Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

Neuroscience
 

Summary

Nós demonstramos o uso da arma para introduzir gene corantes fluorescentes, como DII, em neurônios em fatias de cérebro de roedores e primatas não-humanos de diferentes idades. Neste caso particular, nós usamos camundongos adultos (3-6 meses de idade) e adultos macacos cynomologus (9-15 anos). Esta técnica, descrita originalmente pelo laboratório do Dr. Lichtman (Gan

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Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices. J. Vis. Exp. (41), e2081, doi:10.3791/2081 (2010).

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Abstract

Coloração DiOLISTIC usa a arma gene para introduzir corantes fluorescentes, como o DII, em neurônios de fatias do cérebro (Gan et al, 2009;. O'Brien e Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de cada etapa necessária em conjunto com imagens exemplares de resultados bons e ruins que ajudarão ao configurar a técnica. Em nossa experiência, a poucos passos mostrou crítico para o sucesso da aplicação DiOLISTICS. Estas considerações incluem a qualidade das balas revestidas de DII, o grau de exposição fixador, ea concentração de detergente utilizado nas soluções de incubação. Dicas e soluções para problemas comuns são fornecidos.

Esta é uma técnica rotulagem versátil que pode ser aplicado a várias espécies de animais em uma ampla gama de idades. Ao contrário de outras técnicas de rotulagem fluorescentes que são limitados para a preparação de animais jovens ou restrita a camundongos, porque eles contam com a expressão de um transgene fluorescentes, rotulagem DiOLISTIC pode ser aplicado a animais de todas as idades, espécies e genótipos e pode ser usado em combinação com imunocoloração para identificar uma sub-população específica de células. Aqui nós demonstrar o uso de DiOLISTICS aos neurônios etiqueta em fatias de cérebro de camundongos adultos e adultos primatas não-humanos com o objetivo de quantificar dendrite ramificação e morfologia espinha dendrítica.

Protocol

1. Preparando DII / Tungsten Bullets Bead: DII (1-1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato) balas devem ser preparadas com antecedência de cortar fatias de cérebro. O procedimento demora cerca de 2-4 horas, dependendo de quantas balas são preparados de uma só vez.

  1. Se a partir de um novo lote de contas de tungstênio, prepare alíquotas de 300 mg cada. Alíquotas são preparados através da suspensão de 6 gramas de tungstênio em 2 ml de cloreto de metileno. Então, pipetar 100 ml de solução em tubos de microcentrífuga talão para produzir alíquotas de 300 esferas de tungstênio mg alíquotas Conservar à temperatura ambiente (Nota: o cloreto de metileno evapora muito rapidamente álcool também pode ser usado minimizar a evaporação)....
  2. Quando a partir de alíquotas de contas, ressuspender cada alíquota (300 esferas de tungstênio mg) em 300 ml de cloreto de metileno e cobrir rapidamente para evitar a evaporação. Esta quantidade é suficiente para 3 lotes de balas.
  3. Preparar a solução corante, pesando 13,5 mg de DII corante lipofílico e adicionando 450 mL de cloreto de metileno (concentração final = 3mg/100μl).
  4. Brasão as contas com corante. Coloque uma lâmina de vidro em um pedaço de cera revestido de papel e pesar Pipetar 100 mL de contas para o slide. Adicione 100 ml de solução DII, misturar bem usando pipeta ponta, e ar seco, até virar cinza contas de luz.
  5. Use uma lâmina para raspar contas fora da lâmina de vidro e corte as contas em um pó fino (Nota: use uma lâmina nova, se fazendo mais de uma cor de balas de modo a não contaminar os corantes)..
  6. Contas de raspar para o pesar contas de papel e funil para um tubo de 15 ml. Adicionar 3 ml de água e sonicado em banho-maria por 10-30 minutos em temperatura ambiente (Nota: cortar o pó e sonicação são aplicadas para minimizar a formação de aglomerados de grânulos revestidos que pode atrapalhar a rotulagem esparsos de neurônios individuais)..

2. Preparar solução de polivinilpirrolidona (PVP) e tubos: Para melhorar a penhora de contas para a tubulação de bala (tubulação TEZFEL), bata-a com polivinilpirrolidona solução (PVP).

  1. Prepare 10 ml de solução de PVP em água a uma concentração de 10 mg PVP / ml.
  2. Use uma seringa de 12 ml com adaptador de tubo (tubo flexível com diâmetro ligeiramente maior) para passar a solução PVP através do tubo de bala e, em seguida, expulsá-lo do outro lado. Reutilização solução para tubo de revestimento mais bala se vários lotes são preparados simultaneamente. Descartar PVP solução após o uso.
  3. Para adicionar as contas para o tubo vortex bala, as contas para produzir uma solução homogênea e usar a seringa para puxar a solução talão através do tubo de forma que contas são distribuídas uniformemente pela tubulação. ((Nota:) tentam minimizar o número de bolhas de ar na tubulação).
  4. Alimentar o tubo através da estação de preparação e permitir que as contas para resolver. Use a seringa para remover suavemente a água de modo que somente as contas permanecem.
  5. Girar a tubulação na estação de preparação e seque com gás nitrogênio até as gotas de água não são mais visíveis. Esta etapa irá demorar cerca de 10-20 min.
  6. Cortar balas com cortador de tubos em 13 mm e comprimentos lugar em frascos de cintilação contendo Drierite ou algum tipo de sulfato de cálcio anidro. Embrulhe em uma folha de frascos para proteger da luz.

3. Coloração DII: Esta técnica rotulagem pode ser usado para manchar neurônios no tecido cerebral de diversas espécies, neste caso particular, a partir do mouse (3-6 meses de idade) e primatas não-humanos (9-15 anos).

É preferível que as fatias são preparados a partir de tecido cerebral fixa obtidos por perfusão intracardíaca de solução de fixador, pois a preservação de tecido deve ser melhor nessa condição. No entanto, a fixação por perfusão nem sempre é viável (como foi o caso com o tecido macaco) e rotulagem DiOLISTIC ainda pode ser aplicado com sucesso em diferentes procedimentos de preparo de tecidos. Aqui nós descrevemos três procedimentos diferentes para a preparação do tecido:

  1. Fix cérebro por perfusão intracardíaca → remover cérebro → postfix por 10 min → fatia cortada mancha →
  2. Remover cérebro → bloco de corte de tecido → bloco corrigir → lavar em PBS fatia corte → → mancha
  3. Remover cérebro → fatias cortadas → corrigir → lavar → mancha

No presente estudo, os cérebros de macacos foram obtidas de indivíduos que foram transcardially perfundidos com líquido gelado cerebral artificial espinhal (ACSF) antes da colheita do cérebro e um bloco (4 mm de espessura) de tecido que contém o núcleo caudado umnd putâmen foi fixado por 60 min em temperatura ambiente. Para todos os procedimentos, a solução fixadora contém paraformaldeído a 4% de sacarose e 4% em PBS (preparada fresca ou utilizados dentro de 15 dias). É importante notar que os tempos de fixação são cruciais para a coloração bem sucedida. Overfixation pode afetar a coloração por perturbar a integridade da membrana plasmática e causando o vazamento de corante para fora da célula (veja mais informações em resultados).

  1. Para o procedimento a e b, fatias (200μm) são cortadas a partir do cérebro fixo ou bloco de tecido e fatias colocado em 24 poços da placa com PBS. Para o procedimento c, fresco fatias cerebral aguda (200 mm) são cortados com uma vibratome em solução corte a frio contendo (em mM) 110 Colina Cl-, 25 de NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 25 de glicose, 11,6 ácido ascórbico, ácido pirúvico 3,1 (osmolaridade = 310 mOsmols) e imediatamente após as fatias são colocadas em placas de 24 poços e fixado em 30 min com solução fixadora à temperatura ambiente.
  2. Lave as fatias com PBS, três vezes.
  3. Antes de fatias de tiro, retire a PBS dos poços e, usando um pincel, coloque a fatia no centro do poço.
  4. Atirar balas DII até 3.0 M de papel de filtro usando um sistema de Helios Gene Gun em 120-180 a pressão do gás hélio psi, colocando a arma a uma distância de 1,5 cm entre a amostra ea ponta do cano.
    (Nota importante:. Neurônios Somente dentro de 50 mm da superfície fatia será marcado por este método por isso é importante para manter o mesmo lado da fatia voltada para cima durante a lavagem e para a montagem Desta forma, você irá certificar-se que o neurônios rotuladas será dentro da distância focal, quando de imagem com um microscópio confocal).
  5. Lave as fatias com PBS três vezes e armazená-los em PBS durante várias horas para permitir que a DII a se espalhar ao longo dos dendritos.
  6. Monte fatias numa lâmina de vidro com Prolongar Antifade Ouro e cubra com uma lamela 18X18 milímetros No.1. (Nota: para c processo, o melhor é montar fatias no mesmo dia em que a integridade das fatias não é bem conservado durante a noite).
  7. Seal com unhas polonês claro depois meios de montagem secou.
  8. Alternativamente, as fatias podem ser marcadas com anticorpos antes da montagem, conforme descrito abaixo.
    (Nota: Slides pode ser usado pelo menos 6 meses a um ano se armazenado no escuro a 4 ° C. DII é a exposição sensível e longo prazo luz à luz fará com que a mancha a desvanecer-se).

4. Coloração de anticorpos: A imunocoloração deve ser realizada após o passo 3.4 e antes da montagem.

  1. Permeabilização: fatias Incubar em 0,01% Triton X-100 em solução de PBS por 15 min em temperatura ambiente (300-500 mL por poço).
    NOTA: Não use maiores concentrações de detergente, pois isso irá dissolver DII e reduzir significativamente a coloração fluorescente. Tentar minimizar o tempo em detergente como incubações extensiva também irá reduzir a rotulagem DII. Se incubações estendida são necessárias, manter fatias em PBS, e não em solução de bloqueio.
  2. Bloqueio: fatias Incubar em solução de bloqueio contendo soro de cabra 10%, 0,01% Triton X-100 em PBS por 30 min em temperatura ambiente.
  3. Anticorpo primário: Adicionar anticorpo na diluição desejada em solução de bloqueio (por exemplo, coelho anticorpo anti-GFP em 1:1000 diluição). Adicionar 300-500 mL por poço e incubar por 1-2 hrs. (Nota: se incubações durante a noite são necessárias, retire o detergente do solução de bloqueio).
  4. Lave as fatias com PBS por 5 - 15 min, 3 vezes.
  5. Anticorpo secundário: Incubar com anticorpo secundário por 30 min em temperatura ambiente. Prepare a solução de anticorpo secundário na diluição desejada em solução de bloqueio (por exemplo, Alexa Fluor 488-anticorpo conjugado na diluição 1:1.000).
  6. Lave as fatias com PBS por 5-15 min, 4 vezes.
  7. Monte fatias de slides com Prolongar Antifade Ouro e cubra com uma 18x18 milímetros No.1 lamela. Seal com unha polonês após meios de montagem secou.

5. Resultados representativos:

  1. Verificação de rotulagem correta: Seção podem ser visualizados em um escopo fluorescentes dissecar equipado com uma lâmpada de mercúrio e fluorescentes cubo vermelho filtro para confirmar rotulagem DiOLISTIC sucesso. A Figura 1 mostra imagens exemplar de secções cerebrais muito bem marcado obtidas com pequeno aumento. Duas características importantes estão a olhar para um padrão de rotulagem esparsos (Figura 1A) e a capacidade de identificar individualmente os componentes celulares (Figura 1B-C). Solução de problemas de rotulagem DiOLISTIC: Figura 2 mostra exemplos de seções em que a rotulagem DiOLISTIC trabalhou de forma incorreta. Em nossa experiência, existem três causas principais para a rotulagem ineficiente:
    • Rotulagem é muito esparsa ou densa: Muito poucas células são rotulados por seção em um caso ou muitas células são rotulados impedindo o isolamento e estudo de elementos celulares única. Solução: ajustar a concentração de grânulos com revestimento na solução final utilizada para o revestimento da tubulação bala TEFZEL (seção 1.6). Diminuir ou aumentar o volume de água (3 ml valor inicial) utilizado para dissolver as contas em ordem para corrigir a rotulagem demasiado escassa ou muito densa, respectivamente. Além disso, baixa eficiência de rotulagem podem ser causados ​​por menos de pressão do gás ideal para fotografar as contas revestido em seções. Esta possibilidade pode ser descartada, certificando-se que a tubulação de bala TEFZEL lançou a maior parte dos grânulos revestidos e parece claro após o disparo. Caso contrário, a pressão do gás para a fotografia deve ser aumentada.
    • Balas ruins: as grandes aglomerações ou clusters de contas corante revestido de tungstênio são formadas durante a preparação de bala. Seções se assemelhará exemplos na Figura 2A-B. Solução: fazer novas balas com especial atenção o ponto 1.5 e / ou prolongar o tempo de sonicação no ponto 1.6.
    • Prazo de fixação: o tecido é mantido em solução de paraformaldeído por mais tempo do que o tempo ideal necessário para a fixação (30 minutos para seções 200-300 mM, 1 hora para 4 seções mm). Isso compromete a integridade da membrana plasmática e produz seções rotuladas que se parecem com aqueles mostrados na Figura 2C-D em que a rotulagem parece fora de foco devido à dispersão de corante para fora das células. Solução: reduzir o tempo de fixação.
  2. Imagem confocal: pilhas de imagens são adquiridas através de um microscópio confocal (Zeiss LSM 510 META) com um objetivo de 20x para a célula inteira e objetiva de imersão 63x de água para os segmentos de dendrite. DII estava animado usando uma linha de laser 561 DPS nm e fluorescência verde do anticorpo secundário foi animado usando uma linha de laser 488 nm. A secção óptica da amostra rotulada alcançado quando usando microscopia confocal permite ainda para o isolamento de células marcadas única na amostra. Figura 3A mostra um neurônio estriatal spiny médio do cérebro do rato e seu padrão de ramificação complexa dendrite. Imagens de alta ampliação de ramos dendrite desses neurônios a partir de roedores (Figura 3B) e primatas não-humanos (Figura 3C) demonstram o grau de coloração em dendritos e espinhas dendríticas usando esta técnica em ambas as espécies. Dendritos e suas saliências (espinhas) aparecem bem definidos, mesmo quando se considera a coluna, longo e fino cabeças tão abundante nos neurônios espinhosos médios.

    Ao combinar DiOLISTICS com imunomarcação, imagem confocal também é útil para localizar a mancha de forma inequívoca para o mesmo plano focal e mesma célula. A Figura 4 mostra um exemplo de co-localização de DII rotulagem e imunomarcação para GFP em uma única célula. A imagem é uma pilha (0,7 mM z-seção) obtido a partir de uma fatia estriatal de um camundongo transgênico expressando a proteína fluorescente GFP sob o promotor receptor D1 de dopamina.

Figura 1
Figura 1. DII rotulagem de neurônios em fatias de cérebro de primatas não-humanos. (A) imagem de baixa ampliação de uma fatia do cérebro manchada contendo o núcleo caudado de um macaco cynomolgus que mostra escassa rotulagem de neurônios com DII. (BC) neurônios isolados spiny meio pode ser facilmente identificado usando um escopo fluorescentes de dissecação.

Figura 2
Figura 2. Rotulagem DiOLISTIC Resolução de Problemas. (AB) fatias de estriado dorsal Stained de macaco (A) e mouse (B) mostrando grandes aglomerações de corante revestido contas e, como conseqüência, não há elementos individuais de celular podem ser distinguidos. (CD) Imagens que exemplificam o resultado da aplicação DiOLISTIC rotulagem para as seções que foram mantidos em solução fixadora por períodos prolongados de tempo, ou quando a preservação de tecido falhou em macaco (C) e tecido mouse (D).

Figura 3
Figura 3. Confocal imagem de estriatal médio spiny neurônio corados com DII. (A), pilha de Imagem de uma célula inteira permite a análise morfológica dos ramos dendríticas. Segmentos (BC) Dendrite de mouse (B) e macaco (C) neurônios espinhosos médios mostram uma rotulagem clara de dendrite e espinhas.

Figura 4
Figura 4. Combinando rotulagem DiOLISTIC com imunocoloração. (A) Dii rotulados (B) usando anticorpos anti-GFP, como descrito por métodos adaptados de Lee et al. (2006). Mesmo campo como A. imagem (C) composto de vermelho e de fluorescência verde identifica neurônio DII marcado como um neurônio GFP-positivo.

Discussion

Rotulagem DiOLISTIC é uma das técnicas mais versáteis disponíveis para as células fluorescente rotulagem, porque pode ser aplicado a seções de tecido de diversas espécies, para uma ampla gama de idades, e para o tecido obtido frescos ou de fixador-perfundidos animais (ver também Gan et al ., 2009). O processo é relativamente rápido, uma vez que leva 1-2 dias e pode ser combinada com outras abordagens rotulagem mais clássicos, como imunocoloração (Lee et al., 2006). Atenção especial deve ser dada para evitar o excesso de fixação e uso de detergente de alta concentração em soluções de incubação porque estes compreendem a integridade da membrana lipofílica e fazer com que o corante vazar para fora das células. Penetração de anticorpos pode ser facilitado por baixas concentrações de Triton X-100 (Lee et al., 2006), bem como digitonina ou saponina na solução de incubação (Matsubayashi et al., 2008). Algumas modificações que podem ser aplicadas para esta técnica incluem o uso de balas com diversas tinturas e, como descrito por Gan et al. (2000) ou mudar o tamanho e tipo de exposição de anticorpos (Neely et al., 2009).

Tradicionalmente, a DII tem sido usado para traçar projeções neuronais no cérebro. Rotulagem DiOLISTIC amplia sua aplicação, descrevendo um método útil para analisar a morfologia das células. Morfologia neuronal é de grande interesse por causa da grande diversidade encontrada no cérebro e as especulações de que a forma da célula pode refletir sobre a multiplicidade função de populações neuronais no sistema nervoso. Um exemplo disso é o fato de que muitos neurônios do sistema nervoso protrusão mostrar mamíferos pequenos chamadas espinhas dendríticas, que são o local das sinapses glutamatérgicas. Desta forma, a densidade de sinapses glutamatérgicas em uma célula pode ser correlacionada com a densidade de espinhas dendríticas, que pode ser medido utilizando a técnica de rotulagem descritos neste documento. Além disso, outros parâmetros morfológicos, tais como comprimento total dendrite, padrão de ramificação, forma espinha dendrítica e densidade podem ser quantificados e estudados.

O uso de marcação fluorescente para estudar a morfologia neuronal tem muitas vantagens quando comparado com técnicas mais tradicionais que dependem de microscopia de campo claro (por exemplo, a coloração de Golgi), pois permite maior resolução de imagem confocal. Outra vantagem de usar DII como um fluoróforo em experimentos destinados a medir a densidade espinha dendrítica e morfologia é suas propriedades lipofílicas. Partições DII na membrana plasmática e proporciona um contorno bem definido dos processos neuronais e saliências dendríticas. Dado o pequeno volume de mais espinhas dendríticas (menos de 1 femtoliter), coloração da membrana é mais eficiente e permite uma melhor visualização de pequenas saliências finas de coloração citoplasmática.

Disclosures

Todos os procedimentos foram realizados em animais a seguir a orientação do Animal Care e do Comitê Use a NIAAA eo Oregon National Primate Research Center. Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer Michael Feyder e Terrell Holloway por sua assistência durante a configuração inicial da técnica e laboratório do Dr. Fumi Ono s para o acesso ao seu microscópio confocal. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Saúde através do programa intramural da NIAAA e NINDS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) Invitrogen D-282
Methylene chloride Mallinckrodt Baker Inc. H485-06
Tungsten beads Bio-Rad 165-2269 1.7 μm diameter
Polyvinylpyrrolidone Calbiochem 529504
Tefzel bullet tubing Bio-Rad 165-2441
Tubing cutter Bio-Rad 165-2422
Helios Gene Gun Bio-Rad 165-2431
Isopore membrane filter paper EMD Millipore TSTP02500 3.0 μm pore size
ProLong Gold Antifade Invitrogen P36930
Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 (16% w/v)

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References

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  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harb Protoc. pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).
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