Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bir

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Thalhofer, C. J., Graff, J. W., Love-Homan, L., Hickerson, S. M., Craft, N., Beverley, S. M., Wilson, M. E. In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host. J. Vis. Exp. (41), e1980, doi:10.3791/1980 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Farklı türlerin

Protocol

1. Transgenik Leishmania ile küçük hayvanlar enfeksiyon

1. Parazit hatları

Transgenik Leishmania spp. lusiferaz ifade parazitler olarak bildirilen bir episomal veya entegre vektör kullanılarak üretilir. 1 2 Klon hatları tercih edilir. İki önemli noktalar şunlardır:

Teoride bu parazit çizgiler daha iyi bir memeli içine girmesinden sonra, ilaç basınç, yani yokluğunda transgen korumak beri (a) Entegre lucifeares, episomal lusiferaz tercih edilir. Ancak hatta entegre transgenlerin, stok kültür seçici uyuşturucu basıncı korumak için kritik öneme sahiptir düşük oranları, 3 kaybetmiş olabilir . Uygulamada, Leishmania spp. genellikle rağmen, hücre başına plazmid kopya sayısı değişimi, in vivo bile uzun süreler için episomal unsurlarını muhafaza 4, iki transgenik parazit türü için her zaman potansiyel ilaç etkilerini önlemek için hayvanların içine önce aşılama in vitro bir süre geçmiş olmalıdır .

(B) Leishmania spp. parazitler, in vitro kültür sırasında virülans kaybedebilir. Bazı türler (örneğin L. donovani, L. infantum chagasi) bu kayıp kültür hafta içinde hızla ortaya çıkabilir. Diğer türler (örneğin, L. major L. mexicana) virülans aylar yıllar için, uzun vadede muhafaza edilir. Bununla birlikte, küçük hayvanlar için bu istinat tam virülans klonal transfektanları tanımlamak için taranmalıdır. Birçok laboratuvar deneylerinde kullanmak için önce virülans artırmak için seri fare veya hamster ile (4 veya daha fazla) parazitler birkaç kez geçecek.

2. Enfektif metacyclic sahne parazit enfeksiyonu için hazırlanması

Leishmania spp enfektif formu. memeli konak kum sineği tarafından iletilen olduğunu metacyclic promastigote 5 Bu nedenle, parazit bu formu ile hayvan enfeksiyonları doğal enfeksiyonu bir model olarak tercih edilmektedir. Kum sinekleri korumak için zor olsa da, in vitro olarak yetiştirilen parazitler rahatlıkla metacyclogenesis uğrayacaktır. Hayvan, kültür ortamı ve parazit türleri ve suşu izole beri geçiş sayısı ile bir kültür metacyclics yüzde değişecektir.

Leishmania türleri ve hat bağlı olarak pozitif ya da negatif seleksiyon tarafından Metacyclics arındırılmalıdır. Değişiklikler ya da terminal L. bol yüzey lipophosphoglycan (LPG) yan zinciri karbonhidrat artıkları büyük lektin PNA (fıstık agglutinin) ile aglütinasyon kaybı arındırılmalıdır izin verir. 5,6 Diğer Leishmania türlerinin veya L. metacyclic LPG eksikliği büyük mutantlar Ficoll adım degrade arındırılmış olabilir. 7 IVIS toplu olmayan saflaştırılmış kültürler kullanılarak yapılabilir, ama bu metacyclic bir karışımı ve daha az bulaşıcı formlar içerdiği kabul edilmelidir.

Genellikle toplu sabit faz L.,% 15-20 i. chagasi kültürleri, hamster ve fare 3 hafta içinde izole edilmiştir parazitler kullanarak metacyclics olarak kurtarıldı . Parazitler, santrifüj ile yıkanır, istenen tampon konsantrasyonu fare inokülasyon önce 2 saat kadar, ve 4 muhafaza ° C (+ ve Mg 2 + veya Ca 2 olmadan HBSS veya PBS) asılı .

3. Leishmania spp aşılama için güzergah seçimi. hostuna

Insan leishmaniasis klinik hastalık belirtileri türlerin parazit ve konak faktörleri bağlı olarak değişir. Fare enfeksiyon ilgili farklılıklar, farklı model ve enfeksiyon yolları kullanmak için önde gelen araştırmacılar vardır. Örneğin, insan CL (örneğin, L. major L. mexicana, L. amazonensis) neden olan türlerin çoğu Kapkaççı subkutan veya intradermal kulak farelere inoküle. 8,9 Türlerin insan VL neden sık sık bir kuyruk ile intravenöz tanıtıldı ven 10-12 kulakta veya intradermal 13 Kuyruk damar enfeksiyonları ya hamster türetilmiş amastigotes veya promastigotları yapılmıştır var. Biz rutin L. promastigote formu ile enfekte fareler i. chagasi, ya intradermal kulak veya lateral tarsal bölgeye 14 veya intravenöz.

4. Tedavi öncesi anestezi ile farelerde

Wild-tip, transgenik ya da gen knockout farelerde kullanılabilir. Sayısal, resmen olmasa da, çıplak ya da albino BALB / c farelerde gibi C57BL / 6 gibi koyu cilt ve saç pigmenti ile farelere kıyasla doku sayesinde daha yüksek ışık geçirgenliği için izin verdiği en olası görünüyor.

[80-100 mg / kg + 10 mg / kg ketamin artı ksilizin bir karışımı, sırasıyla intrap Enjektabl anesthestic ajanlareritoneally (ip)] tuzlu su içinde seyreltilmesi, hayvanların tek bir doz ile en az 10 dakika için hafif anestezi olacağından tercih edilen bir yöntemdir. 100-200ul toplam hacmi 25-30 gauge iğne kullanılarak ip enjekte edilir. Hayvanlar, onların karın ile sırt cilt tarafından elle sıkıca kadar ölçülü ve baş aşağı çekti. Yukarı ve hafifçe açılı konik iğne ile yerleştirilmelidir. Iğne ucu karın duvarının sol alt kadranda sadece biraz nüfuz gerekir.

Izofluran olarak böyle bir uçucu anestezik dönüşümlü olarak kullanılan, ancak hayvanların sadece sürece, anestezik ajan teneffüs olarak anestezi altında kalacaktır.

5. Leishmania türleri ile farelerin enfeksiyonu. parazitler

Hayvanlarda hafif anestezi sonra, enfeksiyon siteleri% 70 etil veya izopropil alkol ile temizlenir. Parazit türü, dozu ve enfeksiyon rota araştırmacı tarafından belirlenir. Intradermal (10 ul) veya intramusküler (25-50 ul) enfeksiyon yolları aşırı doku hasarı önlemek için enjeksiyon hacmi minimize edilmelidir. Farelerde izin verilen enjeksiyon hacimleri intravenöz (100-200 ul), subkutan (en fazla 2 ml) veya intraperitoneal (2 ml kadar) enfeksiyon yolları için büyük olabilir.

Enfeksiyon yolları ve deneylerde kullanılan miktarlar kulak kepçesi (10 ul), subkutan kanadını (100-200 ul), intraperitoneal (100-200 ul) ya da intravenöz (100-200 ul) intradermal içerir. Parazit dozlar 10 2 10 7 promastigotları arasında değişmektedir.

2. Leishmania Bioluminescent görüntüleme (in vivo görüntüleme sistemi) IVIS kullanarak

1. In vivo bioluminescent görüntüleme için D-luciferase hazırlanması

D-luciferase (Kaliper Doğal Bilimler) veya Mg 2 Dulbecco'nun PBS içinde 15 mg / ml 'lik bir konsantrasyon sulandırılmış + ve Ca 2 filtrelenmiş + ve şırınga (0.2 mikron). Alikot -80 ° C kullanana kadar dondurulur. Enjeksiyonu öncesinde, luciferase 37 ° C su banyosunda ısıtılır.

2. D-luciferase Enjeksiyon

Enjeksiyon yeri temizlenir ve luciferase 150 mg / kg dozunda intraperitoneal DPBS bir 15 mg / ml luciferase çözüm bilinçli hayvanlar tanıtıldı. Luciferase de anestezi ile tedavi edilen hayvanların içine enjekte edilir, ancak biyoparlaklık kinetiği biraz değişebilir.

Hayvanlar enjekte luciferase hızla dolaşır. Luciferase dağıtım kinetik değişebilir çünkü ampirik olarak, her deneysel model ve farelerin farklı anatomik konumları için luciferase enjeksiyondan sonra ışıldayan veri elde etmek için en iyi zamanı belirlemek için yararlıdır. Kinetik eğrisi çoğaltmak görüntüleri bir dizi satın alarak oluşturulur.

3. Hayvanlar hafif anestezi

Uçucu veya enjektabl anestezikler görüntüleme işlemi için kullanılıyor olabilir. İsofluranın en IVIS sistemleri bağlı bir anestezi odası ve görüntüleme odasının içine anestezi burun konisi manifoldu beri, bu aşamada yönetmek için basittir. Anestezi anestezi odası ve görüntüleme odasının içine manifoldu arasında ikiye bölünmüş durumda.

Hayvanlar açık Pleksiglas anestezi odasına yerleştirilen ve% 2.5-3.5 izofluran ile hafifçe anestezi. Hayvanlar, etkin bir anestezi derecesi neden olmuştur sağlamak için görsel olarak izlenmekte ve onların nefes engelsiz olduğunu. Anestezi yeterli derecede ağrılı pençe basıncı çekilme eksikliği tarafından doğrulanmadı. Hayvanlar hafif anestezi sonrasında izofluran miktarı% 1.5-2 azalabilir.

4. Bioluminescent veri toplanmıştır.

Yeterince vanlarda anestezi odasından görüntüleme odasına transfer ve manifolduna bağlı burun konileri izofluran sürekli ve düzenli bir akışın böylece konumlandırılmış.

Living Resim yazılım programı (Kaliper Yaşam Bilimleri) açılır ve IVIS başlatıldı. Deneyler için, Xenogen IVIS 200 sistemi (Kaliper Life Sciences) kullanın. CCD kamera otomatik olarak IVIS başlatılıyor sonra uygun sıcaklıkta soğutulan ve bakımı olacaktır. Kamera sistemi kurulumu ve görüntü elde parametreleri IVIS Sistem Kontrol Paneli ayarlanır. Satın alma parametreleri, hayvan sayısı ve biyoparlaklık şiddeti büyük ölçüde dayanmaktadır. Önemli parametreler şunlardır: (parlak ya da floresan) görüntüleme modu, pozlama süresi (enstantane açık olduğu zaman), binning (CCD piksel boyutunu belirler), odak ve konu yüksekliği (odak düzlemi), f / stop (diyafram boy) view (FOV) ve saha. Önceden ayarlanmış FOVIVIS Görüntüleme Sistemi 200 Serisi için (kare görüntü bölgeler) 4, 6.5, 13, 20 ve 25 cm (FOV genişliği).

IVIS Sistem Denetimi penceresi sürekli fotoğraflar Al'ı ya da Edinme basılması, IVIS görüntü ve veri toplama başlatır. Toplama kez birkaç dakika birkaç saniye kadar uzanabilir. Deneyler için, 60 saniye varsayılan pozlama ayarı kullanın.

Close-up (küçük FOV) daha yüksek çözünürlük sağlayabilir, ama ille de gelişmiş duyarlılığı büyük bir FOV kullanılarak alınan bir görüntü.

Anestezi kurtarmak kadar görüntüleme işleminden sonra, hayvanlar, görüntüleme odasından çıkarılır kafeslerine geri döndü ve izlenir.

7. Veri analizi

Lüminesans veri Yaşayan Görüntü yazılım (Xenogen) kullanılarak analiz ve CCD kamera tarafından tespit edilen fotonların sayısı olarak ifade edilen ışık yoğunluğuna karşılık gelir. Bu veriler, hayvanların bir siyah beyaz fotoğraf, üst üste bir sözde renkli bir görüntü ile temsil edilmektedir. Görüntünün belirli alanlarda ilgi alanları (ROI) oluşturarak analiz edilebilir. The Living Image yazılımı, veri çıkış seçenekleri çeşitli sağlamaz. Verilerini analiz etmek için en basit yollardan biri faiz (ROI) bir bölge seçip # algılanır fotonlar / saniye ortalama ölçmek için. Bu veriler daha sonra, Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation) gibi bir tablolama ihraç edilebilir. GraphPad Prism (GraphPad Yazılımı) daha sonra bu el yazması için grafikler oluşturmak için kullanılır oldu.

3. Temsilcisi Sonuçlar

Özet:

IVIS teknolojisi lusiferaz ifade Leishmania spp görselleştirme sağlar. anestezi BALB / c farelerde gerçek zamanlı olarak yaşayan parazitler. Substrat luciferase dokular aracılığıyla dağıtır sonra, transgenik parazitler tarafından ifade lusiferaz D-luciferase hızlı oksidasyon yayılan ışık neden olur. Doku tarafından emilir fotonlar hayvanın yüzeyinde IVIS görüntüleme teknolojisi CCD kamera tarafından tespit edilir.

1. Insan visseral karşı insan kutanöz leishmaniasis yol açan parazitler enfeksiyon Modelleri.

Enfeksiyonun ilerleme değerlendirilen her zaman noktada farelerin grupların ötenazi gerektirir visseral leishmaniasis sıçan modellerinde, kutanöz leishmaniasis modellere göre daha sorunlu. IVIS bir sınırlama ışık emisyonları farklı visseral dokularda değişik derecelerde söndürülür ve yüksek kan akışı ile karaciğer ve dalak gibi dokularda cildin daha sorunlu olabilir. Bu nedenle, IVIS tespiti gibi hassas olmayabilir lusiferaz eksprese parazitleri, cilt, karaciğer ve dalak. Aynı zamanda parazit yükleri doku siteler arasında karşılaştırıldı gerektiğini tavsiye edilir. Bununla birlikte, aynı dokularda parazit yükleri aynı gerginlik yaş eşleştirilmiş enfekte olmuş fareler arasında mukayese edilebilir.

Lusiferaz sinyal hayvanlar arasında kolayca enfeksiyon karşılaştırılması kolaylaştırılması, deneylerde visseral organlarda tespit edildi. 5 haftalık bir enfeksiyon insan visseral leishmaniasis, Li neden lusiferaz ifade parazit ile bir örnek. chagasi SSU/IR1SAT-LUC (A), Şekil 1'de gösterilmiştir. 5 hafta sonra enfeksiyon, visceralized parazitler tüm farelerin karaciğerinde ve 1 ve 2 farelerin dalak tespit edilebilir. Şekil 2'de aynı parazit hattı, parazit girişten sonra bir saatlik bir doz titrasyon gösterir. Uzunlamasına bir enfeksiyon bir örnek insan kutanöz leishmaniasis, L. neden olan parazitler mexicana SSU/IR1SAT-LUC (A), Şekil 3'te gösterilmiştir.

2. Lusiferaz algılama kinetiği.

Ön kinetik çalışmaları bioluminescent parazitler yayılan fotonların algılama en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Optimal görüntüleme süresi muhtemelen parazit sayısı ve parlaklık izole ve farelerde Işıklı mikroorganizmaların anatomik konuma göre değişir gibi, ampirik olarak belirlemek için önemlidir. Kinetik çalışmaları luciferase dokular boyunca dağıtım, Leishmania lusiferaz-ifade barındıran fare doku ve parazitin izole her lusiferaz ifade / enzim aktivitesi verimlilik oranı bağlıdır. Fare ve luciferase inoküle enfekte yukarıda açıklandığı gibi, görüntüleri, bir dizi luciferase enjeksiyon sonrası her 2 dakikada bir toplanır. Yayılan ışık büyüklüğü sayısal ve maksimum algılama noktası belirlemek için (Şekil 1B örneğe bakın) grafikle ifade ettik. Maksimum ışık algılama süresi belirlendikten sonra, deney tüm görüntüleri Şekil 1A, luciferase inokülasyonu sonra görüntüleme aynı zamanda kullanmalıdır. Bizim kinetik çalışmalarıL. ile iv bulaşmış farelerin karaciğer bir zirve lusiferaz sinyal gösterdi i. chagasi 10 ila 25 dakika sonra ip luciferase aşılama (Şekil 1B).

3. Parazit inokülasyonu etkinliğini değerlendirmek.

IVIS Leishmania spp lusiferaz-ifade ile ilk enfeksiyon uyum ve etkinliğini tahmin etmek için kullanılan olabilir. Sürece aynı rota her bir hayvan için kullanıldığı gibi, yayılan fotonlar aşılama etkinliğinin kaba bir tahmin olarak kullanılabilir. BALB / c farelerde metacyclic L. belirtilen numaraları ile inoküle edildiği bir örnek, Şekil 2'de gösterildiği gibi i. chagasi promastigotları, Leishmania bir visceralizing türler. Bir saat sonra enfeksiyon fareler luciferase ip ile ekildi ve 20 dakika sonra görüntüleri alındı. Bu rakam, sadece siyah ve beyaz görüntü (Şekil 2A) ve sözde renkli lüminesans (Şekil 2B) ile üst üste görüntü gösterir. Şekil 2C fare görüntüleri ilgi seçilen bölge (ROI) fotonların sayısını gösterir.

Şekil 2'de örnek enfeksiyon dozu parazitlerin artan sayıda fotonların tonlama ile doğru orantılı olduğunu göstermektedir. Veri L. benzer olduğunu göstermektedir majör ve L. mexicana, Leishmania türleri ile deri enfeksiyonları görüntüleme. 10 4 daha az parazit açıkça görüntülenmiştir izin vererek, çok hassastır. Bu gibi veriler, enfeksiyon yoğunluğunu ölçmek için kullanılan olabilir. Şekil 2B gösterilen örnekte, yaklaşık 1 fotonlar / sn / parazit vardır.

4. Farelerde enfeksiyon ders izlenmesi.

Kutanöz leishmaniasis sıçan modellerinde enfeksiyonları boyuna takip için bir tedbir olarak karakteristik lezyon büyüklüğü kullanın. Hastalığın ilerlemesi iyi bir tahmin olsa da, lezyon büyüklüğü dokularda parazit çoğaltma oranına ek olarak inflamatuvar yanıtın derecesi ile etkilenir. Fareler aslında parazit yükünü ölçmek için deney sonunda ötenazi olmalı. IVIS kutanöz leishmaniasis neden olan Leishmania türleri ile enfekte farelerde deri dokusunda boyuna parazit yüklerin ilerlemesini tahmin etmek için kullanılan olabilir . Şekil 3'te gösterildiği gibi, 10 5 L. ile BALB / c farelerde gün 0 subkutan ekildi mexicana enfeksiyon sonrası ardışık hafta lusiferaz ve görüntülü dile getirdi. Şekil 3A enfeksiyondan sonra 10-31 hafta temsilcisi görüntüler sergiler. Aynı veriler Şekil 3B nicel şeklinde gösterilmiştir. Önemlisi, diğer yöntemlerle bir lezyon saptanabilir önce enfeksiyon yerinde parazitler numaraları IVIS sayılabilir veriler.

Zamanla, biyoparlaklık ilerici artış parazit sayıda artışa tekabül etmektedir. Sinyal gücü, yani fotonlar / saniye / parazit, in vivo parazit numaraları fonksiyonu, doku konumu, büyüme aşamasında ve parazit sağlık olarak değişebilir. Parazitler ve lüminesans arasındaki ilişki bu biyoparlaklık numaraları parazit doğrudan orantılıdır üstlenmeden önce kalibre etmek için bu nedenle önemlidir. L. durumda büyük 15 ya da L. promastigotları göre haydut lezyonlar içinde mexicana, 16 amastigotes biyoparlaklık nispeten küçük zayıflama için varmış gibi görünür. Ön veriler, zayıflama L. için daha derin olabileceğini düşündürmektedir chagasi infantum 17 veya L braziliensis 15

Şekil 1
Şekil 1. Lusiferaz algılama Kinetiği Kinetik analiz luciferase dağıtım karaciğer görüntüleme Leishmania enfeksiyonunun için en uygun zaman kurmak için yapıldı. Fare iv 10 7 L. ile enfekte olmuş i. chagasi pIR1SAT LUC (A). A) Dört enfekte olmuş fareler enfeksiyon 5 hafta sonra bir bulaşmamış fare ile birlikte görüntülenmiştir. Luciferase 24 dakika boyunca her iki dakikada bir toplandı beş fare ve görüntü içine ip enjekte edildi. ROI seçildi ve lüminesans (B) ölçülen ve sayısal olarak ifade edildi.

Şekil 2
Şekil 2. Görüntüleme parazit inokülasyon verimliliğinin değerlendirilmesi ve IVIS ile enfeksiyon sırasında bioluminescent Leishmania parazitleri ölçülmesidir. Wild-tip BALB / c farelerde HBSS (alay) veya transgenik Leishmania i. ile sağ alt kanadını da intradermal enjekte edildi chagasi L. i. chagasi pIR1SAT LUC (A). Fareler aşılama sonra IVIS görüntüleme teknolojisi bir saat sonra incelendi. A) farelerin siyah ve beyaz fotoğraf Işıklı sinyal (ışık şiddeti) ölçüldü hemen önce çekildi. Kırmızı oklar her enjeksiyon yerindehayvan. B) lüminesans sözde renkli görüntü, fotoğraf, üst üste oldu. C) faiz Bölgeler (ROI) seçilmiştir (kırmızı daireler) ve lüminesans her ROI sayısal oldu. Veri enfekte yatırım getirisi eksi enfekte alay yatırım getirisi net lüminesans temsil eder.

Şekil 3
Şekil 3. Insan kutanöz leishmaniasis neden olan bir parazit ile uzun vadeli bir enfeksiyon. Bioluminescent Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A) enjekte tek bir hayvan parazit yükünün Zaman ders değerlendirme. Yabani tip BALB / c fare 100.000 sabit faz transgenik Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A) ile hock subkutan enjekte edildi. Hafta belirtilen sayı sonrası enfeksiyon enfekte fare IVIS veri toplanmıştır. A) lüminesans Pseudo-renkli görüntüler siyah ve beyaz fotoğraflar üzerine ilgili zaman noktalarında üst üste. B) net yatırım getirisi enfekte hock lüminesans ölçme ve kontralateral bulaşmamış hock grafikle ifade ettik arka plan ROI çıkarılarak tarafından tespit edildi. Scatter plot çeşitli zaman noktalarında enfeksiyon sonrası net yatırım getirisini temsil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo görüntüleme sistemi (IVIS) bütün hayvan görüntüleme için, ya da farklı formlarda leishmaniasis in vivo görüntüleme deneysel enfeksiyon modellerinde bir yöntem sağlar. 18,16 Leishmania spp. parazitler ateşböceği lusiferaz IVIS görüntüleme teknolojisi ile in vivo olarak algılanır bir düzeyde ifade etmek için tasarlanmış olabilir. Bu yöntemin en önemli avantajlarından biri, Leishmania spp non-invaziv görüntüleme sağlar . canlı hayvan vücudunun içinde. Bu yöntem, transgenlerin ifade edebilir enfeksiyöz ajanlar kullanılarak, diğer bulaşıcı hastalık modellerinde uygulanan olmuştur. 19 20 Ayrıca, IVIS Leishmania major enfeksiyon ilaç tedavisi C57BL / 6 farelerin deri değerlendirmek için bir model olarak kullanılır olmuştur. 16,21

Bu yöntemin bazı önemli uyarılar ve sınırlamalar vardır. CCD kamera tarafından algılanan ışık sinyalinin gücü D-luciferase oksidasyon reaksiyonu için, ko-faktörler durumu parazitler lusiferaz ifade gücü ile parazitlerin konak memeli içinde yerini, tarafından etkilenir ve dokular tarafından ışık emilimi. Ayrıca, karaciğer ve dalak sinyal gücü saniyede parazit başına düşen fotonların düzeyinde, yerel kan akımı ve dokular tarafından soğutulması için muhtemelen nedeniyle deride sinyal daha zayıftır. Niceleme fotonların, zaman içinde, ya da hayvanlar arasında aynı doku tek bir hayvan ilerici enfeksiyon karşılaştırmak için kullanılır. 16 daha fazla optimize kadar Ancak, bu uyarılar kantitatif değerlendirilmesi için duyarlılık sınırı ve bu yöntemin yararı olacak visceralizing Leishmania türleri ile derin enfeksiyonlar. Son olarak, görüntüleri fareleri beyaz daha (örneğin BALB / c) farelerde (örneğin C57BL / 6) siyah zayıf olması muhtemeldir. Saç kapalı cilt Tıraş ilgi alanı örten siyah farelerden alınan sinyal saptanmasında yararlı olabilir.

Ek hususlar parazit yükleri bir miktar ölçüsü olarak IVIS doğrulamak için ihtiyaç vardır. Birkaç örneğini mikroskopi, qPCR ve IVIS arasındaki karşılaştırmalar yapılmış, ancak hastalığın ilerlemesi bir tedbir olarak yöntemin kullanımı doğrulamak için her bir sistem ile gerekli olacaktır. Akuple olabilir 22 16 görüntüleme için yeni yöntemler ortaya çıkmaktadır biyoparlaklık görüntüler. transgenik parazitlerin yanı sıra 16, hayvan sahipleri bioluminescent ya da floresan moleküller ifade için tasarlanmış olabilir. İleride yapılacak çalışmaların bu tekniği kullanarak, patogenezi ve aynı anda parazitler dahil konak faktörleri tespit etmek için spesifik hücresel bölümlerinde transgenlerin ifade hayvanlar içerebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH hibe AI045540 AI067874 AI076233-01 ve AI080801 (MEW), ve AI29646 (SMB), Savaş Gazileri İşleri Bölümü Merit İnceleme hibe ile finanse edildi. NIH T32 AI07511 BT ve JG finansman sırasında kısmen yapıldı.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
D-Luciferin Potassium Salt Reagent Caliper Life Sciences 122796
IVIS Imaging System 200 Series Equipment Caliper Life Sciences Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capul, A. A., Barron, T., Dobson, D. E., Turco, S. J., Beverley, S. M. Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major. J Biol Chem. 282, 14006-14017 (2007).
  2. LeBowitz, J. H., Coburn, C. M., McMahon-Pratt, D., Beverley, S. M. Development of a stable Leishmania expression vector and application to the study of parasite surface antigen genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9736-9740 (1990).
  3. Mureev, S., Kushnir, S., Kolesnikov, A. A., Breitling, R., Alexandrov, K. Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers. Mol Biochem Parasitol. 155, 71-83 (2007).
  4. Chakkalath, H. R. Priming of a beta-galactosidase (beta-GAL)-specific type 1 response in BALB/c mice infected with beta-GAL-transfected Leishmania major. Infect Immun. 68, 809-814 (2000).
  5. Sacks, D. L., Perkins, P. V. Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science. 223, 1417-1419 (1984).
  6. da Silva, R., Sacks, D. L. Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania promastigote virulence and attenuation. Infect Immun. 55, 2802-2806 (1987).
  7. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99, 97-103 (2001).
  8. Scott, P., Caspar, P., Sher, A. Protection against Leishmania major in BALB/c mice by adoptive transfer of a T cell clone recognizing a low molecular weight antigen released by promastigotes. J Immunol. 144, 1075-1079 (1990).
  9. Belkaid, Y. The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile cure. J Exp Med. 194, 1497-1506 (2001).
  10. Wilson, M. E. Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi. J Immunol. 156, 2231-2239 (1996).
  11. McElrath, M. J., Murray, H. W., Cohn, Z. A. The dynamics of granuloma formation in experimental visceral leishmaniasis. J Exp Med. 167, 1927-1937 (1988).
  12. Ato, M. Loss of dendritic cell migration and impaired resistance to Leishmania donovani infection in mice deficient in CCL19 and CCL21. J Immunol. 176, 5486-5493 (2006).
  13. Ahmed, S. Intradermal infection model for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis. Infect Immun. 71, 401-410 (2003).
  14. Kamala, T. Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections. J Immunol Methods. 328, 204-214 (2007).
  15. Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cell Microbiol. 7, 383-392 (2005).
  16. Brittingham, A., Miller, M. A., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Regulation of GP63 mRNA stability in promastigotes of virulent and attenuated Leishmania chagasi. Mol Biochem Parasitol. 112, 51-59 (2001).
  17. Roy, G. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Mol Biochem Parasitol. 110, 195-206 (2000).
  18. Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
  19. Hardy, J., Margolis, J. J., Contag, C. H. Induced Biliary Excretion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 74, 1819-1827 (2006).
  20. Lecoeur, H. Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model. PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).
  21. Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. Imaging Leishmania development in their host cells. Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).

Comments

3 Comments

  1. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM
  2. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM
  3. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics