Author Produced

İlköğretim Doku İki timidin analogları Immunofluorescent Algılama (CldU ve IDU)

* These authors contributed equally
Biology
 

Summary

Biz yetişkin farelerin dokulara hücre bölünme birbirini izleyen iki mermi ölçmek için timidin analogları sıralı dahil (CldU ve IDU) tespit etmek için bir strateji elde var. Bu strateji, uzun ömürlü dokuların hücre ciro, onkojenik transformasyon, ya da transit yükseltme hücreleri tespit etmek için yararlıdır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tuttle, A. H., Rankin, M. M., Teta, M., Sartori, D. J., Stein, G. M., Kim, G. J., Virgilio, C., Granger, A., Zhou, D., Long, S. H., Schiffman, A. B., Kushner, J. A. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. J. Vis. Exp. (46), e2166, doi:10.3791/2166 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücre bölünmesinin hassas ölçüm yavaş bölünen hücreleri analiz edildiğinde, giderek daha karmaşık hale deneysel biyolojide temel bir sorundur. Hücre bölünmesi tespit etmek için kurulan yöntemler, hücre kültürü, bu tür carboxyfluorescein di-aetate succinimidyl ester (KAKE), Ki67 veya PCNA mitojenik antijenleri immün algılama gibi hayati boyaların seyreltme ve timidin analogları sürekli mikroskobu ile doğrudan görselleştirme içerir. Timidin analogları tritiated timidin, bromo-dezoksiuridin (BrdU), kloro-dezoksiuridin (CldU) ve iodo-dezoksiuridin (IDU) için immuno-algılama ve etinil-dezoksiuridin kimyasal algılama radyo algılama dahil olmak üzere çeşitli yöntemler ile tespit edilebilir (EDU). Biz yetişkin farelerin dokulara farklı timidin analogları sıralı dahil edilmesi (CldU ve IDU) tespit etmek için bir strateji elde var. Bizim metodumuz, araştırmacılar doğru hücre bölünme birbirini izleyen iki mermi ölçmek için sağlar. Optimize immün protokolleri olarak bizim yaklaşımımız, uzun süre farelere yönetmek için güvenli içme suyu ile idare çok düşük doz timidin analogları algılayabilir. Sonuç olarak, bizim teknik, çok uzun ömürlü dokularda hücre yenilenmesini tespit etmek için kullanılabilir. Optimal immunofluoresent boyama sonuçları, pankreas, cilt, bağırsak, karaciğer, böbrek üstü bezi, testis, yumurtalık, tiroid, lenf nodu, ve beyin de dahil olmak üzere birçok doku tipleri, elde edilebilir. Ayrıca dokular içinde onkojenik dönüşümü tanımlamak için bu tekniği uyguladık. Biz daha transit yükseltme hücrelerin, dokuların büyüme ya da yenilenmesi için katkıda olmadığını belirlemek için bu tekniği uyguladık. Bu anlamda, timidin analogları sıralı yönetim doku homeostazında alan hücrelerin kökeni ve hayatta kalma eğitimi için yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Protocol

1. CldU ve IDU Etiketleme Dokular

  1. Suda çözülür timidin analogları (CldU veya IDU). Her kimyasal 1 mg / ml tartılır ve distile su cam şişelerde ayrı ekleyin. Biz genellikle bir defada her 1 litre hazırlar.
  2. Bir heyecan plakası veya karıştırıcı diğer formu kimyasalların çözülür. CldU 10 dakika içinde eriyecektir. oda sıcaklığında ajitasyon. IDU 37 ajitasyon bir saat ° C ile sallama daha fazlasını gerektirir. Su kaynakları IDU çözünürlüğü etkileyebilir. IDU gecede sallayarak sonra askıya alınmadan devam ederse, daha temiz bir su kaynağı deneyin. Çözümler 4 ° C karanlıkta 'de saklanır.
  3. Yönetici istenilen etiketleme dönemi için farelere ilk timidin içeren solüsyonu (ya CldU veya IDU). Fareler etiket döneminde etiketsiz suya erişim için izin vermeyin. Belirlenen etiketleme dönemi tamamlandığında, (timidin içeren analogları birkaç saat serum yarı-ömürleri vardır), en az 24 saat süreyle etiketsiz su ile yıkanmaya başlar. Yönetici istenilen etiketleme dönemi için farelere ikinci timidin içeren solüsyonu (ya CldU veya IDU). Yedek su şişeleri düzenli olarak su kaybını önlemek için!
  4. Alternatif olarak, fare CdlU ve sonra IDU sıralı intraperitoneal etiketli olabilir. 10 mg / ml konsantrasyonda CldU veya IDU hazırlayın. IDU süspansiyon içine gitmek için kuvvetli sallayarak takip konsantre sodyum hidroksit çözeltisi damla akıllıca ek gerekebilir. Aşırı sodyum hidroksit ilave etmeyin. Sodyum hidroksit IDU 10 ml çözümü için tek bir damla 37 ajitasyon bir saat takip ° C ile sallama ekleyin. Eğer çözelti içinde değil, sodyum hidroksit ilavesi tekrarlayın. Intraperitoneal uzaya g vücut ağırlığı başına 100 mcg enjekte edilir.
  5. Kontrol slaytlar, bu protokol için esastır. Sonuç olarak, biz araştırmacılar duyarlılık ve özgüllük sağlamak için çeşitli varyasyonlar timidin analoğu etiketleme yürütmek şiddetle öneririz. Bu 1 içermelidir. Sadece CldU ile etiketlenmiş Fare, 2. Sadece IDU ile etiketlenmiş Fare, 3. Sırayla CldU ve sonra IDU ile etiketlenmiş edildi Fare, 4. IDU ve sonra CldU sırayla ilk tersten etiketli Fare, sadece su ile etiketli sahte 5 Fareler. CldU ve IDU etiket öğrenme, araştırmacılar her zaman ilgi doku kontrolü slaytlar tüm 5 yukarıdaki setleri ile tüm protokol yapmalıdır.

2. Doku Harvest Fiksasyon ve Slayt Hazırlama

  1. Uygun anestezi kullanarak, öldürücü doz aşımı gerçekleştirmek ve sonra fare exsanguination yoluyla kurban. Taze doku çıkarın ve 24 saat için% 4 4 paraformalehyde ° C ile düzeltmek. 01:04 4 formalin tampon ve mağaza ° C gömmek için doku aktarın.
  2. Alternatif olarak, öldürücü doz aşımı gerçekleştirmek ve daha sonra vücutta kan temizlenir kadar tuzlu su çözeltisi ile kalp sol ventrikül ile fare serpmek, hemen ardından% 4 paraformaldehid 30-50 cc serpmek. 01:04 Formalin Tampon ilgi ve mağaza dokuların gömmek için 4 ° C'de çıkarın.
  3. Doku dehidrasyon ve parafine gömme sonra, 5 mikron doku bölümleri ve ücret Slaytlarınıza yeri kesti. 65 ° C'de 16 saat boyunca (aşağıda antijen alımı adımları ile gerekli) slayt doku yapışmasını sağlamak için slaytlar pişirin.

3. Dehidratasyon, Permeabilization ve Antigen Alma

  1. 5 dakika boyunca iki ksilen hamam slaytlara çeker aşırı parafin çıkarın. her biri.
  2. 100, 95, 90, 80 70 ve% 50 etanol su ile seyreltilmiş slaytlar çeker doku rehidrate. Slaytlar 3 dakika bekletin. Her konsantrasyon,% 100 ile başlayan ve son daldırma için% 50 doğru gidiyor.
  3. 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın. 1x PBS.
  4. 5 dakika (taze, her zaman yaptı)% 0.2 Triton-X çözümü slaytlar çeker hücreleri Permeabilize.
  5. Mikrodalga doku antijen alımı için slaytlar hazırlayın. Çözüm evaporatif kaybı hesaba slaytlar üstünden 5 cm kapsar, böylece yeterli bir hacim 0.01m pH 6.0 sodyum sitrat tamponu ile bir cam behere slaytlar yerleştirin.
  6. Mikrodalga çözüm kaynar kadar slaytlar (3-10 dk tam güçte). Çözümü, yavaş yavaş kaynayan kadar gücü azaltmak (% 10-80) ve ek bir 20 dakika devam edin. Yavaş kaynatın çözüm kalmasını sağlamak için periyodik olarak mikrodalga kontrol edin.
  7. Yeri beher tezgah üstüne slaytları içeren ve oda sıcaklığında (yaklaşık 2 saat), yavaşça soğumasını bekleyin.
  8. Slaytları bir termometre kullanarak oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
  9. 40 dakika süreyle 1.5N HCL daldırın kayar. oda sıcaklığında.
  10. Yıkama 1X PBS, 5 dakika içinde iki kez slaytlar. Yıkama başına.

4. İlköğretim ve Ortaöğretim Antikorlar

  1. Slaytlar tüm protokolü üzerinden çok nemli kalması önemlidir. Kuru doku daha fazla otomatik olacak-Floresan, ortaya çıkan görüntüleri kullanılmaz hale gelebilirler. Bir zamanda, süreci bir slayt ölüyor engellemek için.
  2. (Yani, mum) kalem engelleyen bir sıvı ile Circle slaytlar her bölüm. Slaytlar 1x PBS kap içine yerleştirin.
  3. Islak kağıt havlu koyarak, nemli bir kuluçka odasının hava geçirmeyen plastik bir kabın alt düz attı.
  4. 1x PBS içinde seyreltilmesi% 10 eşek serum engelleme çözüm olun. Tamamen çözümü ile her bir bölümünü karşılamak için çok önemlidir. 1 x 1,5 santimetre doku bölümleri için, çözüm Bölüm başına 50 mikro-litre bir ses çıkışı yeterli.
  5. Slaytlar engelleme çözüm ekleyin. 1x PBS slayt çıkarın ve kuru kağıt havluları bir yığın slayt kenarına hafifçe dokunarak aşırı sıvı ortadan kaldırmak. Kuluçka odasında slayt yerleştirin ve her bölüm için 50 mikro-litre% 10 blok çözüm ekleyin. Tüm slaytları oda sıcaklığında 1 saat süreyle yakın konteyner ve inkübe tamamlandığında.
  6. IDU tespit birincil antikor seyreltme hazırlayın. 1x PBS içinde% 5 eşek serum 1:250 konsantrasyonda fare anti-BrdU sulandırınız. Slayt engellemek çözüm dokunun ve kuluçka odasına geri yerleştirin. Her bölüm için yukarıdaki primer antikor ve 4 gece inkübe ° C
  7. Yüksek darlığı yıkama (CldU fare anti-BrdU antiserumlar bağlama en aza indiren) hazırlayın. Makyaj taze düşük tuz TBST tampon (pH 8.0 36mm Tris, 50mm NaCl, 0.5% arasında 20). Slayt çifti başına 40 ml tampon gerekecektir. Her biri 50 ml konik tüpüne 40 mL tampon ekleyin. Slaytlar eklemeden önce, ön ısıtma çözümü - 37 ° C
  8. Bir seferde iki, kuluçka odasının slaytlar kaldırmak back-to-back (doku örnekleri birbirlerinden uzak bakacak şekilde) koyun ve fazla primer antikor dokunun. Düşük tuz TBST ve kapak ile dolu tüpler slaytlar yerleştirin. Tüpler 20 dakika çalkalayın. 37 sıcaklık bakteri kültürü inkübatör sallayarak ° C ve 225 rpm hız.
  9. Slaytları taze 1X PBS içinde iki kez yıkayın. 5 dk. Yıkama başına.
  10. Eğer istenirse, CldU ve doku antijeni tespiti için bir sonraki birincil antikor çözüm hazırlayın. 1x PBS içinde% 5 eşek serum 1:250 konsantrasyonda sıçan anti-BrdU sulandırınız. Birincil antikor çözüm çalışma konsantrasyonu doku antijeni karşı birincil antiserumlar sulandırınız.
  11. Slaytlar fazla 1x PBS dokunun ve kuluçka odasında koyun. Her bölüm için birincil antikor ve 4 gece inkübe ° C
  12. Slaytları taze 1X PBS içinde iki kez yıkayın. 5 dk. Yıkama başına.
  13. Ikincil antikor çözüm hazırlayın. Cy2 eşek anti-sıçan 1:250 ve Cy5 eşek anti-fare% 5 eşek serum içeren bir 1X PBS çözüm 1:500 sulandırınız. Cy3 ikincil doku antijeni antiserumlar birincil türleri tespit ettiniz. Ayrıca, ikincil antikor çözüm 1:150 DAPI ml / 0.4mg stok solüsyonu sulandırmak.
  14. Inkübasyon odasında aşırı 1X PBS kapalı slaytlar ve yer dokunun. Her bölüm için ikincil antikor çözüm ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  15. Slaytları taze 1X PBS içinde iki kez yıkayın. 5 dk. Yıkama başına.
  16. Slaytların aşırı 1X PBS dokunun ve Altın anti-solmaya montaj medya (dyanine boyalar Vectashield KULLANMAYIN!) Prolong cam kapak yapışır. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için kapak bordroları basın. 4 ° C saklayınız

5. Görüntüleme ve Analiz

  1. Resim, yüksek enerjili bir ışık kaynağı, plan-apochromatic hedefleri ve yüksek verimli bir mikroskop kamera (örneğin Hamamatsu Orca ER) ile donatılmış bir floresan mikroskop ile ilgi doku. AMCA (DAPI), Cy2 (CldU) Cy3 (Doku antijen) ve Cy5 (IDU) kanalları görüntüleri yakalayın. Birleştirme tek bir çok katmanlı görüntü dosyası oluşturmak için görüntüleri.
  2. Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda, DAPI lekeli çekirdeklerin homojen parlak olacaktır. Doku antijen (örneğin insülin), ilgi hücreleri açığa çıkarmalıdır. DAPI veya doku antijeni ile boyanarak kaldırmak kapağı kayma ve ikincil antiserumlar uygulama tekrarlamak gecede 1X PBS zayıf veya tutarsız batırmayın slayt.
  3. Cy3 doku antijeni odaklanın. CldU ve kanallar arasında geçiş Cy2 ve Cy5 kanal IDU boyama, kontrol edin. Belirteçleri, aşırı IDU ve CldU co-pozitifliği arasındaki potansiyel çapraz reaktivite açısından bakın. Sadece CldU veya IDU içeren dokular için bakın. CldU veya IDU pozitif çekirdek eksikliği etiketleme veya boyama ile bir teknik soruna işaret ediyor olabilir. Bu durumda, yüksek replikatif doku (örneğin lenf nodu) bakın.
  4. Görüntü analiz. DAPI ve doku antijeni içeren katmanlar görüntüleyin. Baskın elinde bir beyaz tahta marker ve non-dominant el bir hücre sayacı kullanarak, her bir çekirdeği, kuru bir silme işaretleyici (aka beyaz tahta işaretleyici) ile karşıt bir işareti ile işaretleyiniz. DAPI pozitif hücrelerin ilgi doku içinde güvenin. Toplam hücre sayımı kaydedin. Işaretlerini kaldırmak için kuru bir silgi kullanın. Görüntü katmanılar içeren DAPI, doku antijeni ve CldU. CldU pozitif hücrelerin ilgi doku içinde güvenin. Record CldU hücre sayımı ama işaretlerini silmek yok. Değişim, doku antijen, CldU ve IDU içeren katmanlar görselleştirmek için görüntüler. Kont CldU IDU çift pozitif hücreler. Kayıt değeri, bütün işaretlerini silmek ve DAPI, doku antijeni ve IDU içeren katmanlar gösterilecek. Ilgi doku içinde IDU pozitif hücrelerin toplam sayısı güvenin. Tutanak IDU hücre sayımı.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Biz sırayla hemen kurban takibeden iki hafta için bir hafta ve daha sonra IDU CldU ile 6 haftalık dişi fareler etiketli. Pancreata CldU, IDU ve İnsülin (bir doku antijeni) yanı sıra DAPI algılamak için boyandı. Adacıklar düzgün insülin ile boyandı. CldU lekeli çekirdekleri ayrı IDU lekeli çekirdekleri (Şekil 2). Adanın dışında birçok çekirdekleri CldU IDU co-pozitif (Şekil 2, sağ alt, beyaz oklar). CldU ve IDU (Şekil 2, sağ alt, kırmızı ok), tek bir insülin pozitif hücre nükleer boyanma vardı.

Fareler. Philadelphia Çocuk Hastanesi IACUC komitesi yönergelere göre fare ile tüm deneyler yapıldı. Philadelphia Çocuk Hastanesi, laboratuar hayvanları tesiste ev sahipliği Taconic (Germantown New York), PMI Beslenme International (Richmond. Indiana) beslenen Fare Diyet 5015 Kadın B6.129 F1 wild-tip farelerden satın alındı.

Strateji Etiketleme. IDU (bu şemada kırmızı işaretli) CldU ile ilk hücre bölünmesi olayı (Bu planın yeşil işaretli) ve ikinci bir hücre bölünmesi etiketleme, CldU ve IDU (yeşil / kırmızı) ile birlikte etiketli hücreleri sıralı hücre bölünmesi sonuçları .

Farelerde içinde pankreas hücre yenilenmesini timidin etiketleme Temsilcisi sonuçlar. Langerhans Adacık merkezinde bir fare pankreas Immunofluorescent görüntü. Fare hemen kurban öncesi 2 hafta içme suyu için 1 hafta sonra IDU CldU ile doluydu. Pankreas örnek protokolünde açıklandığı gibi işlendi. 40x objektif görüntüler, farklı katmanları için uygun sayım görüntülenir. Birleştirilmiş görüntüler DAPI (beyaz) CldU (yeşil), IDU (kırmızı), İnsülin (sarı) içerir. (Üst, sol) DAPI ve insülin. (Üst, sağ) CldU ve İnsülin. (Alt, sol) IDU ve İnsülin. (Sağ alt) CldU, IDU ve İnsülin. Ölçek çubuğu: 100μm.

Şekil 1
Şekil 1. Etiketleme stratejisi. IDU (bu şemada kırmızı işaretli) CldU ile ilk hücre bölünmesi olayı (Bu planın yeşil işaretli) ve ikinci bir hücre bölünmesi etiketleme, CldU ve IDU (yeşil / kırmızı) ile birlikte etiketli hücreleri sıralı hücre bölünmesi sonuçları .

Şekil 2
Şekil 2 farelerde içinde pankreas hücre yenilenmesini timidin etiketleme Temsilcisi sonuçları. Langerhans Adacık merkezinde bir fare pankreas Immunofluorescent görüntü. Fare hemen kurban öncesi 2 hafta içme suyu için 1 hafta sonra IDU CldU ile doluydu. Pankreas örnek protokolünde açıklandığı gibi işlendi. 40x objektif görüntüler, farklı katmanları için uygun sayım görüntülenir. Birleştirilmiş görüntüler DAPI (beyaz) CldU (yeşil), IDU (kırmızı), İnsülin (sarı) içerir. (Üst, sol) DAPI ve insülin. (Üst, sağ) CldU ve İnsülin. (Alt, sol) IDU ve İnsülin. (Sağ alt) CldU, IDU ve İnsülin. Ölçek çubuğu: 100μm.

Discussion

Hücre yenilenmesini etiketleme timidin tabanlı bir yaklaşım Bizim yaklaşımımız, biyomedikal araştırma birçok potansiyel uygulamalar vardır. Bugüne kadar, pankreas üzerinde yoğunlaşan, ama biz de hücreli deri ciro, gut, karaciğer, böbrek üstü bezi, böbrek, testis, yumurtalık, tiroid, lenf nodu, hematopoez, ve beyin 1 incelemek için bu strateji uyguladık. Çünkü, hücre yenilenmesini doku doku değişir etiketleme stratejileri ilgi organ en çekici bilgi almak için özelleştirilmiş olmalıdır. Morrison ve arkadaşları 1 gün her hematopoez 2 etiket CldU ve IDU kullandı. Kuhn ve arkadaşları, hücre yenileyici miyokardın 3 bölümü tespit etmek için her biri için 4 gün CldU ve IDU kullanın . Buna karşılık, pankreas adacık içerisinde bazal hücreli cirosu, bir doku hayvan yaşları 1,4-6 gibi minimal hücre ciro ile etiketlemek için toplam 9 ay CldU ve IDU kullandık. Çalışmalar doku homeostaz içinde hücre yenilenmesini tanımlamak için etiketleme stratejisinin en belirgin potansiyel uygulama. Ama bizim teknik birçok diğer potansiyel uygulamalar vardır. Örneğin, biz de son zamanlarda artan çoğaltma odak alanları CldU veya Idu 5 artan kuruluş tarafından kolayca tespit edilebilir onkojenik transformasyon, dokuları içinde tanımlamak için bu tekniği uygulanır . Morrison ve arkadaşları CldU ve IDU 1 gün her hematopoietik kök hücre etiket istinat davranış 2 test etmek için kullanılır. Ayrıca sıralı timidin analoğu etiketleme transit yükseltme hücreleri dokulara 1 büyüme ya da yenilenmesi için katkıda olmadığını belirlemek için başvuruda bulunmuş . Bu uygulama sıralı yönetiminde timidin analogları doku homeostazında alan hücrelerin kökeni ve hayatta kalma eğitimi için yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Timidin analogları dikkatli alınmadan kullanılamaz. Sentetik timidin analogları bölünen hücreleri için potansiyel toksisiteleri ve bunların kullanımı, teorik olarak büyüyen hayvanlarda hücre yenilenmesini olumsuz olarak etkilemektedir. Timidin analogları, kanser hastaları için ajanlar radyasyona olarak kullanılan, hücre yenilenmesini yavaşlatır. Bu nedenle biz kendi ilgi doku potansiyel toksisiteleri için dikkatli araştırmak için müfettişler çağırıyorum. Örneğin, Trumpp ve arkadaşları sistemik BrdU hematopoietik kök hücre, hücre döngüsü 7 girmek için zorlayabilir bulabilirsiniz . Örneğin, Rutter ve arkadaşları, yüksek doz timidin analogları, pankreas 8 geliştirmek için toksik olduğu görülmektedir. Daha yakın zamanlarda KineMed az Hellerstein ve arkadaşları, Inc BrdU yönetiminin özel bir ağır su etiketleme tekniği 9 kullanarak 16-25 oranında intra-adacık çoğalması yavaşlar bulundu. Hellerstein ve arkadaşları tarafından kullanılan tüm adacık hazırlıkları toplam adacık hazırlıkları kadar 50% 'sini diğer birçok endokrin ve non-endokrin hücre tipleri, içeriyordu. Ancak, biz, genç yetişkin farelerde BrdU uzun süreli infüzyon Ki67 ifadesi 4 olarak ölçülen beta hücre proliferasyonu etkilemek değildir bulabilirsiniz. Benzer şekilde, IDU CldU ve uzun vadeli yönetim beta hücre kitlesinin genişlemesi 1 bozduğu gibi görünmüyor. Ayrıca, beta hücre çoğalması oranları, zaman ve sadece birkaç saat için (eşdeğer süreler oranları normalize edilir) etiketli farelerde uzun süre BrdU etiketli fareler arasındaki eşdeğer. Birlikte, bu sonuçlar, fareler timidin analogları uzun vadeli düşük doz uygulanması ile güvenli bir şekilde tolere edebilir. Yine de, pankreatik beta hücre büyümesi timidin analogları tarafından potansiyel toksisitesi ekarte edemez. Sonuç olarak, biz timidin analogları ile fareler etiketleme kontrollerini yapmak ve diğer araştırmacılar da bunu teşvik etmek için devam ediyor.

Sıralı timidin analoğu etiketleme tekniği, tuzaklar ve teknik zorluklar olmadan değildir. Sonuç olarak, kontrol slaytlar özellikle önemlidir. Biz 1 ile çeşitli dokular oluşur kontrolü slaytlar üretilen) sadece CldU ile etiketlenmiş Fareler;. 2) Fareler sadece IDU ile etiketlenmiş; 3) sırayla CldU ve sonra IDU ile etiketlenmiş Fareler; 4) IDU ve sonra CldU sırayla ilk tersten etiketli Fare, sadece su ile etiketli sahte 5) Fare. CldU ve IDU etiket öğrenme, araştırmacılar her zaman ilgi doku slaytlar tüm 5 yukarıdaki setleri ile tüm protokol yapmalıdır.

CldU ve IDU arasında hafif çapraz reaksiyon iki timidin analogları ile etiketleme bir talihsiz ama kaçınılmaz dezavantajı. CldU ve IDU tekniği, aslında farklı türler (fare ve sıçan) BrdU karşı elde edilmiştir antiserumlar arasında yakınlık farklılıklara dayalı. Protokolü, hantal ise, bu tür çapraz reaksiyon en aza indirmek için tasarlanmıştır. Sonuç olarak, protokol adım atlama (ler) düşünen araştırmacılar arasından dikkatli çağırıyorum. Özellikle, biz varfare ve sıçan arasındaki çapraz reaktif ikincil antiserumlar bir sorunla karşılaşmadım. Bu, tamamen fare ve sıçan arasındaki çapraz emilirler Jackson antiserumların kullanımı ile minimize edilebilir.

Biz bazen timidin dahil yeterince algılamak için başarısız olur. Bu gibi durumlarda, reaktif veya adım olduğu belirlemek için pozitif kontrol slaytları kullanmak önem taşımaktadır. Güçlükleri antiserumlar, kuru slaytlar, ya da yetersiz nükleer permeabilization kötü alikotları nedeniyle genellikle. Biz, başarılı bir şekilde gelişmekte olan embriyolar ile IDU etiket başarısız oldu. Böylece, tüm dokulara IDU geçirir.

Çift timidin analoğu etiketlenmesi için CldU ve IDU Alternatifler ufukta. Edu (5 etinil-2 dezoksiuridin), bakır katalize tıklayın kimya algılama 10,11 için bir substrat olabilir . Edu algılama yöntemleri, DNA ipliklerini ayrılması ve böylece akış sitometri 12 analiz son derece mükellef değilsiniz . Edu çapraz reaktif BrdU 10 ile uyumlu değil. Edu, pankreatik beta hücreleri 13, intestinal L hücrelerinden 14 ve Epidermis 15 de dahil olmak üzere çeşitli fare dokuların hücre yenilenmesini ölçmek için kullanılır olmuştur . Edu, şu an (500mg ortalama $ 1000 ABD) oldukça pahalıdır. Yine de, Edu algılama BrdU algılama 10'dan çok daha hassas görünüyor. Bu nedenle, CldU ve IDU yerine Edu ve BrdU birleştirmek için ekonomik olabilir. Bu yöntem aynı zamanda üç farklı tur ı üç kat Edu, CldU ve IDU etiketli farelerde hücre bölünmesi algılama izin verebilir.

Özet olarak, sıralı timidin analoğu etiketleme tekniği, hücre yenilenmesini tespit için yeni bir yaklaşımdır. Biz, bizim yaklaşımımız, hücre bölünmesi daha doğru bir şekilde ölçmek için diğer bilim adamları umut ve yeni paradigmalar doku homeostazında açacağı beklenmektedir.

Disclosures

Bütün deneyler fare ile Philadelphia Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) kurallarına göre hayvan tesis yapıldı.

Acknowledgments

JDRF, NIH (R01-DK081469), Commonwealth of Pennsylvania (Rejeneratif Tıp hibe 4100043362 Merkezi) Mükemmellik, Dimes, Mart (Basil O'Connor Başlangıç ​​Akademik Araştırma Ödülü), ve Pennsylvania DERC pilot bir üniversite tarafından desteklenen ve fizibilite hibe (DK19525).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) MP Biomedicals 0210547891
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) MP Biomedicals 0210035701
4% Paraformaldehyde USB Corp., Affymetrix 19943
10% Buffered Formalin Fisher Scientific 23-427-098
XYLENES VWR international EM-XX0060-4
Ethanol, Anhydrous (Histological) Fisher Scientific A405P-4
PBS, 10X Powder Concentrate Fisher Scientific BP665-1
Triton –X-100 Fisher Scientific BP151-500
Hydrochloric Acid VWR international BDH3028-2.5LG
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Mouse Anti BrdU BD Biosciences 347580
Rat mab anti BrdU Accurate Chemical & Scientific Corporation OBT0030
Cy2 donkey anti-rat Jackson ImmunoResearch 712-225-153 Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).
Cy5 donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch 715-175-151 See above
Glass Cover Slips Sigma-Aldrich C9056-1CS
YFP Filter Chroma Technology Corp. 49003 ET EYFP Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel
Cy3 Filter Chroma Technology Corp. 49004 ET Cy3
Cy5 Filter Chroma Technology Corp. 49006 ET Cy5
ORCA ER Microscope Camera Hamamatsu Corp. C4742-95-12ER Excellent detection of fluorophores
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teta, M. Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12, (5), 817-817 (2007).
  2. Kiel, M. J. Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU. Nature. 449, (7159), 238-238 (2007).
  3. Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell. 138, 257-257 (2009).
  4. Rankin, M. M., Kushner, J. A. Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age. Diabetes. (2009).
  5. He, L. M. Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells. Mol Endocrinol. (2009).
  6. Kushner, J. A. Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent. Cell Cycle. 5, (3), 234-234 (2006).
  7. Teta, M. Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice. Diabetes. 54, (9), 2557-2557 (2005).
  8. Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, (6), 1118-1118 (2008).
  9. Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development. Dev Biol. 98, (2), 295-295 (1983).
  10. Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. 5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas. J Cell Biol. 71, (2), 341-341 (1976).
  11. Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation. J Cell Biol. 249, (6), 1953-1953 (1974).
  12. Chen, S. Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, (5), E1459-E1459 (2007).
  13. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (7), 2415-2415 (2008).
  14. Best, M. D. Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules. Biochemistry. 48, (28), 6571-6571 (2009).
  15. Buck, S. B. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, (7), 927-927 (2008).
  16. Huising, M. O. CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2), 912-912 (2008).
  17. Reimann, F. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. 8, (6), 532-532 (2008).
  18. Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate. Dev Cell. 18, (2), 317-317 (2010).

Comments

1 Comment

  1. Very detailed and well explained. Found it very useful to plan my experiments.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 25, 2011 - 10:48 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics