げっ歯類からプライマリ大人の線維芽細胞培養の確立

Biology

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Summary

この記事では野生のげっ歯類の皮膚および肺組織からの初代線維芽細胞培養物の分離および保守のためのプロトコルについて説明します。

Cite this Article

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Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

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Abstract

生物学的研究のために、初代培養細胞ではなく癌細胞株を使用することの重要性は広く認識になりつつあります。がん細胞は、これらのプロセスに関与する遺伝子の変異を運ぶように主細胞は、細胞周期の制御、アポトーシス、およびDNA修復の研究で好まれている。初代細胞は無限に複製老化または異数性発現の発現のために培養することができません。したがって、新しい文化は、定期的に確立する必要があります。齧歯類の胚性線維芽細胞の単離のための手順は十分に確立されているが、成人線維芽細胞培養を単離することはしばしば課題となっています。ヒトの患者から線維芽細胞にそれらを比較するときに、ヒト疾患のモデルマウスから分離された成体げっ歯類の繊維芽細胞は、優先制御があります。妊娠中の女性を容易に得ることができない野生のげっ歯類を操作するときまた、成人線維芽細胞でのみ利用可能な材料です。ここでは、げっ歯類の皮膚や肺から成人線維芽細胞の単離および培養のためのプロトコルを提供しています。我々は、実験用マウスおよびラットからそのようなビーバー、ヤマアラシ、やリスなどの野生げっ歯類20種のげっ歯類上から線維芽細胞を分離するためにこのプロシージャを正常に使用する。

Protocol

1。始める前に

  1. 70%エタノールではさみや鉗子を滅菌する。
  2. 30mLのビーカー、箔の2層にカバーし、オートクレーブ内部の小さなマグネチックスターラーを置きます。
  3. 滅菌水で28ワンチユニット/リベラーゼBlendzyme 3 mLの原液を準備します。 -20℃で0.5 mLを分注して凍結を行うあらゆる使用の前に新しいアリコートを解凍。解決策は融解後、混濁している場合があります。渦解が明確になるまで。
  4. 細胞培養培地をウォームアップ。

2。動物サンプルの調製

注意 :野生動物が狂犬病ウイルスなどの病原体が含まれることがあります。常にオープン鋭利に注意してください。

  1. 動物を安楽死させると4で死体を置く℃に動物はフィールドで収集されているかのようにこのような実用的でない場合、それは、しかし、すぐに死体を使うのが最善である、死体は24時間以内に使用することができます。 24時間後の細胞収率が低下する。
  2. (ではない組織培養フードの)手術室で、または化学フードで動物を解剖。
  3. 脇の下エリアでは、脇の下の皮膚が薄くなるように、脂肪分が含まれている皮膚のサンプルを収集するのに便利なサイトです、そして毛皮は密度が低いです。 70%エタノールで切開部位を清掃してください。毛皮は、エタノールに浸したされていることを確認します。
  4. 鋭いメスで切開部位の周りに毛皮を剃る。希望の切開部位よりも大きい領域にひげをそる。皮膚へのカットを最小限に抑えるようにしてください。 70%エタノールで面積をスプレーし、乾燥させます。
  5. 皮膚サンプルの消費税の約1 cm 2の断片を収集する。組織鉗子で皮膚をつまんで、はさみで切る。脂肪は、コラゲナーゼ消化を妨げるとして、皮膚と脂肪層を切らないようにしてみてください。肺のサンプルを収集するには、70%エタノールで胸の部分を洗浄し、T字型の切開を行うと皮膚のフラップを離れて引っ張って、ハサミで胸の皮膚を開きます。 70%エタノールで開かれた筋肉のエリアを洗い、乾燥させる。滅菌ピンセットやハサミを使用して胸郭をカット(大型動物のために骨のカッターを使用)。内臓の汚染を避けるために、無菌技術を使用してください。動物の毛皮を触る楽器で内臓を触れないでください。滅菌ピンセットやハサミを使って約1 cm 2の肺の断片をカット。
  6. 乾燥を避けるために滅菌PBSで50 mLチューブに場所の組織片。
  7. エタノールによる組織片を50 mLチューブの外側を洗浄し、組織培養フードにそれらを取る。
  8. 適切に動物の死体を処分。

3。抽出セル

  1. 滅菌メスを用いて10 cmの組織培養皿に組織片を転送する。サンプルであまりにも多くのPBSを転送しないでください。
  2. twoメスを用いて〜1mmの部分にティッシュを切る。シザー作用中心から開始して離れて引っ張っを使用して2つのブレードを使用してください。組織は、ピース単位でカットしていない、まで丸めたしてください。皮膚のパテに似てカットが十分であるときに、それは部分に分離することはありませんが薄いストレッチされます。肺組織では、カットする方が簡単です、そしてそれは、小さな断片に分割します。
  3. メスを使用して、滅菌攪拌棒で滅菌30mLのビーカーにカット組織を移す。 / 0.14ワンチ単位mLのリベラーゼBlendzyme 3、および1X抗生物質/抗真菌剤でDMEM/F12メディアの10mLで組織の切断に使用されるプレートを洗浄し、組織片を30 mLのビーカーにソリューションを追加。
  4. 無菌箔でビーカーをカバーし、30〜90分間、ゆっくり攪拌し、37℃でインキュベートする。インキュベーションの長さは、種や組織型によって異なります。組織を過剰に消化しないように注意してください。組織片は、消化の終わりにまだ存在しているときに最高の収率が得られる。皮膚は肺よりも消化に時間がかかります。大型動物からの皮膚は、消化に時間がかかります。 30分後に消化し、10分ごとに確認してください。皮膚の消化が完了すると、メディアは曇りと互いに別々の皮膚の断片になり、作品の端は"ファジー"になる。肺の断片が赤から白への色を変更し、粘着性繊維を形成する起動時に肺消化を停止する必要があります。
  5. ピペットで塊を破壊するために上下組織断片を含む溶液を。滅菌50 mlチューブにソリューションを転送する。フラグメントは、10 mLのピペットの先端と消化によって容易に移動する場合はよく行われていた。 15%FBS、抗生物質/抗真菌剤1Xと暖かいDMEM/F12メディアの10mLでビーカーを3回リンスし、組織片を50 mLの試験管にメディアを追加します。 50 mLのチューブと反転数回転倒混和を閉じます。メディアのFBSは、リベラーゼ消化を停止します。
  6. 5分間、スイングバケット組織培養の遠心機で524グラムで回転する。上清を取り除く。 15%FBS、1X抗生物質/抗真菌剤で暖かいDMEM/F12メディア10mLにペレットを再懸濁する。ピペットでサスペンション付き組織片を破壊する力の最大値を設定します。
  7. 15%FBS、1X 5分間スイングバケット組織培養の遠心機で524グラムで、抗生物質/抗真菌剤、混合および遠心機でDMEM/F12メディアの別の30 mLを加え。リベラーゼの痕跡を削除する1つより多くの時間を繰り返します。
  8. 37 1X抗生物質/抗真菌剤および組織培養インキュベーターで10 cmの組織培養皿と場所への転送、15%FBSとDMEM/F12メディア10mLにペレットを再懸濁します° C、5%CO 2、3%O 2
  9. 板の線維芽細胞とメディアの色のための毎日をチェックしてください。分離が成功した場合、線維芽細胞は組織片からはい出るとプレート(図1)に取り付けます。線維芽細胞は2-5日以内に組織片を終了し始めます。
  10. 黄色へのメディアの色が変化した場合、これは潜在的な汚染またはセルの過密を示します。高倍率での顕微鏡でプレートを調べます。細菌、真菌、またはワームは、現在のプレート(これはほとんどの実験動物との問題がない、しかし、サンプルが野生から収集中に発生する可能性がある)破棄されている場合。ない汚染が存在しなくても、メディアが色を変更した場合、これはあまりにも多くの細胞や同じ皿に置かれた非常に多くの組織片のどちらかが原因です。プレートの60%以上が添付された線維芽細胞によって覆われている場合は、プレート上でメディアを変更し、新しいメディアと新しいプレートに組織片を転送する。プレートに接続されていない多くの線維芽細胞の場合、メディアを変更すると2-4プレートに組織片を分割。
  11. メディアが先に変更されていた場合、7日後、、メディアを変更し、新しいメディアと新しいプレートに組織片を転送する。
  12. 追加の7日間の細胞および組織断片をインキュベートする。 14日目では、すべての実行可能な線維芽細胞は、組織断片を終了した。
  13. 細胞分離の初めから14日後、古いメディアと組織断片を破棄、5 × 10 5細胞/プレートで、新しいプレートに15%FBS、1Xペニシリン/ストレプトマイシンをEMEMを細胞やプレート、それらを収穫する、非必須アミノ酸、およびナトリウムピルビン酸。 EMEMのメディアは、他の種類の細胞が死ぬか、増殖を停止される線維芽細胞の成長をサポートします。
  14. 細胞が80〜90%コンフルエントに達した後、将来の使用のための細胞のアリコートを凍結する。
  15. 細胞が80〜90%コンフルエントに達したときに5 × 10 5細胞/プレートで分割しで培養細胞を続ける。

4。代表的な結果

正常な線維芽細胞は顕著な突起(葉状仮足)(図2)を持つ大規模な細胞である。線維芽細胞は単層で増殖。健全な成長の文化は、Mステージの1-10%の細胞が含まれていますように板の表面上に上昇して細胞を切り上げ、ただしプレート(図3)からデタッチされていない認識。通常は、5 × 10 5細胞を接種した10cmディッシュは3-4日でコンフルエントになる。倍加時間は、種間で大きく異なり、そして長寿命のげっ歯類1のいくつかのために大きくなることがあります。細胞は彼らがG1の舞台での増殖を阻止プレートを入力するとき。線維芽細胞の典型的なコンフルエントプレートは、細胞(図4)の密集層が含まれています。細胞が90%コンフルエントに達すると、彼らは、分割するための準備が整いました。必要に応じて、細胞は通常のメディアの変更(週1〜2回)で長時間のための逮捕コンフルエントプレート上で維持することができます。

図1
図1。マウスの皮膚()と肺(B)から線維芽細胞の分離。メディアは7日目で写真を撮る前にアタッチされていない細胞と破片を除去するために変更されました。

図2
図2。マウスの肺線維芽細胞。

図3
図3。 10倍の倍率で撮影したM - STAGE内の細胞を含むマウスの線維芽細胞のフィールド、。

図4
図4。 10倍の倍率で撮影したマウス線維芽細胞のコンフルエントプレート、。

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Discussion

通常の主な線維芽細胞は、生物学の研究で​​確立された癌細胞株に対する優れた代替手段を提供しています。線維芽細胞の重要な利点は、彼らが癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の変異を運ぶし、無傷の細胞周期チェックポイントを維持していないということです。これは正常な線維芽細胞周期調節、DNA修復、およびアポトーシスの研究に適したシステムです。ここで説明するプロトコルは、分離と一次線維芽細胞の維持のための簡単​​なレシピを提供します。このプロトコルが正常にげっ歯類の20種以上から線維芽細胞を単離するために使用されました。

汚染を避けるために、細胞培養での作業を常に無菌状態を維持することが重要です。研究所はまた、文化など、HeLa細胞などの積極的な癌細胞株をした場合、線維芽細胞はがん細胞とは別に処理する必要があります。それは、初代培養のための指定されたフードとインキュベーターを有することが好ましい。

それは3%の生理的な酸素濃度での初代細胞培養を維持することが望ましい。大気(20%)の文化と増加酸化ストレスの酸素が短く寿命。マウス線維芽細胞は酸化ストレスに敏感であり、20%(大気)酸素で維持したとき〜14集団倍加内の危機を老化するか入力します。マウスの線維芽細胞を3%の酸素2で無期限に維持することができます。

常に文化の集団倍加数の記録を保持。大型種は、(8000グラム上記の体重)にも3%酸素1で、複製老化を示す可能性が高い、そして文化の中で限られた寿命を持つことになります。マウスやラットなどの小型の種からの細胞は、、3%酸素で無限に増殖するでしょうが、最終的には異数体になることがあります。可能であれば、低い人口の倍増で細胞を使った実験を始める。

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Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgements

我々は、このプロトコルの最初のバージョンをご提供するためスティーブンAustadに感謝。この作品は、NIHとエリソン医学財団からVGへの補助金によってと同様にサポートされて

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

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References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

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