इमेजिंग प्रोटीन - प्रोटीन सहभागिता Vivo में

Biology
 

Summary

इस प्रोटोकॉल के लिए कैसे छवि प्रोटीन, प्रोटीन निकटता झल्लाहट आधारित परख का उपयोग कर बातचीत का वर्णन करता है.

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Seegar, T., Barton, W. Imaging Protein-protein Interactions in vivo. J. Vis. Exp. (44), e2149, doi:10.3791/2149 (2010).

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Abstract

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत सभी आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं की एक बानगी हैं. हालांकि, इन मुलाकातों के कई क्षणिक है, या energetically कमजोर कर रहे हैं, उनकी पहचान और सह immunoprecipitation रूप में पारंपरिक जैव रासायनिक विधियों के माध्यम से विश्लेषण को रोकने. इस संबंध में आनुवंशिक encodable फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, आरएफपी, आदि) और उनके प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम अतिव्यापी जुड़े हमारे Forster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) 1-3 का उपयोग vivo में कमजोर बातचीत की निगरानी करने की क्षमता में क्र ांतिकारी परिवर्तन किया है. यहाँ, झल्लाहट आधारित endothelial कोशिका की सतह पर रिसेप्टर रिसेप्टर बातचीत की निगरानी के लिए निकटता परख हम हमारे उपयोग का विस्तार.

Protocol

प्रोटोकॉल तीन प्रमुख चरणों के होते हैं. पहला, एक स्तनधारी अभिव्यक्ति एमिनो टर्मिनली CFP या और / YFP के monomeric संस्करणों के लिए वेक्टर केवल संक्षिप्त चर्चा की जाएगी में अपने हित के जीन की कदम क्लोनिंग. दूसरे और तीसरे चरण, सदिश डीएनए के EA.hy926 endothelial कोशिकाओं में अभिकर्मक, और झल्लाहट के साथ confocal इमेजिंग, नीचे और अधिक गहराई में रेखांकित कर रहे हैं.

1. CFP और YFP chimeric रिसेप्टर्स का निर्माण

CFP और YFP के monomeric बढ़ाया संस्करणों के लिए ब्याज की रिसेप्टर्स एमिनो टर्मिनली क्लोन चाहिए. झल्लाहट के निर्धारण अनुभवजन्य है और समीक्षकों transmembrane क्षेत्र में फैले और 1 की fluorophore शुरू के बीच linker की लंबाई पर निर्भर है . इसलिए, linker के कई अलग अलग लंबाई जांच के तहत प्रत्येक नए रिसेप्टर जोड़ी के लिए पता लगाया जाना चाहिए.

  1. PcDNA3.1 hygro आर या नव आर monomeric सी या YFP (इस सदिश हमारी प्रयोगशाला से प्राप्त किया जा सकता है है) से युक्त वेक्टर में, NheI / EcoRI साइटों में ब्याज की अपनी रिसेप्टर क्लोन . * नोट: यदि आवश्यक हो, NheI संगत SpeI और XbaI सहित कई अन्य एंजाइमों है.
  2. एक उपयुक्त endA1 recA सक्षम सेल लाइन है (हम नियमित Mach1 उपयोग) में अपने ligation प्रतिक्रिया रूपांतरण . डालने की उपस्थिति के लिए स्क्रीन कालोनियों डीएनए म्यूटेशनों के अभाव सत्यापित अनुक्रमण द्वारा पीछा किया.
  3. सफल आणविक क्लोनिंग की रचना प्राप्त करने पर, निष्फल पानी या ते Qiagen, या इसी तरह, डीएनए किट का उपयोग कर में अभिकर्मक ग्रेड सदिश डीएनए तैयार. एकाग्रता और यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग पवित्रता का मूल्यांकन. डीएनए की विशिष्ट पैदावार 100-200 μg है, जो नियमित रूप से 1 μg / μL के शेयर एक काम के लिए पतला है की सीमा में होना चाहिए.

2. EA.hy 926 कक्ष के अभिकर्मक

  1. MatTek (0 सं) coverslip 2 एमएल माध्यम से 35 मिमी व्यंजन में EA.hy 926 4 कोशिकाओं, पूरा DMEM में हो (DMEM 10% भ्रूण गोजातीय + सीरम / Pen. Strep.) भाजित. आप conservatively एक 15 सेमी मिला हुआ पकवान से ~ 15 व्यंजन (~ मिला हुआ 90% अगले दिन) प्राप्त कर सकते हैं. एक पकवान तैयार करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति रिसेप्टर की अभिव्यक्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक रिसेप्टर जोड़ी के लिए एक डिश का मूल्यांकन के लिए.
  2. कोशिकाओं 5% सीओ 2 माहौल में रात 37 पर सेते दें ° सी. अगले दिन, संस्कृतियों ~ 70-90% मिला हुआ होना चाहिए.
  3. अभिकर्मक के दिन पर, Fugene6 के 8 μL साथ पूर्व गर्म OptiMEM 200 μL में chimeric रिसेप्टर सदिश डीएनए (2 μL) के 2 μg मिश्रण द्वारा nucleolipid परिसरों को तैयार है. रिसेप्टर जोड़े के लिए, प्रत्येक रिसेप्टर के μg 1 2 μg की कुल के लिए, के साथ transfect (यह भी देखें नीचे चर्चा).
  4. उलटा द्वारा धीरे मिलाएं.
  5. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते जारी रखें.
  6. ऊष्मायन अवधि के दौरान, अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं को तैयार है. ताजा मीडिया Aspirate और प्रत्येक प्लेट धीरे और संक्षेप में 2 एमएल पूर्व गर्म एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पूरा - DMEM (DMEM FBS +) के अलावा पहले गर्म पीबीएस से धो. यह महत्वपूर्ण है पेनिसिलीन और स्ट्रेप्टोमाइसिन की उपस्थिति से बचने के रूप में वे Fugene6 के साथ इलाज के दौरान काफी अधिक कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं.
  7. जटिल कोशिकाओं को बुद्धिमान बूंद जोड़ें और 37 पर एक अतिरिक्त 20-24 घंटे के लिए सेते ° सी में एक 5% सीओ 2 माहौल.
  8. 24 घंटे के बाद, ध्यान से कोशिकाओं से मीडिया aspirate और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ताजा पूरा DMEM विंदुक. अभिकर्मक के बाद, सेल व्यवहार्यता अपेक्षाकृत उच्च रहना चाहिए यानी, कोई अस्थायी कोशिकाओं को थोड़ा मनाया जाना चाहिए.
  9. जीन अभिव्यक्ति एक अतिरिक्त 48-60 के बाद अभिकर्मक घंटे के बाद आम तौर पर अधिक से अधिक है. हालांकि, इमेजिंग के रूप में 24 घंटे के रूप में संक्षेप में आम तौर पर संभव है. समय इष्टतम जीन की अभिव्यक्ति के लिए पाठ्यक्रम के प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

3. Confocal इमेजिंग और विश्लेषण झल्लाहट

लाइव सेल इमेजिंग Leica टीसीएस SP2 के AOBS confocal लेजर स्कैनिंग नीले डायोड (405 एनएम), आर्गन (458, 476, 488, 514 एनएम) के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर किया जाता है. हरी HeNe (543 एनएम), नारंगी HeNe (594 एनएम), और लाल (633 एनएम) HeNe लेज़रों, एक HCX PI ए पी ओ ना 63x/1.3 ग्लिसरीन विसर्जन उद्देश्य लेंस, एक motorized XY मंच (Märzhäuser), और एक पर्यावरण नियंत्रित ( तापमान, नमी, और सीओ 2) मंच इनक्यूबेटर (PeCon). प्रायोगिक नियंत्रण उत्सर्जन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चैनलों का मूल्यांकन करने के लिए अभिव्यक्ति मुद्दों और गैर विशिष्ट fluorophore multimerization के बीच परस्पर बात fluorophore को खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. जैसे, एक fluorophore transfections हर छवि सत्र की स्थापना के लिए उपयोग कर रहे हैं. नकारात्मक नियंत्रण (जाना जाता है noninteracting रिसेप्टर्स का उपयोग) के लिए प्रदर्शन, क्रम में पृष्ठभूमि निर्धारित झल्लाहट की आवश्यकता होगी झल्लाहट कि खत्म अभिव्यक्ति के लिए कारण होता है.

  1. CFP और YFP के लिए उत्सर्जन चैनलों के बीच crosstalk को समाप्त करने के लिए, चरण इनक्यूबेटर में CFP अभिव्यक्ति नियंत्रण जगह है. श्वेत प्रकाश का प्रयोग, जेड प्लेट को समायोजित करने के लिए पर ध्यान केंद्रितकोशिकाओं के लिए.
  2. उत्सर्जन CFP पता लगाने के लिए 465-505 एनएम और 525-600 एनएम के लिए YFP सपा खिड़की सेटिंग्स सेट.
  3. जबकि दोनों उत्सर्जन चैनलों की निगरानी, ​​458 एनएम CFP उत्तेजित. AOTF का प्रयोग, लेजर CFP के ऊपर YFP उत्सर्जन चैनल में प्रशंसनीय खून को खत्म करने की शक्ति सेट. इस सेटिंग सहेजें.
  4. 514 एनएम पर केवल YFP व्यक्त की कोशिकाओं के लिए उत्तेजना की शक्ति का समायोजन करके प्रदर्शन CFP चैनल में YFP crosstalk YFP (अभिव्यक्ति नियंत्रण का उपयोग करके) के लिए एक ही नियंत्रण है. इस सेटिंग सहेजें.
  5. अगली जगह कोशिकाओं सह व्यक्त चरण इनक्यूबेटर में CFP और YFP. Leica confocal सॉफ्टवेयर के लिए अनुक्रम सेटिंग का उपयोग करना, उचित झिल्ली स्थानीयकरण के साथ CFP और YFP के समान स्तर व्यक्त कोशिकाओं का पता लगाने.
  6. Leica सॉफ्टवेयर स्वीकर्ता तस्वीर विरंजन कार्यक्रम का उपयोग करना, अपनी सहेजी गई CFP और YFP सेटिंग्स करने के लिए दाता और स्वीकर्ता सेटिंग्स सेट, इज्जत है.
  7. सेल पर Zooming, (ब्याज के क्षेत्र) रॉय जिसमें YFP की तस्वीर विनाश सेलुलर झिल्ली पर होती है और कार्यक्रम शुरू है पर प्रकाश डाला.
  8. स्वीकर्ता की तस्वीर विनाश के लिए, 100% करने के लिए 514 एनएम AOTF और समायोजित लेजर की अनुमति जारी रखने के लिए YFP उत्सर्जन के 70% तक समाप्त हो गया है विरंजन. विरंजन तेजी लाने के लिए, ROIs आमतौर पर लेजर की रेखापुंज (X-अक्ष) अक्ष में चुना जाता है.
  9. तस्वीर विरंजन के दौरान, सेलुलर आंदोलन की निगरानी और XY विमान में प्रशंसनीय आंदोलन के साथ प्राप्त की माप को अस्वीकार करने के लिए, के रूप में इन मापों की रिपोर्ट झूठी क्षमता झल्लाहट.
  10. पूर्व और बाद ब्लीच छवियों दोनों (CFP) दाता और स्वीकर्ता (YFP) के लिए दर्ज हैं और झल्लाहट दक्षता के रूप में गणना की है: सभी डी> डी पूर्व जहां डी पूर्व पद के लिए Eff = पोस्ट (डी के बाद डी पूर्व ) डी / झल्लाहट और डी पद पहले और क्रमशः photobleaching के बाद दाता तीव्रता है .
  11. JMP सॉफ्टवेयर (एसएएस) प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की हद तक निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम

अभिकर्मक क्षमता 30 से 40% के बीच आम तौर पर कर रहे हैं. दूसरों के द्वारा पिछले निष्कर्ष के बावजूद, हम नहीं देखा है कि अभिकर्मक और एक सदिश के अभिव्यक्ति है कि दूसरे के पक्ष में है. दरअसल, हम अक्सर एक कल्पना या अन्य की fluorophore अनन्य अभिव्यक्ति का पालन करें. ठेठ झल्लाहट क्षमता रिसेप्टर प्रणालियों के बीच भिन्नता है. बाँध रिसेप्टर प्रणाली के लिए, ठेठ मूल्यों उपकला कोशिकाओं के लिए endothelial कोशिकाओं में 20-28% और 19-23% कर रहे हैं. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, विशिष्ट क्षमता 2-3% से नीचे हैं. परिवर्तनशीलता की हद तक काफी अनुभव के साथ कम हो जाएगा.

चित्रा 1
चित्रा 1. ट्रांसफ़ेक्ट EA.hy 926 कोशिकाओं के प्रतिनिधि ए) EA.hy 926 सेल monolayer के डीआईसी छवि छवियों. बी) (ए) में प्रदर्शित की कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवि. सी) के ओवरले (ए) और (बी) का प्रदर्शन ~ 20-30% अभिकर्मक दक्षता.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि स्वीकर्ता झल्लाहट एक EA.hy926 सेल में CFP और YFP के बीच होने वाली विश्लेषण तस्वीर विरंजन CFP उत्सर्जन चैनल (शीर्ष पैनल) और YFP उत्सर्जन चैनल (नीचे दो पैनलों). थे पहले अलग से निगरानी और पोस्ट स्वीकर्ता photobleaching. Photobleaching प्रयोगों के लिए प्रतिबंधित किया गया, और से क्षेत्र के भीतर हरे बॉक्स मूल्यों की गणना झल्लाहट. झल्लाहट दक्षता उच्च से एक पूर्ण रेंज (लाल 1.0) CFP / YFP के एक बढ़ाया उपरिशायी पर कम (बैंगनी 0.0) के रूप में प्रदर्शित होता है ओरिएंटेशन प्रयोजनों के लिए केवल छवि विलय.

Discussion

वहाँ कई कदम है कि सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं कर रहे हैं. उन के बीच में सबसे प्रमुख दो chimeric रिसेप्टर्स के बीच अभिव्यक्ति के रिश्तेदार स्तरों है. इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, एक स्थिर ब्याज के दोनों प्रोटीन व्यक्त सेल लाइनों बनाने के लिए, हो सकता है या सदिश डीएनए के इष्टतम अनुपात की पहचान के बराबर अभिव्यक्ति परमिट. इसी तरह, एक डिश भर में गैर वर्दी अभिकर्मक के कारण प्रोटीन का स्तर कम कोशिकाओं के बीच बराबर हो जाएगा. इसलिए, ध्यान के लिए 'कम' से 'उच्च' expressors भेद करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. जो कि प्रोटीन का प्रदर्शन 'औसत' के स्तर आमतौर पर विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपज क्षमता झल्लाहट. हमारी प्रयोगशाला में इस मुद्दे को राहत देने का प्रयास किया है एक विधि एडिनो और lenti - वायरस के 'भी' जीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल होता है. इसके अलावा, स्वीकर्ता - तस्वीर विरंजन निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका झल्लाहट क्षमता अवगत उत्सर्जन है. हालांकि, अवगत करने के लिए वास्तविक समय में एकल कक्षों पर नजर रखने के उत्सर्जन की क्षमता के बावजूद, हम स्वीकर्ता तस्वीर विरंजन के लिए अधिक संवेदनशील और अधिक विश्वसनीय हो पाया है.

अंत में, प्रोटीन बातचीत की निगरानी की झल्लाहट का उपयोग चुनौतीपूर्ण हो, और कर सकते हैं झिल्ली बाध्य रिसेप्टर्स के लिए linker लंबाई का चयन सावधानी की आवश्यकता है. इसके अलावा, सी / YFP के अलावा अक्सर बहुत endoplasmic जालिका और Golgi तंत्र में प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर और एकत्रीकरण में परिणाम को प्रभावित करती है. हालांकि, क्षणिक है, या अस्थिर बातचीत के लिए, झल्लाहट आदर्श का उपयोग करने की पद्धति है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम confocal माइक्रोस्कोपी के साथ मदद के लिए डॉ. स्कॉट हेंडरसन स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. इस शोध wab 1RO1CA127501 स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान के रूप में अच्छी तरह से Massey कैंसर केंद्र और चिकित्सा के स्कूल (VCU) wab माइक्रोस्कोपी VCU विभाग में प्रदर्शन किया गया था पायलट परियोजना से धन के द्वारा समर्थित किया गया था. की तंत्रिका जीव विज्ञान और एनाटॉमी माइक्रोस्कोपी सुविधा, भाग में समर्थित NIHNINDS केंद्र कोर अनुदान 5P30NS047463 से धन के साथ,.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11960-069
Penicillin- Streptomycin Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum Hyclone N/A
Opti-MEM Invitrogen 11058-021
FUGENE 6 Roche Group 11814443001
Coverslip Dishes MatTek Corp. P35G014C
pcDNA3.1(+) Invitrogen V790‐20
Mach 1 Competent Cells Invitrogen C862003

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References

  1. Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
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