माउस मूत्र पथ के संक्रमण के transurethral प्रेरण

Immunology and Infection

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Summary

यह वीडियो transurethrally माउस मूत्र पथ के संक्रमण को प्रेरित और परिणामस्वरूप संक्रमण की हद तक यों के तरीकों का प्रदर्शन करेंगे.

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Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection. J. Vis. Exp. (42), e2070, doi:10.3791/2070 (2010).

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Abstract

ब्याज की Uropathogenic जीवाणु उपभेदों अगर पर हो रहे हैं. आम तौर पर uropathogenic,

Protocol

मूत्रमार्ग कैथेटर की मैं तैयार

  1. प्रत्येक माउस मूत्राशय और गुर्दे को जांचा जा के लिए, एक cryovial ट्यूब में 5-6 स्टेनलेस स्टील (मूत्राशय, 1.6 मिमी आकार या 0.9-2.0 मिमी मिश्रण) मोती या zirconium ऑक्साइड मनकों (गुर्दे, 0.5 मिमी आकार) क्रमशः जगह है,. मनका युक्त ट्यूबों आटोक्लेव.
  2. परिवेश के तापमान शांत करने के लिए ट्यूबों के बाद, प्रत्येक स्टेनलेस स्टील ट्यूब मनका युक्त और प्रत्येक zirconium ऑक्साइड मनका युक्त ट्यूब के लिए 400 बाँझ पीबीएस के microliters बाँझ पीबीएस के 200 microliters जोड़ें.
  3. हम मूत्रमार्ग कैथेटर त्रिशंकु और 13 Hultgren द्वारा वर्णित के रूप में तैयार. फ्लैट सिर संदंश और ठीक कैंची परितारिका (या समान प्रकार) के एक स्वच्छ जोड़ी आटोक्लेव और उपकरणों परिवेश के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. 70% इथेनॉल के साथ एक लामिना का प्रवाह हुड के नीचे सतहों पोछो. हुड में, polyethylene टयूबिंग की एक 30 सेमी खंड (अनुमानित) में कटौती. Aseptically एक बाँझ 3 सीसी सिरिंज पर एक बाँझ 30 गेज सुई (1 / 2 इंच लंबी सुई) की जगह है. Autoclaved संदंश के साथ कटौती पॉलीथीन टयूबिंग के एक छोर उठाओ और सुई पर टयूबिंग स्लाइड जब तक यह हब मिलता है. टयूबिंग कट इतना है कि लगभग 2 सेमी सुई की नोक से परे फैली है. सिरिंज और एक बाँझ पेट्री डिश में जगह से कैथेटर निकालें.
  4. पार संदूषण की संभावना को कम करने के लिए, हम प्रत्येक माउस के लिए एक कैथेटर बनाते हैं. आखिर कैथेटर बना रहे हैं, उन्हें एक खुला पेट्री डिश में कम से कम 30 मिनट के लिए यूवी विकिरण के लिए जोखिम से बाँझ. यूवी लैम्प मत देखो सीधे या हुड में शरीर के किसी भी हिस्से का पर्दाफाश जबकि दीपक सक्रिय कर रहे हैं. यूवी जोखिम के बाद, कैथेटर पेट्री डिश में लंबे समय तक संग्रहीत कर सकते हैं. हम Parafilm के साथ पकवान सील की सिफारिश बाँझपन बनाए रखने में मदद.

द्वितीय. पशु टीकाकरण

  1. चूहे प्रयोगात्मक हेरफेर से पहले कम से कम एक सप्ताह आने के क्रम में तनाव प्रेरित कारकों से बचने के लिए चाहिए. स्त्री चूहों क्योंकि पुरुष माउस मूत्रमार्ग के लिए कैथिटर लगाना अत्यंत कठिन है उपयोग किया जाता है. CBA / जम्मू एक सामान्य उपयोग, यूटीआई अतिसंवेदनशील जन्मजात माउस तनाव है. चूहे उम्र के 8 और 12 सप्ताह के बीच में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, क्योंकि यह प्रतिरक्षाविज्ञानी परिपक्वता की खिड़की senescence से पहले है. प्रयोग के पहले दिन पर, जमी बैक्टीरियल शेयर की एक शीशी में एक बाँझ inoculating पाश के अंत डुबकी. एक छोटे और एक उपयुक्त अगर प्लेट पर लकीर बाहर inoculum परिमार्जन. आम तौर पर, uropathogenic ई. (UPEC) कोलाई और अन्य उपभेदों Luria Bertani अगर (पौंड) पर रातोंरात बड़े हो सकते हैं 37 पर ° सी परिवेशी वायु में. UPEC उपभेदों ठोस, लेग अगर पर पीले सफेद पारदर्शी कालोनियों के रूप में विकसित. तुरंत फ्रीजर बैक्टीरियल शेयर वापस. Uropathogenic जीवाणु उपभेदों दोहराया, सीरियल संस्कृतियों के साथ कम समय के साथ उग्र बन सकता है. इसलिए, हम एक प्रयोग के लिए एक ताजा अगर प्लेट streaking की सलाह देते हैं.
  2. प्रयोग के 2 दिन पर, उचित कॉलोनी आकारिकी की पुष्टि करने के बाद, शोरबा संस्कृति का कम से कम 5 सीसी में अगर प्लेट और जगह से एक कालोनियों रातोंरात लेने. लेग शोरबा सबसे uropathogenic जीवाणु उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (37 डिग्री सेल्सियस, परिवेशी वायु में 200 rpm). शोरबा संस्कृति ट्यूब पर ढीला टोपी रखें वातन की अनुमति.
  3. प्रयोग के 3 दिन पहले शोरबा और शोरबा में संस्कृति संस्कृति का 10% ले फिर से रातोंरात (आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस और 200 rpm), मैं pili अभिव्यक्ति प्रकार बढ़ाने. सीरियल शोरबा संस्कृतियों जीवाणु uropathogenicity का अनुकूलन मदद, के बाद से प्रकार मैं pili 1 vivo में uropathogens के लिए एक महत्वपूर्ण विषैलापन कारक होना दिखाया गया है . शोरबा संस्कृति ट्यूब पर ढीला टोपी रखें वातन की अनुमति.
  4. प्रयोग के 4 दिन, 3 दिन से शोरबा संस्कृति के आयुध डिपो 600 उपाय. यदि जीवाणु परीक्षण किया जा रहा तनाव के लिए पहले से ही ज्ञात नहीं है, 600 आयुध डिपो और cfu के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए कम से कम 7 लॉग (पीबीएस के साथ प्रदर्शन किया dilutions, लेग अगर पर प्रदर्शन संस्कृतियों, 37 रातोंरात ऊष्मायन ° सी) से अधिक दस गुना सीरियल कमजोर पड़ने चढ़ाना प्रदर्शन / एमएल. अंगूठे का एक नियम के रूप में, 0.4-0.5 की एक 600 आयुध डिपो आमतौर पर 1-2x10 प्रति 7 cfu 50 microliters मेल खाती है. एक बार 600 आयुध डिपो और cfu / एमएल के बीच संबंधों को निर्धारित किया गया है, एक 600 आयुध डिपो पीबीएस के 50 microliters में माउस प्रति वांछित cfu इसी शोरबा संस्कृति को समायोजित कर सकते हैं. कुछ काम का सुझाव दिया है कि 50 के बजाय 10 microliters, टीका, kidneys6 में कम भाटा होता है. हालांकि, ज्यादातर प्रकाशनों माउस प्रति 50 microliters के उपयोग की सूचना दी है. आम तौर पर, 6 10 और 108 cfu / माउस, लेकिन प्रत्येक बैक्टीरियल / माउस तनाव संयोजन empirically vivo में परीक्षण किया जाना चाहिए के बीच वांछित cfu पर्वतमाला .
  5. मदद करने के लिए सुनिश्चित करें कि inocula टपकाना के बाद बाहर नहीं voided हैं तुरंत चूहों सामान्य संज्ञाहरण की प्रेरण से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए पानी के वंचित किया जाना चाहिए. एक अन्य महत्वपूर्ण पैंतरेबाज़ी करने के लिए चूहों scruffing से पहले संज्ञाहरण प्रेरण voiding प्रेरित और धीरे कम abdom दबानेएन. दो से 2.5% isoflurane 8-12 सप्ताह पुराने महिला CBA चूहों के लिए एक सुरक्षित प्रेरण खुराक, रखरखाव संज्ञाहरण के साथ 1.8-2% isoflurane द्वारा पीछा किया है.
  6. एक बार संज्ञाहरण हासिल की है, चूहों उनके isoflurane - युक्त ऑक्सीजन से जुड़े nosecone में डाला सिर के साथ लापरवाह स्थिति में रखा जाता है. पेट के निचले हिस्से के मूत्राशय से मूत्र खाली मालिश है. अगर मूत्राशय अपेक्षाकृत खाली है, इस पैंतरेबाज़ी मूत्र नहीं उपज सकता है. पेट के निचले हिस्से और perineum के 70% इथेनॉल से लथपथ है.
  7. एक सुई के बिना एक बाँझ 1 सीसी सिरिंज करने के लिए वांछित बैक्टीरियल inoculum आकर्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अगले, एक बाँझ मूत्रमार्ग कैथेटर aseptically सिरिंज पर रखा गया है. अतिरिक्त टयूबिंग काट कैंची की एक जोड़ी के साथ कैथेटर टयूबिंग की 1-2 मिलीमीटर केवल इतना है कि सुई की नोक के लिए बाहर का रहेगा. फिर, सिरिंज और टेप सवार ईमानदार सभी बुलबुले को दूर करने के लिए सिरिंज के साथ उदास. बैक्टीरियोस्टेटिक चिकनाई का एक बड़ा टूकड़ा जेली एक बाँझ पेट्री डिश या बाँझ सिरिंज आवरण के अंदर पर squirted है. कैथेटर की नोक (संलग्न सिरिंज के साथ) जेली में डूबा हुआ है. यदि कई जीवाणु उपभेदों एक ही प्रयोग में परीक्षण किया जा रहा हैं, जेली का एक ही ड्रॉप नहीं का उपयोग करने के लिए अलग अलग उपभेदों से युक्त कैथेटर चिकना करने के लिए सावधान रहना.
  8. आवर्धन (5x ज़ूम श्रृंखला के लिए 0.8x) के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, anesthetized माउस के clitoral हुड धीरे ठीक दांतेदार संदंश की एक जोड़ी के साथ गैर प्रमुख हाथ में समझा और गहरे गुलाबी मूत्रमार्ग meatus बेनकाब cephalad उठाया ( चित्रा 1). सिरिंज (संलग्न कैथेटर के साथ) प्रमुख हाथ में एक पेंसिल पकड़ के साथ समझा जाता है और कैथेटर की नोक मूत्रमार्ग meatus में एक 45 डिग्री के कोण पर लगी हुई है. clitoral हुड सिरिंज की लंबी अक्ष के साथ फैला है, प्रभावी रूप से कैथेटर पर मूत्रमार्ग "लोड". इस पैंतरेबाज़ी आवश्यक है के बाद से माउस मूत्रमार्ग बेमानी है. कैथिटर मूत्राशय (हब के लिए, चित्रा 2) में आसानी से स्लाइड चाहिए और धीरे मूत्रमार्ग के निरर्थक परतों नेविगेट में मदद करने थिरकीं कर सकते हैं. एक बार कैथेटर hubbed है, सिरिंज जब तक यह माउस की लंबी अक्ष के साथ समानांतर है कम किया जा सकता है. गैर प्रमुख हाथ संदंश ड्रॉप धीरे inoculum (कम से कम 5 सेकंड) इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया है और प्रमुख हाथ के रूप में कैथेटर सिरिंज की स्थिति स्थिर करने में मदद कर सकते हैं. यदि द्रव इंजेक्शन के दौरान कैथेटर के आसपास बह देखा जाता है, मूत्राशय या तो भरा है या कैथेटर योनि (बस मूत्रमार्ग के लिए दुम) में है. इंजेक्शन तुरंत हो और बंद कर दिया जाना कैथेटर की स्थिति को ध्यान जांच. यदि कैथेटर मूत्रमार्ग में था, दिया माउस प्रयोग में शामिल नहीं करना चाहिए. दूसरी ओर, एक योनि में खो कैथेटर और repositioned किया जा सकता इंजेक्शन फिर करने का प्रयास. इंजेक्शन के बाद, कैथेटर और सिरिंज धीरे माउस से वापस ले लिया है.
  9. जल्दी voiding के बाद टीका है, जो प्रशासित बैक्टीरिया खाली और इस तरह चर संक्रमण के स्तर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की संभावना को कम करने के लिए, कुछ जांचकर्ताओं संज्ञाहरण के तहत inoculation10 transurethral के बाद 30 मिनट के लिए चूहों को बनाए रखने. सर्जरी के बाद, चूहों एक साफ वार्मिंग कंबल पर लगातार अवलोकन के साथ ठीक करने के लिए सामान्य श्वास पैटर्न और गतिविधि की वापसी की पुष्टि करना चाहिए. एक बार पूरी तरह से पशुओं को क्रॉल करने की क्षमता बरामद किया है, वे बिस्तर युक्त पिंजरों को लौट जा सकता है.

III. संक्रमित ऊतक में माप CFU

  1. विभिन्न माउस यूटीआई प्रकाशनों संस्कृति परिणामों पर 6 घंटे से एक या उससे अधिक समय के बाद टीका सप्ताह की सूचना दी है. इष्टतम समय अंक empirically प्रत्येक बैक्टीरियल / माउस तनाव संयोजन के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है. Voided मूत्र संस्कृति के लिए एक बाँझ पेट्री डिश पर माउस scruffing द्वारा प्राप्त की है. मूत्र एकत्र सभी समय पर बर्फ पर रखा जाना चाहिए. एकाधिक करने के लिए कई घंटे से अधिक voided मूत्र प्राप्त करने के प्रयास आवश्यक हो, माउस voiding के बाद से अक्सर, कम मात्रा (शून्य प्रति 3-10 microliters) है हो सकता है, और तनाव पर निर्भर है.
  2. Voided मूत्र नमूनों को प्राप्त करने के बाद, हम isoflurane और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग चूहों बलिदान. पेट aseptically खोला है. यदि voided मूत्र नमूना सफलतापूर्वक पहले नहीं प्राप्त हुई थी, मूत्र की एक छोटी राशि अक्सर मूत्राशय दीवार के माध्यम से एक 30 गेज सुई और सिरिंज का उपयोग कर से aspirated जा सकता है.
  3. एक या दोनों गुर्दों हटाया, एक बाँझ पेट्री डिश पर कम से कम 4 टुकड़े (कम से कम 50 micrograms प्रत्येक टुकड़ा किया जाना चाहिए) में कीमा बनाया हुआ, और में रखा zirconium / मनका पीबीएस युक्त बर्फ पर cryovials. मूत्राशय हटा दिया है, कम से कम 4 टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ, और स्टेनलेस स्टील मनका / में रखा पीबीएस युक्त बर्फ पर cryovials. ऊतक / / मनका पीबीएस cryovials युक्त एक गोली ब्लेंडर homogenizer में रखा जाता है और ऊतकों को एक मिनट के लिए "8" गति सेटिंग का उपयोग कर homogenized हैं. के लिए कुछ ऊतक टुकड़े homogenization के बाद रहने के लिए यह आम है. के रूप में लंबे समय के रूप में तरल homogenate के 50-100 microliters pipetted किया जा सकता है, ठोस टुकड़ेकर रहे हैं जरूरी नहीं कि एक समस्या है. यदि homogenization समय कुछ नमूने के लिए बढ़ जाती है, यह homogenization की निरंतरता बनाए रखने के क्रम में सभी ऊतकों के लिए ऐसा करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम एक ब्लेंडर homogenizer बुलेट का उपयोग क्योंकि यह पार संदूषण की संभावना से बचा जाता है, व्यक्तिगत नमूने एक मानक homogenizer का उपयोग कर प्रसंस्करण की तुलना में अधिक तेजी से है, और जा रहा है homogenized नमूनों में काफी गर्मी नहीं है.
  4. कम से कम दो या तीन एकत्र मूत्र और ऊतक homogenates के दस गुना dilutions एक microtiter प्लेट में बनाया जाना चाहिए. प्रारंभिक प्रयोगों के लिए यह करने के लिए कम से कम सात दस गुना dilutions करने विवेकपूर्ण हो सकता है. संस्कृति मूत्र के अप करने के लिए 100 microliters, मूत्राशय, और / या गुर्दे homogenates पर उपयुक्त अगर. के बाद से मूत्र नमूनों मात्रा सीमित किया जा सकता है, यह 100 microliters को उनके संस्करणों दस गुना dilutions प्रदर्शन करने से पहले लाने के लिए आवश्यक हो सकता है. यदि यह आवश्यक है, प्रारंभिक कमजोर पड़ने (दस गुना कमजोर पड़ने से पहले) जीवाणु पैदावार के अंतिम गणना में सकारात्मक असर होगा की आवश्यकता होगी. हम eosin methylene नीले या MacConkey अगर (37 रातोंरात ऊष्मायन ° सी) संवर्धन UPEC पसंद करते हैं, के बाद से इन मीडिया ग्राम नकारात्मक जीवों के लिए चयनात्मक हैं. UPEC उपभेदों केन्द्र umbilicated, लाल गुलाबी उनके लैक्टोज विक्षोभ की क्षमता के कारण कालोनियों के रूप में MacConkey अगर पर बढ़ता है.
  5. रातोंरात संस्कृति के बाद, एक थाली के लिए cfu गिनती. Serially पतला नमूने के लिए, थाली कमजोर पड़ने 50-100 कालोनियों से युक्त सबसे सटीक गणना माना जाता है. ऊतक प्रति "पीछे" cfu गणना, ऊतक के milligram प्रति, या मिलीलीटर प्रति.

चतुर्थ. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1 संदंश (तस्वीर के ऊपर से परे) के साथ cephalad clitoral हुड उठाने के द्वारा उजागर मूत्रमार्ग meatus (गहरे गुलाबी ऊतक).

चित्रा 2
चित्रा 2]. मूत्रमार्ग Catheterized . दो शाखाओंवाला भगशेफ कैथेटर बस के ऊपर देखा जा सकता है है.

चित्रा 3
Figure 3. मूत्राशय cfu 8 सप्ताह पुरानी uropathogenic ई. के साथ महिला / CBA जम्मू चूहों के transurethral संक्रमण के बाद 2 दिनों में गिना जाता है कोलाई. Bladders और homogenized गया MacConkey अगर धारावाहिक कमजोर पड़ने चढ़ाना द्वारा निर्धारित cfu / मिलीलीटर. हीरे व्यक्तिगत चूहों के लिए cfu / मिलीलीटर से संकेत मिलता है, क्षैतिज पट्टी औसत cfu / मिलीलीटर इंगित करता है.

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Discussion

जीवाणुओं की transurethral टीका द्वारा माउस मूत्र पथ के संक्रमण की प्रेरण एक लंबे समय की स्थापना की लेकिन तकनीकी रूप से मांग 11 प्रक्रिया है. हुंग और Hultgren हाल ही माउस मूत्र पथ के संक्रमण के 13 transurethral तकनीकों का एक उत्कृष्ट समीक्षा प्रकाशित किया. इस पत्र में, हम आगे इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की बारीकियों का वर्णन करने का प्रयास.

Novices एक midline मूत्राशय बेनकाब laparotomy प्रदर्शन, भारत स्याही (पीबीएस में 1%) के एक पतला समाधान इंजेक्शन, और मूत्राशय के नीले रंगाई के लिए देख उनकी तकनीक का अभ्यास कर सकते हैं. हमने पाया है कि एक पूर्ण मूत्राशय माउस मूत्रमार्ग इंजेक्शन के दौरान के साथ सौदा करने के लिए सबसे कठिन समस्याओं का है, और सबसे अच्छा पानी के अभाव और पूर्व संज्ञाहरण voiding ऊपर उल्लिखित रणनीतियों से रोका. हमारे हाथों में, <चूहों के 10% मूत्रमार्ग इंजेक्शन के दौरान मूत्र के अतिप्रवाह दिखा रहे हैं. एक अन्य संभावित बाधा दर्दनाक कैथीटेराइजेशन, जो मूत्रमार्ग वेध, मूत्राशय inocula के अनुचित खुराक, और यहां तक ​​कि पशुओं के मौत के लिए नेतृत्व कर सकते है. कोमल तकनीक और धैर्य कैथीटेराइजेशन के दौरान महत्वपूर्ण हैं, सफल कैथीटेराइजेशन मूत्राशय में कैथेटर मजबूर कभी आवश्यकता होती है चाहिए.

अंत में, कुछ प्रयोगशालाओं एक गोली ब्लेंडर homogenizer या अन्य "मध्यम throughput के" homogenizer, या तो कम नमूना संख्या या लागत विचार के कारण का उपयोग नहीं करना चाहते हो सकता है. एक मध्यवर्ती समाधान के लिए एक मानक homogenizer का उपयोग करें और प्रत्येक नमूना के बीच डिवाइस साफ है. सबसे किफायती समाधान का उपयोग कांच grinders, जो हम सफलतापूर्वक गोली ब्लेंडर homogenizer के लिए स्विचन से पहले कार्यरत है. ऊतक homogenization में इस्तेमाल किया विधि के बावजूद, सावधानीपूर्वक, सड़न रोकनेवाला है, और लगातार तकनीक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

लेखकों को उनके विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए शैली Xie और जेनिफर पायने स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. इस काम के बाल चिकित्सा मूत्रविज्ञान और स्टैनफोर्ड बाल रिसर्च फंड की सोसाइटी से अनुदान के माध्यम से संभव बनाया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) E&K Scientific 640201
Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring E&K Scientific 440011-N
Bullet Blender Next Advance BBX24
Zirconium Oxide Beads (0.5mm) Next Advance ZROB05
Stainless Steel Beads (1.6mm) Next Advance SSB16
Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) Next Advance SSB14B
CBA/J Mice, 8-12 week old female Jackson Laboratory 000656
Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) EMD Millipore EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)
LB agar
LB broth EMD Millipore 1.10285.0500
Isoflurane (Aerrane) Baxter Internationl Inc. NDC 10019-773-60
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-601
Eosin-methylene blue (EMB) agar powder Himedia Laboratories MM022-500G
MacConkey agar powder Difco Laboratories 212123
LB agar powder Difco Laboratories 244520
Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] BD Biosciences 427401
30 gauge needles, 1/2 inch BD Biosciences 305106
1 ml tuberculin Slip-Tip syringe BD Biosciences 309602
3 ml Luer-Lock syringe BD Biosciences 309585

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References

  1. Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
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Comments

3 Comments

  1. Very nice demonstration, Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 10:09 AM
  2. please make the whole video visible..Its very improtant for me..

    Reply
    Posted by: Kalpana R.
    February 6, 2014 - 2:24 AM
  3. this video is very important for me,please show the whole video

    Reply
    Posted by: azo p.
    June 22, 2014 - 11:20 PM

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