المفرد جزيء التصوير النقل النووية

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

approch قدم واحدة جزيء المجهري رؤى الرواية إلى النقل النووي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Goryaynov, A., Sarma, A., Ma, J., Yang, W. Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport. J. Vis. Exp. (40), e2040, doi:10.3791/2040 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد ثبت جدوى النهج جزيء المجهري مضان واحد لتكون ذات جدوى كبيرة في فهم التفاعلات البيولوجية على مدى العقد الماضي. وظل التحقيق في التفاعلات الجزيئية مع ارتفاع قرارات الزمانية والمكانية عميقة داخل الخلايا صعبة بسبب إشارات ضعيفة بطبيعتها الناشئة من الجزيئات الفردية. يعمل يانغ مؤخرا وآخرون. أثبتت أن ضيق المجال المجهري epifluorescence التصور يسمح للنقل النواة للهيولى على مستوى الجزيء واحد. من النهج جزيء واحد ، حركية مهمة ، مثل النقل النووي الوقت والكفاءة ، لجزيئات البضائع التي تعتمد على إشارة ومستقلة قد تم الحصول عليها. وصف نحن هنا بروتوكولا للنهج المنهجي مع القرار ، أي spatiotemporal تحسين نانومتر و 12 مللي 0.4. مكن قرار تحسين لنا لالتقاط النقل النشط والأحداث العابرة نشر السلبي من خلال مسام المجمعات النووية (مجلس الشعب) في شبه سليمة الخلايا. نتوقع أن يستخدم هذا الأسلوب في توضيح الأحداث الأخرى ملزمة والاتجار داخل الخلايا.

Protocol

1. إعداد نظام الخلية لتجربة جزيء واحد

  1. أسبوع واحد على الأقل في وقت مبكر ، وبدء ثقافة جديدة من خط الخلية هيلا من الأسهم من قبل ذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية ، ووضع في قارورة 25 سم 2 مع الثقافة وسائل الإعلام 5 مل ، احتضان الخلايا على 37 درجة مئوية في غضون 5 ٪ CO 2 حاضنة لمدة 24 ساعة ، وتقسيم ما لا يقل عن 3 مرات من أجل توفير الظروف المثلى للخلايا. لكن لا ينبغي أن الخلايا يمكن تقسيم أكثر من 20 مرات بسبب الميل معدل نموها إلى تباطؤ ملحوظ. كانت في السابق هيلا خلايا معدلة وراثيا ليكون GFP (ببروتين أخضر) تنصهر في البروتين المغلف مسام الغشاء النووي POM 121. فمن الضروري لتوطين دقيقة من المغلف النووية.
  2. قبل يوم واحد على التجربة ، ينبغي انتشار خلايا المعدة للتجربة جزيء واحد على تغطية زلة تعقيمها توضع في طبق بتري معقمة. وينبغي تعليق ساترة في DMEM (وسط Dulbecco لتعديل النسر ، وغراند ايلاند ، نيويورك) تستكمل مع 4.5 جم / لتر جلوكوز ، و 862 ملغم / لتر GlutaMAX - I ، 15 ملغ / مل أحمر الفينول ، 100 U / مل البنسلين ، 100μg/mL الستربتوميسين و 10 ٪ مصل العجل الوليد. وينبغي أن حجم ثقافة 1mL يكون لكل زلة تغطية ، وزعت بشكل موحد في جميع أنحاء السطح. هذه أطباق بتري مع زلات تغطية ثم يتم وضعها في حاضنة 2 أكسيد الكربون والاحتفاظ بها لمدة 24 ساعة قبل التجربة. من أجل ثقافة الخلية لتكون مناسبة لإجراء تجربة جزيء واحد يجب أن الخلية confluency على زلة تغطية لا تتجاوز 70 ٪ لتوفير حرية مخازن جيدة للغسل والبروتينات ذات الاهتمام تمر النقل النووي.
  3. في يوم من التجربة ، وشيدت تدفق الغرف بإضافة الغطاء العلوي زلة مع سطرين من الشحوم سيليكون والفواصل. فمن الضروري للتأكد من أن الخلايا لا تجف أثناء التحضير. نحن نفضل عادة أن يكون أدلى مجلسين واحد للسماح للتغطية زلة شرطين مختلفة للتجربة. الغطاء العلوي زلات شظايا صغيرة من الزجاج زلة تغطية قطع بسكين الماس لتكون وضعت حوالي 6mm2 رأسا على عقب على Kimwipe. وضعت بدقة سطرين من الشحوم سيليكون على طول حواف انه ينزلق الغطاء مع حقنة بلاستيكية 10 مل أن تلقوا بلاغا ماصة تعلق وثيق مع Parafilm للتحكم في حجم حبة الشحوم.
  4. ثم كانت الشريحة هيلا الخلايا المغلفة بالتنقيط المجفف ومزودة الشحوم والغراء في إطار الألومنيوم المنزلية تشكيله -- المزاج ، والتي أدت إلى عقد الشريحة في المجهر صاحب العينة.
  5. واختير ثم ينزلق الغطاء العلوي مع هذين الخطين من الشحوم حتى مع ملاقط أشار ثم مقلوب فوق الشريحة الخلية المغلفة ، وتشكيل غرفة التدفق. وقدم مرفق ثابتة نسبيا عن طريق الضغط بلطف على حواف مدهون من ساترة.
  6. التي قطعناها على أنفسنا منذ غرفتين منفصلتين على الشريحة الخلية المغلفة يجد من الضروري توفير ختم جيدة لمنع النشطاء من التلوث. لهذا الغرض تم تطبيق عدة أسطر من الشحوم في سيليكون بين الغرف من أعلى إلى أسفل الشريحة لختم إربا. كما وضعت عدة أسطر من الشحوم على الجانبين الخارجي للغرف.
  7. ثم أضيف DMEM سائل الاعلام الى الغرفة لمنع تدفق الخلايا من الجفاف. تمت ترقية التدفق حل عن طريق ورقة صغيرة قطعة فلتر لامتصاص السوائل من الجانب الخروج من الغرف التدفق. بأيد ثابتة ، يمكن إضافة الحل في وقت واحد بواسطة micropipette إلى جانب واحد من الغرفة ، مع تدفق من جهة ، واستوعبت على الجانب الآخر بواسطة ورق الترشيح.
  8. بعد البناء ، وجرفت الجزء السفلي من الشريحة مع مسحة القطن المبللة ذات الرؤوس ، ومرتين مع الماء ، وبعد ذلك مرتين مع الإيثانول بنسبة 100 ٪
  9. مرة واحدة هي التي شنت الشريحة على المجهر ، والخلايا غسلها 2 X 25 العازلة استيراد ميكرولتر (Hepes 20 ملي و 110 ملي KOAc ، 5 ملي NaOAc ، 2 مم MgOAc ، 1 ملم EGTA ، ودرجة الحموضة 7.3). الخلايا permeabilized ثم لدقائق مع 2 ~ 2 X 25 ميكرولتر ديجيتونين ميكروغرام / مل 40 في المخزن الاستيراد وغسلها مرة أخرى مع 2 X 25 العازلة استيراد ميكرولتر (HEPES 20 ملي و 110 ملي KOAc ، 5 ملي NaOAc ، 2 مم MgOAc ، 1 ملم EGTA ، ودرجة الحموضة 7.3) تستكمل مع بوفيدون 1.5 ٪ (PVP ؛ كيلو دالتون 360). قد يكون من الضروري رصد permeabilization في الوقت الحقيقي باستخدام الحقل مشرق. أدرج PVP في جميع الحلول العازلة الاستيراد بعد ديجيتونين لمنع تورم التناضحي من النوى. نواة سليمة ، جنبا إلى جنب مع بيئة يسيطر حشوية ، ويوفر نظام نقل تبسيطها إلى حد كبير أن يسمح لنا توضيح معقدة النقل النووي خطوة خطوة. وقدمت الفرقة السابقة واحدة جزيء التجارب التي أجريت في منظومة الافكار العظيمة في مجال النقل النووي.

2. إعداد البروتينات ضرورية لتجربة النقل النووي

  1. عن طريق التحول الجرثومي التقليدية كانت قد صممت على سلالات خاصة من القولونية (JM109) من أجل overexpress الجينات المسؤولة عنيتم الاحتفاظ انتاج البروتينات المذكورة من الاهتمام وفي المخزون في -80 درجة مئوية. (للحصول على 2xGFP - NLS كنا pTrcHisB بواسطة ناقلات Invitrogen). ويتم نقل أو loopful ~ 50 ميكرولتر من الأسهم المجمدة للبروتين فلوري أو البضائع معربا عن الخلايا كولاي 5mL إلى وسائل الإعلام LB مع اضافة 5μL من الأمبيسيلين (U 1000) ونمت مع اهتزاز هوائيا ليلا 37 درجة مئوية في 225 دورة في الدقيقة.
  2. بعد 24 ساعة يتم نقل 500 ميكرولتر الثقافة المشبعة في 500 مل من وسائل الإعلام LB واهتزت في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعات بعد إضافة 250 IPTG ميكرولتر (الآيزوبروبيل _ - D - 1 - thiogalactopyranoside) والمحتضنة لآخر 5-6 ساعات. فمن الضروري لIPTG هو المستقلب اللاكتوز الذي يقوم بتشغيل ثم يتم استخدام النسخ من operon لبن ، حيث يتم استبدال الجينات الجين lacZ مع المصالح وIPTG للحث على التعبير الجيني.
  3. ومن ثم نسج الثقافة في أجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية التبريد في 12000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقائق ، ويتم تجاهل طاف. ثم يتم معلق الخلايا في 40 مل من CelLytic B (B CelLytic في استخراج النتائج بسرعة وكفاءة من البروتينات التي هي مناسبة لتنقية تقارب والتحليل.) ينبغي أن يستند على حجم 10 مل لكل 1 غرام من بيليه. يضاف ميكرولتر من 28 المركابتويثانول لكسر السندات ثاني كبريتيد و 400 ميكرولتر من الفلورايد phenylmethanesulphonyl تنشيط البروتياز من هضم البروتينات من الفائدة بعد انحلال الخلايا. A "كوكتيل البروتيني" يضاف أيضا (400 ميكرولتر من 0.2 ميكرولتر 400 ملغ / مل pepstatin ألف من 0.2 ملغ / مل leupeptin ؛ 400 ميكرولتر من 2 ملغ / مل مثبط التربسين) لضمان استخراج البروتين لا تتحلل قبل تحليل للأهداف من الفائدة. ثم نضيف 400 ميكرولتر 1M إيميدازول ، ويستخدم لأزل البروتينات الموسومة منضمة إلى أيونات النيكل تعلق على السطح من الخرز في العمود اللوني و1MM الأول الدناز ، وتستخدم للحط من الحمض النووي غير المرغوب فيه المفرد والمزدوج تقطعت بهم السبل ، وإلى 5 phosphodinucleotide قليل النوكليوتيد شظايا.
  4. يحرك الخليط على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة للسماح الوقت الكافي للتفاعل ، وتدور في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة في جهاز الطرد المركزي التبريد. حصاد طاف واستعدادا لتنفيذ التسريب اللوني مع ني NTA (النيكل nitrilotriacetic Superflow حمض Qiagen) من خلال الدوران في أنابيب الطرد المركزي microfuge بسرعة قصوى لمدة 3 دقائق وغسل العازلة مع تحلل ، وتكرار الغزل والغسيل حتى يصبح الخليط واضح من أي لون أزرق. يحرك الخليط ببطء الناتجة في وعاء مظلم على الجليد لمدة 60 دقيقة.
  5. أداء اللوني العمود الذي ينساب من خلال 12 الكسور على النحو التالي. الكسر الأول هو من خلال تدفق طاف 10 مل مختلطة مع ني NTA في الخطوة السابقة. والثاني هو 10 مل من تحلل العازلة (50 ملي نا الفوسفات وكلوريد الصوديوم 300 ملم ، 20 ملم إيميدازول ، ودرجة الحموضة 8.0) ، والثالثة 10 مل من المخزن (10 ملي إيميدازول ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0) ، والرابعة ، والباقي 0.5 مل من شطف العازلة (250 ملي إيميدازول ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0)
  6. تحضير هلام بولي أكريلاميد SDS - PAGE وإعداد عينات لدينا عن طريق خلط 4 ميكرولتر من الكسر و 1 ميكرولتر من SB 5X (تريس 300mM 6.8 ، BME 25 ٪ ، SDS 10 ٪ و 50 ٪ الجلسرين). لمعيار كنا سلم 100 كيلو بايت الحمض النووي التي Invitrogen. قبل تحميل المغلي ونحن لدينا عينات لمدة 5 دقائق. بعد تحميل ركضنا في 120V الجل لمدة 60 دقيقة. ثم نحن الملون ، وتجفف destained أخيرا في أكثر جفافا هلام خاص لمدة 2 ساعة في 80C.
  7. ثم نظرنا النتائج على الجل ويقع كسور التي حققت أفضل نتيجة. اعتمادا على البروتين من مصلحتنا ، يجب أن يكون موجودا على التوالي على نطاقات حجم البروتين. يجب أن يتم تحديد هذه النسبة لتنقية البروتين وكذلك مع MonoQ Superdex 200 (أمرشام فارماسيا).
  8. يتم تنفيذ الاعتقال من قبل الغزل الكسور الأكثر تركيزا في تصفية Nanosep مع حجم المسام من 10K في 14 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، وغسله مع شطف عازلة في كل مرة. فمن الضروري تحديد تركيز البروتين النهائي الاستفادة من تجربة جيش صرب البوسنة لمزيد من البروتين الداخلي التوسيم.
  9. لا يمكن أن يتجزأ من مضان أخضر 2xGFP - NLS أن تستخدم للتصوير جزيء واحد من النقل النووي بسبب سوء صورته في المحافظة على استقرار والطيف تتداخل مع تألق ذاتي الخلية. وبالتالي ، فإننا تسمية الجزيئات البضائع مع وجود فائض من صبغة العضوية السيستين التفاعل (أو Alexa555 اليكسا maleimide 647 من المسابر الجزيئية) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في 50 ملي فوسفات الصوديوم ، وكلوريد الصوديوم 150 ملم بعد تخفيض TCEP مع تريس (2 -- carboxyethyl) لمدة 20 دقيقة. وكانت ردود الفعل مروي مع المركابتويثانول - 2 ، وكانت الحلول مدال البروتين لإزالة الصبغة الحرة.

