी खुराक 10 से 10 2 7 promastigotes के लिए लेकर है.

2. लीशमैनिया के bioluminescent इमेजिंग IVIS (vivo इमेजिंग प्रणाली में)

1. डी luciferin के vivo bioluminescent इमेजिंग में के लिए तैयार

डी Luciferin (कैलिपर जीव विज्ञान) 15 मिलीग्राम / Dulbecco के साथ या बिना 2 मिलीग्राम पीबीएस में मिलीलीटर की एक एकाग्रता के लिए पुनर्गठन किया जाता है + और ​​2 Ca +, और फ़िल्टर सिरिंज (0.2 सुक्ष्ममापी ). Aliquots -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक जमे हुए हैं. इंजेक्शन के लिए पहले, luciferin 37 डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में गर्म है.

2. डी luciferin के इंजेक्शन

इंजेक्शन साइट साफ है और luciferin होश में पशुओं में एक 15 मिलीग्राम / एमएल DPBS में luciferin समाधान की intraperitoneal इंजेक्शन के द्वारा शुरू की है 150 मिलीग्राम / किग्रा की एक खुराक पर. Luciferin भी संवेदनाहारी इलाज पशुओं में इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन bioluminescence कैनेटीक्स से थोड़ा भिन्न हो सकते हैं.

एक बार पशुओं में इंजेक्ट luciferin तेजी से circulates. यह empirically इष्टतम समय का निर्धारण प्रत्येक प्रयोगात्मक मॉडल के लिए और चूहों के विभिन्न संरचनात्मक स्थानों के लिए luciferin इंजेक्शन के बाद luminescent डेटा प्राप्त करने के लिए उपयोगी है क्योंकि luciferin वितरण के कैनेटीक्स भिन्न हो सकते हैं. एक गतिज वक्र को दोहराने के छवियों का एक अनुक्रम प्राप्त द्वारा उत्पन्न होता है.

3. पशु हल्के anesthetized हैं

Inhalant या इंजेक्शन anesthetics इमेजिंग प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Isoflurane आसान है इस स्तर पर प्रशासन के बाद से सबसे IVIS सिस्टम एक संलग्न संज्ञाहरण कक्ष और कक्ष के अंदर इमेजिंग संज्ञाहरण नाक शंकु कई गुना है. संज्ञाहरण संज्ञाहरण कक्ष और कक्ष के अंदर इमेजिंग कई गुना के बीच विभाजित है.

जानवरों स्पष्ट Plexiglass संज्ञाहरण चैम्बर में रखा जाता है और हल्के 2.5-3.5% isoflurane के साथ anesthetized. पशु नेत्रहीन संज्ञाहरण के एक प्रभावी डिग्री प्रेरित किया गया है सुनिश्चित करने के निगरानी कर रहे हैं, और उनकी सांस लेने निर्बाध है कि. संज्ञाहरण के पर्याप्त डिग्री दर्दनाक पंजा दबाव से वापसी की कमी के द्वारा सत्यापित है. isoflurane की राशि 1.5-2% तक कम किया जा सकता है के बाद जानवरों को हल्के anesthetized हैं.

4. Bioluminescent डेटा एकत्र है

पर्याप्त रूप से anesthetized जानवरों संज्ञाहरण चैम्बर से इमेजिंग कक्ष स्थानांतरित कर रहे हैं और इसलिए तैनात है कि कई गुना करने के लिए संलग्न नाक शंकु isoflurane की एक सतत और विनियमित प्रवाह उद्धार करेगा.

लिविंग छवि सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (कैलिपर लाइफ साइंसेज) खोला है और IVIS initialized है. हमारे प्रयोगों के लिए, हम Xenogen IVIS 200 प्रणाली (कैलिपर लाइफ साइंसेज) का उपयोग करें. सीसीडी कैमरा स्वत: हो सकता है और ठंडा होगा बनाए रखा IVIS आरंभ करने के बाद उचित तापमान पर. कैमरा प्रणाली सेटअप और छवि अधिग्रहण मापदंडों IVIS सिस्टम नियंत्रण कक्ष में स्थापित कर रहे हैं. अधिग्रहण मापदंडों बड़े पैमाने पर पशुओं की संख्या और bioluminescence की तीव्रता के आधार पर कर रहे हैं. महत्वपूर्ण मानकों में शामिल हैं: इमेजिंग मोड (luminescent या फ्लोरोसेंट), जोखिम समय (समय है कि शटर खुला है), binning (सीसीडी पर पिक्सेल आकार निर्धारित करता है), ध्यान और विषय ऊंचाई (फोकल हवाई जहाज़), च बंद / (एपर्चर आकार) और देखने के क्षेत्र (FOV). पूर्व निर्धारित FOVIVIS इमेजिंग प्रणाली 200 सीरीज के लिए (वर्ग छवि क्षेत्रों) 4, 6.5, 13, 20, और 25 सेमी (FOV की चौड़ाई) कर रहे हैं.

अधिग्रहण या IVIS सिस्टम नियंत्रण विंडो में निरंतर तस्वीरें मोल दबाने छवि और IVIS पर डाटा अधिग्रहण शुरू की. अधिग्रहण बार कुछ सेकंड से कई मिनट के लिए रेंज कर सकते हैं. हमारे प्रयोगों के लिए, हम 60 सेकंड डिफ़ॉल्ट जोखिम सेटिंग का उपयोग करें.

एक छवि क्लोज़ - अप (छोटे FOV) अधिक से अधिक संकल्प प्रदान कर सकते हैं, लेकिन जरूरी नहीं बढ़ाया संवेदनशीलता एक लिया छवि एक बड़ा FOV का उपयोग की तुलना में.

इमेजिंग प्रक्रिया के बाद जानवरों इमेजिंग कक्ष से हटा रहे हैं, अपने पिंजरों में लौटे और निगरानी, ​​जब तक वे संज्ञाहरण से उबरने.

7. डेटा विश्लेषण

luminescence डेटा लिविंग छवि सॉफ्टवेयर (Xenogen) का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया है और प्रकाश सीसीडी कैमरा के द्वारा पाया photons की संख्या के रूप में व्यक्त की तीव्रता से मेल खाती है है. ये आंकड़े उस पर पशुओं के एक काले और सफेद तस्वीर के लिए मढ़ा है एक छद्म रंग छवि द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. छवि के विशिष्ट क्षेत्रों के हित के क्षेत्रों (आरओआई) को बनाने के द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. लिविंग छवि सॉफ्टवेयर डेटा आउटपुट विकल्पों की एक किस्म प्रदान करता है. एक सरल तरीके डेटा का विश्लेषण करने करने के लिए ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र का चयन करें और औसत फोटॉनों / दूसरा पता चला है कि # उपाय है. ये आंकड़े तो Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation) के रूप में एक फैल शीट को निर्यात किया जा सकता है. GraphPad चश्मे (GraphPad सॉफ्टवेयर) बाद में इस पांडुलिपि के लिए रेखांकन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

3. प्रतिनिधि परिणाम

सारांश:

IVIS प्रौद्योगिकी luciferase व्यक्त लीशमैनिया एसपीपी के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. वास्तविक समय में anesthetized BALB / ग चूहों में रहने वाले परजीवी. एक बार सब्सट्रेट luciferin ऊतकों के माध्यम से वितरित, डी luciferin के तेजी से ऑक्सीकरण ट्रांसजेनिक परजीवी द्वारा व्यक्त luciferase द्वारा उत्सर्जित हो प्रकाश का कारण बनता है. फोटॉनों है कि ऊतकों द्वारा अवशोषित नहीं कर रहे हैं IVIS इमेजिंग प्रौद्योगिकी के सीसीडी कैमरा द्वारा पशु की सतह पर पाया जाता है.

1. संक्रमण के परजीवी मानव आंत बनाम मानव cutaneous लीशमनियासिस के कारण के साथ मॉडल.

आंत लीशमनियासिस के murine मॉडल cutaneous लीशमनियासिस के मॉडल की तुलना में अधिक समस्याग्रस्त हैं, संक्रमण की प्रगति के बाद से हर बार मूल्यांकन बिंदु पर चूहों के समूहों की इच्छामृत्यु की आवश्यकता है. IVIS की एक सीमा है कि प्रकाश उत्सर्जन अलग extents करने के लिए विभिन्न ऊतकों में आंत बुझती हैं, और जिगर और तिल्ली के रूप में उच्च रक्त प्रवाह के साथ ऊतकों त्वचा की तुलना में अधिक समस्याग्रस्त हो सकता है. इसलिए, IVIS के रूप में पता लगाने के लिए संवेदनशील नहीं हो सकता luciferase त्वचा में के रूप में यकृत और spleens में परजीवी व्यक्त. यह भी सलाह दी है कि परजीवी भार ऊतक साइटों के बीच तुलना नहीं की जा चाहिए. बहरहाल, वही ऊतकों में परजीवी भार उम्र से मिलान एक ही तनाव के संक्रमित चूहों के बीच तुलना की जा सकती है.

luciferase संकेत हमारे प्रयोगों में आंत अंगों में आसानी से पता चला था, पशुओं के बीच संक्रमण की तुलना की सुविधा है. Luciferase व्यक्त परजीवी के कारण मानव आंत लीशमनियासिस, ली के साथ एक 5 सप्ताह के संक्रमण के एक उदाहरण है. chagasi SSU/IR1SAT-LUC (ए), चित्र 1 में दिखाया गया है. संक्रमण के 5 हफ्तों के बाद, visceralized परजीवी सभी चूहों के यकृत में और चूहों 1 और 2 के spleens में पता लगाया जा सकता है. चित्रा 2 एक ही परजीवी लाइन, परजीवी की शुरूआत के बाद एक घंटे के साथ एक खुराक टाइट्रेट करना दिखाता है. मानव cutaneous लीशमनियासिस, एल के कारण परजीवी के साथ एक अनुदैर्ध्य संक्रमण का एक उदाहरण Mexicana SSU/IR1SAT-LUC (ए), 3 चित्र में दिखाया गया है.

2. Luciferase का पता लगाने के कैनेटीक्स.

प्रारंभिक गतिज अध्ययन bioluminescent परजीवियों से उत्सर्जित फोटॉनों का पता लगाने को अधिकतम करने के लिए आवश्यक हैं. यह महत्वपूर्ण है इस empirically निर्धारित करते हैं, के रूप में इष्टतम इमेजिंग समय की संभावना संख्या और परजीवी की चमक को अलग और चूहों में luminescent सूक्ष्मजीवों के संरचनात्मक स्थान पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. गतिज अध्ययन luciferin ऊतकों भर में वितरण, माउस ऊतक शरण luciferase व्यक्त लीशमैनिया, और में प्रत्येक परजीवी अलग luciferase अभिव्यक्ति एंजाइम गतिविधि / की दक्षता की दर पर निर्भर हैं. चूहे कर रहे हैं और संक्रमित luciferin साथ inoculated के रूप में ऊपर वर्णित है, और छवियों का एक अनुक्रम luciferin इंजेक्शन के बाद हर 2 मिनट में एकत्र किया जाता है. उत्सर्जित प्रकाश का परिमाण की मात्रा निर्धारित की है और अधिकतम पता लगाने बिंदु निर्धारित (चित्रा 1 बी में उदाहरण देखें) का रेखांकन है. एक बार अधिकतम प्रकाश का पता लगाने के समय निर्धारित किया जाता है, सभी छवियों के प्रयोग में luciferin के टीकाकरण के बाद के रूप में चित्रा 1A इमेजिंग के एक ही समय, का उपयोग करना चाहिए. हमारे गतिज अध्ययनएल के साथ iv संक्रमित चूहों के जिगर से एक चोटी luciferase संकेत का प्रदर्शन i. के बीच 10 और 25 मिनट के बाद chagasi आईपी luciferin टीका (चित्रा 1 बी).

3. परजीवी टीका की क्षमता का आकलन.

IVIS लीशमैनिया एसपीपी luciferase व्यक्त के साथ और आरंभिक संक्रमण की निरंतरता और दक्षता का अनुमान किया जा सकता है. के रूप में लंबे समय के रूप में एक ही मार्ग प्रत्येक जानवर के लिए प्रयोग किया जाता है, उत्सर्जित फोटॉनों टीका प्रभावकारिता का एक मोटा अनुमान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है, जिसमें BALB / ग चूहों metacyclic एल के संकेत संख्या के साथ inoculated थे i. chagasi promastigotes, लीशमैनिया के एक visceralizing प्रजातियों. संक्रमण चूहों के बाद एक घंटे luciferin आईपी के साथ inoculated थे, और 20 मिनट के बाद छवियों को ले जाया गया. आंकड़ा काले और सफेद छवि अकेले (2A चित्रा) और छद्म रंग luminescence (चित्रा 2B) के साथ मढ़ा छवि दिखाता है. चित्रा 2C ब्याज की चुना माउस छवियों से क्षेत्रों (आरओआई) से उत्सर्जित photons के संख्या दिखाता है.

आंकड़ा 2 में उदाहरण यह दर्शाता है कि संक्रमण खुराक परजीवी की बढ़ती संख्या के साथ उत्सर्जित photons के उन्नयन के लिए सीधे आनुपातिक है. डेटा है कि दिखाने के लिए, एल के लिए समान प्रमुख और एल Mexicana, लीशमैनिया एसपीपी के साथ त्वचीय संक्रमण के इमेजिंग . बहुत ही संवेदनशील है, 4 से कम 10 परजीवी स्पष्ट रूप से देखे जा अनुमति देता है. जैसे कि इन आंकड़ों के संक्रमण की तीव्रता यों इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 2B में दिखाए गए उदाहरण में, वहाँ लगभग 1 फोटॉनों / / सेक परजीवी हैं.

4. चूहों में संक्रमण के पाठ्यक्रम की निगरानी.

Cutaneous लीशमनियासिस के murine मॉडल विशेषता एक उपाय के रूप में संक्रमण का पालन longitudinally में घाव आकार का उपयोग करें. रोग प्रगति का एक अच्छा अनुमान हालांकि, घाव आकार ऊतकों में परजीवी प्रतिकृति की दर के अलावा में भड़काऊ प्रतिक्रिया की डिग्री से प्रभावित है. चूहे प्रयोग के अंत करने के लिए वास्तव में परजीवी लोड को मापने में euthanized किया जाना चाहिए. IVIS longitudinally लीशमैनिया प्रजातियों कि cutaneous लीशमनियासिस के कारण के साथ संक्रमित चूहों की त्वचीय ऊतकों में परजीवी भार की प्रगति का अनुमान किया जा सकता है. चित्रा 3 में प्रदर्शन किया, BALB / ग चूहों subcutaneously 0 दिन 10 5 एल के साथ inoculated थे Mexicana संक्रमण के बाद अनुक्रमिक सप्ताह पर luciferase और imaged व्यक्त. चित्रा 3A 10-31 सप्ताह में संक्रमण के बाद प्रतिनिधि छवियों को दर्शाती है. एक ही डेटा चित्रा 3B में मात्रात्मक रूप में दिखाए जाते हैं. महत्वपूर्ण बात, संक्रमण की साइट पर परजीवी की संख्या IVIS द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है पहले एक घाव अन्य विधियों द्वारा detectable है.

समय के साथ, bioluminescence में उत्तरोत्तर वृद्धि परजीवी संख्या में वृद्धि से मेल खाती है है. सिग्नल की शक्ति, यानी फोटॉनों / / परजीवी और दूसरा, परजीवी संख्या के एक समारोह में, ऊतक स्थान, विकास के चरण में और vivo में परजीवी के स्वास्थ्य के रूप में भिन्न हो सकते हैं. इसलिए यह महत्वपूर्ण है पहले यह सोचते हैं कि bioluminescence संख्या परजीवी सीधे आनुपातिक है परजीवी और luminescence के बीच संबंधों को जांचना है. एल के मामले में 15 प्रमुख या एल Mexicana, 16 amastigotes में bioluminescence की अपेक्षाकृत कम क्षीणन लुटेरा promastigotes करने के लिए सापेक्ष घावों के भीतर प्रतीत होता है. प्रारंभिक आंकड़े बताते हैं कि क्षीणन एल के लिए और अधिक गहरा हो सकता है chagasi 17 infantum या एल के लिए braziliensis 15.

चित्रा 1
चित्रा 1. Luciferase का पता लगाने के कैनेटीक्स. Luciferin वितरण के काइनेटिक विश्लेषण जिगर में इमेजिंग लीशमैनिया संक्रमण के लिए इष्टतम समय स्थापित करने के लिए प्रदर्शन किया था. चूहे iv 10 7 एल से संक्रमित थे i. chagasi pIR1SAT ल्यूक (एक). ए) चार संक्रमित चूहों एक असंक्रमित माउस के साथ साथ संक्रमण के 5 हफ्तों के बाद imaged थे. Luciferin आईपी सभी पांच चूहों और छवियों में इंजेक्ट किया गया था 24 मिनट के लिए हर दो मिनट एकत्र. आरओआई चयनित और luminescence मापा और मात्रा निर्धारित किया गया था (बी) थे.

चित्रा 2
चित्रा 2. परजीवी टीका की क्षमता का आकलन इमेजिंग और IVIS के साथ संक्रमण के दौरान bioluminescent लीशमैनिया परजीवी बढ़ाता है. जंगली प्रकार BALB / ग चूहों intradermally निचले सही दिशा में (नकली) HBSS या ट्रांसजेनिक लीशमैनिया i. के साथ अंतःक्षिप्त थे chagasi एल i. chagasi pIR1SAT ल्यूक (एक). चूहे तो IVIS टीका इमेजिंग तकनीक के बाद एक घंटे के साथ विश्लेषण किया गया. ए) चूहों के एक काले और सफेद तस्वीर तुरंत पहले luminescent संकेत (प्रकाश की तीव्रता) मापा गया था लिया गया था. लाल तीर इंजेक्शन साइट के लिए प्रत्येक पर इंगितजानवर. बी) luminescence के छद्म रंग छवि तस्वीर पर मढ़ा था. सी) क्षेत्र (आरओआई) ब्याज की (लाल हलकों) का चयन किया गया था और luminescence प्रत्येक लागत पर लाभ में मात्रा निर्धारित किया गया था. डेटा संक्रमित रॉय शून्य से संक्रमित नकली के रॉय का शुद्ध luminescence का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. मानव cutaneous लीशमनियासिस कारण परजीवी के साथ लंबी अवधि के संक्रमण समय एक ही पशुओं में परजीवी बोझ bioluminescent लीशमैनिया pIR1SAT ल्यूक Mexicana (ए) के साथ इंजेक्शन के पाठ्यक्रम और मूल्यांकन. एक जंगली प्रकार / BALB ग माउस subcutaneously ओल में 100.000 स्थिर चरण ट्रांसजेनिक लीशमैनिया Mexicana pIR1SAT - ल्यूक (ए) इंजेक्शन के साथ किया गया था. IVIS डेटा सप्ताह के संकेत के बाद संक्रमण संख्या में संक्रमित माउस से एकत्र किए गए थे. ए) luminescence के छद्म रंग छवियों इसी समय अंक से काले और सफेद तस्वीरों पर मढ़ा गया. बी) शुद्ध रॉय संक्रमित ओल में luminescence मापने और पृष्ठभूमि रॉय घटाकर से contralateral असंक्रमित ओल रेखांकन किया गया था द्वारा निर्धारित किया गया था. तितर बितर साजिश विभिन्न समय के बाद संक्रमण बिंदुओं पर शुद्ध रॉय का प्रतिनिधित्व करता है.

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Discussion

में vivo इमेजिंग प्रणाली (IVIS) पूरे पशु इमेजिंग के लिए या लीशमनियासिस के विभिन्न रूपों के vivo इमेजिंग प्रयोगात्मक संक्रमण मॉडल में एक तरीका प्रदान करता है 18,16 लीशमैनिया एसपीपी.. परजीवी के लिए एक स्तर है कि IVIS इमेजिंग तकनीक के साथ vivo में पता चला है पर जुगनू luciferase व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है. इस विधि का प्रमुख लाभ में से एक है कि यह गैर इनवेसिव लीशमैनिया एसपीपी के दृश्य की अनुमति देता है. जीवित पशु मेजबान के अंदर. इस विधि अन्य संक्रामक रोग मॉडल के लिए किया गया आवेदन किया है, संक्रामक एजेंटों कि transgenes व्यक्त कर सकते हैं का उपयोग 20 19 इसके अलावा, IVIS एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है C57BL / 6 चूहों की त्वचा में लीशमैनिया प्रमुख संक्रमण की दवा चिकित्सा का आकलन. 16,21

वहाँ कुछ महत्वपूर्ण और निरंतर इस विधि की सीमाएं हैं. सीसीडी कैमरा के द्वारा पाया प्रकाश संकेत की ताकत डी luciferin के ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया के लिए स्तनधारी मेजबान के भीतर परजीवियों का स्थान, परजीवी में luciferase अभिव्यक्ति की शक्ति द्वारा सह कारकों की उपलब्धता के द्वारा, से प्रभावित किया जा सकता है है और प्रकाश की overlying ऊतकों द्वारा अवशोषण द्वारा. इसके अलावा, यकृत और spleens में सिग्नल की शक्ति, संभावना स्थानीय रक्त की आपूर्ति और overlying ऊतकों द्वारा शमन के कारण त्वचा में संकेत की तुलना में प्रति सेकंड परजीवी प्रति photons के स्तर पर कमजोर है. उत्सर्जित फोटॉनों की मात्रा का ठहराव के लिए समय पर, या पशुओं के बीच एक ही ऊतकों में एक ही पशुओं में प्रगतिशील संक्रमण की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 16. जब तक आगे अनुकूलित हालांकि, इन निरंतर संवेदनशीलता सीमा है और इस तरह की मात्रात्मक निर्धारण के लिए विधि की उपयोगिता visceralizing लीशमैनिया एसपीपी के साथ गहरे संक्रमण. अंत में, छवियों के लिए काले रंग में कमजोर हो सकता है (जैसे C57BL / 6) की तुलना में सफेद चूहों (जैसे BALB / ग) चूहों की संभावना है. शेविंग बाल बंद हित के क्षेत्र overlying त्वचा काले चूहों से संकेत का पता लगाने में सहायक हो सकता है.

अतिरिक्त विचार परजीवी भार का एक मात्रात्मक उपाय के रूप में IVIS मान्य करने की आवश्यकता हैं. माइक्रोस्कोपी qPCR, और IVIS के बीच तुलना कुछ मामलों में किया गया है, लेकिन रोग प्रगति के एक उपाय के रूप में विधि का उपयोग को मान्य करने के लिए प्रत्येक प्रणाली के साथ की जरूरत होगी इमेजिंग के लिए 22 16 नई विधियों उभर रहे हैं, जो युग्मित किया जा सकता है. bioluminescence छवियों. ट्रांसजेनिक परजीवी के अलावा 16, पशु मेजबान bioluminescent या फ्लोरोसेंट अणु को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है है. इस तकनीक का उपयोग करते हुए भविष्य के अध्ययन के विशिष्ट सेलुलर डिब्बों में transgenes को व्यक्त करने के लिए मेजबान रोगजनन और साथ ही साथ परजीवी में शामिल कारकों का पता लगाने पशुओं शामिल हो सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

इस काम के हिस्से में दिग्गजों मामलों के विभाग से मेरिट समीक्षा अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, एनआईएच AI045540 अनुदान, AI067874 AI076233-01 और AI080801 (MEW), और AI29646 (एसएमबी). काम के हिस्से में सीटी और JG के वित्तपोषण के दौरान एनआईएच T32 AI07511 के द्वारा प्रदर्शन किया गया था.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
D-Luciferin Potassium Salt Reagent Caliper Life Sciences 122796
IVIS Imaging System 200 Series Equipment Caliper Life Sciences Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum.

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References

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3 Comments

  1. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM
  2. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

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    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM
  3. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

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    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM

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