3. جزيء واحد المجهر

  1. لدينا مجموعة تضم ما يصل المجهر an أوليمبوس IX81 مجهزة الهدف NA 1.4 النفط الغمر 100X (UPLSAPO 100XO ، أوليمبوس) ، على 35 ميغاواط 633 نانومتر وني الليزر (ميليس Griot) ، مصباح الزئبق مع مرشح GFP إعداد ، وهو على رقاقة كسب الضرب المسؤول عن جانب كاميرا الجهاز (تتالي 128 + ، روبر العلمية) ، وتحتل المرتبةه حزمة البرامج Slidebook (الذكي الابتكارات التصوير) للحصول على البيانات ومعالجتها. تم استخدام المروحية الضوئية (نيوبورت) لإنشاء وضع على الخروج من الإثارة ليزر. لقد كان امرا مثيرا GFP ومضان Alexa647 بواسطة مصباح الزئبق و 633 نانومتر ليزر على التوالي. تم جمع الانبعاثات الخضراء والحمراء التي مضان نفس الهدف وتصفيتها عن طريق فلتر مزدوج اللون (Di01-R405/488/561/635-25x36 ، Semrock) وتصفية الانبعاثات (NF01-405/488/561/635-25X5. 0 ، Semrock) ، والتقط بواسطة كاميرا CCD متطابقة.
  2. في التجارب جزيء واحد ، ونحن تمكين الوقت مضان photobleaching للجزيء شحن واحدة لتكون أطول من الوقت اللازم للانتقال. لتحديد الوقت photobleaching ، ومطلي 0.1 نانومتر الجزيئات البضائع على الغطاء الزجاجي الانزلاق وتصبح قادرة على الحركة بعد 30 دقيقة بسبب عدم الاستيعاب المحددة. ثم ، بالطبع يقاس الوقت من مضان. واعتمادا على البروتين من المرات photobleach الفائدة ستكون مختلفة استنادا إلى عدد من cysteins قادرة على التفاعل مع maleimides ، وبالتالي فإن شدة الإضاءة وإضاءة المنطقة ينبغي أن تعدل حتى لا تحفز على photobleaching الأولية والتأكد من أن جزيئات البضائع المسمى مع عرض 647 اليكسا مضان لمدة أطول من الشحنات التفاعل مع الشخصيات.
  3. للتجارب الاستيراد في الخلايا permeabilized ، أضيفت نقل البضائع والعوامل المساعدة الضرورية معا. ردود الفعل النمطية استيراد البضائع الواردة GTP 1 ملم ، و 0.5 ميكرومتر Importin ، 0.5 ميكرومتر Importin - 1 و 2 و 1 ميكرومتر ران ميكرومتر NTF2 لتسهيل النقل ونانومتر 0.1 ديكستران 10KDa السلبي للنقل.. وكانت التركيزات البضائع الفلورسنت> 100 نانومتر في التجارب السائبة ، و~ 100 م عن المقايسات جزيء واحد. في هذه التركيزات ، وكان من المتوقع> 99 ٪ من البضائع على شكل مجمعات مع Importin وImportin. تم رصد معدل النقل بواسطة epifluorescence (إذا كانت معدلات نسبية فقط كانت مهمة) أو مضان المجهري متحد البؤر (إذا كان المطلوب معدلات المطلقة).
  4. الأول تم تحديد موقف من المغلف النووية واسعة المجال المجهري epifluorescence بواسطة إشراك HBO مصباح الزئبق مع مجموعة من المرشحات GFP لالتقاط صورة من الشرق الأدنى. شدة بكسل داخل صف أو عمود ما يقرب من عمودي على NE كانت تتناسب مع غاوسي. واعتبر مواقف ذروة الضبابي لمجموعة معينة من شدة الموقف NE بكسل لهذا الصف والعمود. وكانت مواقف ذروة سلسلة من مثل هذه Gaussians ثم تناسب مع متعدد الحدود من الدرجة الثانية ، مما أسفر عن مسار NE داخل الصورة بأكملها.
  5. بمجرد المترجمة الشرق الأدنى ، لا بد من التخلص من كل تألق ذاتي وذلك باستخدام 633 نانومتر وني ليزر حتى يتم photobleached تماما ، وعادة ما يزيد على 60 ثانية كافية.
  6. وينبغي أن جزيئات عينة ثم توضع في حل PVP 1.5 ٪ من الخليط ويضاف إلى غرفة التدفق في حجم 25 لتر وجره ذلك من خلال غرفة تطبيق الفتيل من ورق الترشيح. ينبغي أن تؤخذ في المطلق على الرعاية إضافة إلى استيراد البضائع بروتينات الخلايا permeabilized اليمين بعد التعريب المغلف النووية حيث يمكن التركيز بسهولة من قبل أي عطل حركة نشطة.
  7. حالما يتم إضافة جزيئات البضائع ، 633 نانومتر ، وكان يستخدم ليزر ني لتسليط الضوء على مسارات النقل العابرة للجزيئات. وينبغي أن تعمل على المروحية الضوئية (نيوبورت) في ما يقرب من 5 هرتز لتجنب بسبب photobleaching إلى كثافة عالية من الطاقة ليزر ، وكذلك السماح لجزء جديد من الجزيئات غير photobleached واحد من الاقتراب من الشرق الأدنى. وينبغي اتخاذ سلسلة من أشرطة الفيديو من translocations جزيء واحد مع كاميرا CCD عالية السرعة التي يمكن أن ترتفع إلى 2500 هرتز.

4. ممثل النتائج

بروتوكول يسمح لنا القيام بشكل صحيح ، نحن لجمع سلسلة من أشرطة الفيديو مما يدل على إزفاء من الجزيئات البضائع واحد التفاعل مع المجمع النووي في مسام الخلايا هيلا permeabilized 121 بوم. (الشكل 1). شرعنا في الصورة وتتبع الخطوات النقل العابرة للجزيئات ديكستران من خلال المجلس الوطني للصحافة في خلايا هيلا ديجيتونين ، معربا عن permeabilized ستابلي GFP - POM121. وحضنت الخلايا مع تركيزات منخفضة من جزيئات ديكستران المسمى. وقد جلبت الطائرة الاستوائية النواة في التركيز مع صورة واضحة للحلقة خضراء مضان GFP ولع ضوء 488 نانومتر مصباح الزئبق. التعرض لفترة طويلة من GFP - NE تمكننا من الحصول على إشارة ممتازة إلى الضجيج (SNR) نسبة لتحديد مكان الطائرة وسط الشرق الأدنى. في السابق تم العثور على 10 كيلو دالتون جزيئات ديكستران لنشر خلال NE ضمن ما يقرب من 2 مللي مع القرار المكانية من حوالي 20-40 نانومتر من قبل الكشف عن معدل الإطار من 500 أو 1000 هرتز. مثل هذا القرار يسمح spatiotemporal القبض على خطوات نشر واحدة فقط لاثنين من جزيئات ديكستران من خلال المجلس الوطني للصحافة الذي لا يكفي لتوضيح المزيد من المعلومات المكانية لنشر السلبي. لالتقاط المزيد من الخطوات من الجزيئات الدقيقة ديكستران داخل مجلس الشعب مع أفضل spatiotemporal القرار ، أجرينا اثنين من التحسينات الرئيسية : (ط) لتكييف الإطار أسرع معدل اكتشاف من 2500 هرتز لالتقاط المزيد من الخطوات نشر غرامة ، و (الثاني) لتوظيف الإضاءة البصرية كثافة أعلى لإثارة المزيد من الفوتونات من الجزيئات واحدة للحصول على ارتفاع القرار المكانية. هذه التحسينات تمكننا من القبض على خطوات متعددة لنشر عابرة من الجزيئات التي تحمل علامات alexa647 ديكستران عبر NE بواسطة ضوء الليزر 633 نانومتر في الإشعاع من 2 كيلو واط / 100 سم مع قرار spatiotemporal من 12 نانومتر ، ومللي 400.

وكما هو مبين في الشكل (1) ، وسجلت سلسلة من الصور الثابتة للأحداث النقل النموذجية للجزيئات ديكستران. من خلال تتبع مسارات المكاني للجزيئات الفردية ديكستران العابرة ، تميزوا الخطوات غرامة لنشر عن طريق الشرق الأدنى. وجدنا أن هناك ما يقرب من 30 ٪ من التفاعل مع أحداث الشرق الأدنى قد اعترفت المنشأ والمقصد المقصورات. من بينها ، ديكستران جزيئات الانتقال من السيتوبلازم إلى الشرق الأدنى وجهتين : نهاية في النواة بعد نشرها عن طريق NE أو نقله إلى السيتوبلازم بعد التفاعل مع الشرق الأدنى وقعت حالات مشابهة لأحداث التصدير : جزيئات ديكستران بدءا من النواة أدخل السيتوبلازم أو منتشر إلى نواة بعد التفاعل مع الشرق الأدنى. مثل سلسلة الصور تحتوي على معلومات عن الوضع المكاني للجزيئات واحدة مع الصدد الى مجلس الشعب ، فضلا عن المعلومات في الوقت الزمني الاسهاب من الجزيئات من خلال مجلس الشعب. من خلال تحليل مسارات الجزيئات ديكستران حول منطقة الشرق الأدنى ، يمكن تحديد الوقت والنقل ، والكفاءة ومدخل التردد. يمكن تحديد الوقت اللازم للانتقال في عملنا حيث الاستيراد أو التصدير الوقت. كما تم تحديدها في متوسط ​​مدة بقاء جزيئات ديكستران داخل الشخصيات التي تخضع للاستيراد أو التصدير. تم تعريف استيراد أو تصدير الكفاءة كنسبة مئوية من الاستيراد الكامل أو الأحداث تصدير أكثر من مجموع الأحداث كاملة وفاشلة. تردد مدخل استيراد أو تصدير يشير عدد من الجزيئات المتفاعلة مع NE خلال ثانية واحدة.

الشكل 1
الشكل 1. إطارات الفيديو المختارة لنقل أحداث نموذجية من خلال جزيئات ديكستران الشرق الأدنى. (أ) الحدث السيتوبلازم إلى النواة. بدأت جزيء ديكستران واحد (بقعة حمراء) من السيتوبلازم ، تفاعلت مع NE (الخط الأخضر بكسل) ، وانتهت في النواة. وتم تحديد مسارات الحدث (خطوط زرقاء وفتح نقاط) وفرضه على الشرق الأدنى (الخط الأسود). خطوط خضراء وحمراء تمثل 100 نانومتر ، المسافة من الشرق الأدنى على السيتوبلازم والجانب النووي. C ، السيتوبلازم. N ، النواة. شريط الحجم : 2 مم. (ب) حدث السيتوبلازم إلى السيتوبلازم. (C) حدث النواة إلى النواة. (D) حدث النواة إلى السيتوبلازم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يجب توخي الحذر لضمان اقامة colocalization السليم للجزيئات واحد NE أثناء التجربة. من المهم أيضا أن تقدم إشارة ارتفاع نسبة الضوضاء ، وخصوصا عندما إشارة منخفضة نظرا لوضع العلامات أو photobleaching الفقراء. يقتصر دقة الترجمة عن الضوضاء الخلفية (التي تنشأ من خارج التركيز مضان ، CCD الضوضاء قراءات العوامل الظلام ، والحالية وغيرها).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد أيد هذا المشروع من المنحة لتعزيز القدرات البحثية (جامعة بولينغ غرين ستيت).

References

  1. Ma, J., Yang, W. Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Forthcoming (2010).
  2. Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability. Forthcoming Forthcoming.
  3. Yang, W., Musser, M. S. Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy. Methods. 39, 316-328 (2006).
  4. Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics