Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa Biyofilmler

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. A., Anderson, G. G. Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells. J. Vis. Exp. (44), e2186, doi:10.3791/2186 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakteriyel biyofilm farklı insan hastalıklarının bir numara ile ilişkili olduğu, ancak biyofilm gelişimi genellikle cansız yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu çalışmada, kültür ortamında yetişen insan hava yolu epitel hücreleri (CFBE hücre) oluşturan Pseudomonas aeruginosa biyofilm için protokolleri açıklar. İlk yöntem (Statik Co-kültür Biyofilm Modeli olarak adlandırılan), P. aeruginosa, standart doku kültürü plakaları confluent mono tabakaları olarak yetişen CFBE hücreleri ile inkübe edilir . Bakterinin epitel hücreleri oldukça toksik olmasına rağmen, yeterince uzun arginin gecikmeler tek tabaka imha ek biyofilm için CFBE hücreleri oluşturmak için. İkinci yöntem (Akış Hücre Co-kültür Biyofilm Modeli olarak adlandırılır), biyofilm araştırma, CFBE hücrelerinin konfluent tek tabaka destekleyen bir cam lamel karşılamak için genellikle kullanılan bir biyofilm akış hücresi aparatı, adaptasyonu içerir. Bu tek tabaka P. inoküle aeruginosa ve peristaltik bir pompa sonra hücreler boyunca taze orta akar. Her iki sistemde de, bakteriyel biyofilm aşılama sonrası 6-8 saat içinde oluşur. Biyofilm Görselleştirme P. tarafından geliştirilmiş. aeruginosa suşları yapısal yeşil floresan proteininin (GFP) dile getirdi. Statik ve Akış Hücre Co-kültür Biyofilm deneyleri erken P. için model sistemler Kistik Fibrozis (KF) akciğer, ve bu tekniklerin P. aeruginosa enfeksiyonu farklı yönlerini izin aeruginosa biyofilm oluşumu ve virülans biyofilm sitotoksisite, biyofilm CFU ölçümü ve biyofilm boyama ve görselleştirme dahil olmak üzere, ele alınmalıdır.

Protocol

1. Statik Co-kültür Biyofilm Modeli

  1. Statik Co-kültür Biyofilm Model 1 aslında ΔF508 CFTR mutasyon 2,3,4 için CF homozigot bireyin geliştirilen hücrelerin ölümsüzleştirdi CFBE41o-hücrelerinin (CFBE hücre), kullanır. CFBE hücreleri, / 6 iyi doku kültürü plakası veya 2 x 10 5% 10 fetal sığır serumu ile desteklenen 24-kuyu asgari bir temel orta doku kültürü plaka (MEM), 10 6 hücreli bir konsantrasyon numaralı seribaşı olmalıdır 2mm L-glutamin, 50 U / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin. Biz de başına 1.5 ml orta, 6-kuyu plakaları ve 24-kuyucuğu başına 0.5 ml orta kullanın.
  2. Hücreler 37 yetiştirilen ° C olmalıdır ve bakteri ile aşılama önce konfluent tek tabaka oluşturacak şekilde 7-10 gün için% 5% 2 -95 hava CO. Orta, 2-3 günde bir değiştirilmesi gerekir. Bu koşullar konfluent tek tabaka oluşumu ve sıkı kavşak yol açtığı gösterilmiştir.
  3. 37 ° 18 saat için 5 ml LB P. aeruginosa büyütün ° C 200 rpm'de bir kuluçka çalkalayıcı. Bu koşullar altında, P. aeruginosa kültürler genellikle 5x10 9 CFU / mL yoğunluğu ulaşacak.
  4. Bakteriyel aşılama için, CFBE hücrelerin orta çıkarın ve 2 mM L-glutamin (Mikroskopi medium) ile desteklenmiş fenol kırmızısı olmadan eşit hacmi, MEM ekleyin. Konfluent CFBE mono tabakaları P. ile inoküle başlangıçta numaralı seribaşı CFBE hücrelerinin sayısı yaklaşık 30:1 göreceli bir enfeksiyon çokluğu aeruginosa. Bu X 1,5 mL MEM 10 7 CFU / ml / 6 kuyucuğu ve 1.2 X 10 (7), 0.5 ml MEM CFU / mL / iyi 24 kuyucuğu 2 eşittir.
  5. 37 az 1 saat inkübe plakaları ° C ve% 5 CO 2 -95% hava.
  6. 1 saat inkübasyondan sonra, süpernatant,% 0.4 arginin ile desteklenmiş taze Mikroskopi orta ile kaldırıldı ve yerini olmalıdır.
  7. 37 ° ° C'de ve% 5 değişik zaman noktalarında (yaklaşık 8 saat), CO 2 -95% hava ve faz kontrast mikroskobu kullanılarak CFBE tek tabaka bütünlüğünü analiz . Hava yolu hücreleri olmayan konfluent iseniz, P. aeruginosa hızla (dakikalar içinde) hücrelerin bazolateral yüzeyinde erişmek ve hücresel bütünlük yok. P. ile inokülasyonu yapısal Epifloresans veya konfokal mikroskopi tarafından görüntülenmiştir olabilir floresan biyofilm mikrokoloniler GFP sonuçları ifade aeruginosa suşları.
  8. Bakteriyel biyofilm CFU planktonik bakterileri ortadan kaldırmak için fosfat tamponlu salin (PBS) ko-kültür 2-3 kez çamaşır tespit edilebilir. Yıkama takiben 10-15 dakika süreyle PBS veya MEM Triton X-100, epitel hücreleri lyse ve biyofilm dağıtmak için% 0.1 ile tedavi.
  9. 3 dakika boyunca vorteksleyin ve lizat seri dilüsyonları hazırlamak. Plaka bu LB agara dilüsyonları ve 37 ° gece inkübe ° C CFU belirlemek için ertesi gün kolonileri sayın.

2. Akış Hücre Co-kültür Biyofilm Modeli

  1. Akış Hücre Co-kültür Biyofilm Modeli (akış tahlil) CFBE hücreler 5 karşılamak için standart biyofilm akış hücresi aparatı modifikasyonu içerir.
  2. 100 mL temiz bir behere birkaç 40 mm çaplı cam lamelleri yerleştirin. 2 kat üzerine alüminyum folyo ve kuru bir döngü 20 dakika otoklav ile sıkıca örtün.
  3. Bir hücre kültürü kaputu Çalışma, steril bir 60 mm çaplı plastik tabak içine etanol yıkanmış forseps ve yer kullanarak kaptan bir steril lamel yakala.
  4. Altında sıkışıp herhangi bir kabarcık kaldırmak ve plastik çanak alt lamel zorlamak için pipet ucu ile lamel basarak, önceden ısıtılmış hücre büyümesi orta, 3 mL ekleyin.
  5. Tohum 2x10 6 çanak başına hücreleri ve çanak yavaşça ileri ve geri sallayın. Yemeğin yanında karşı hücreler santrifüj önlemek için dönen kaçının.
  6. 37 ° C'de% 5 CO 2 -95% hava inkübatör çanak koyun ve her gün 8 ila 10 gün için 3 ml taze besi hücreleri beslemek. Hücreler cam lamel konfluent tek tabaka oluşturacak.
  7. P. büyütün 37 18 saat için 5 ml LB aeruginosa ° C inkübatör çalkalayıcı 200 rpm'de. Bu koşullar altında, P. aeruginosa kültürler genellikle 5x10 9 CFU / mL yoğunluğu ulaşacak. Biz P. aeruginosa suşu PAO1 GFP 6 kurucu ifade pSMC21 plazmid taşıyan.
  8. Bakteri kültürü, steril bir mikrosantrifüj tüpe 1 ml ekleyin. 3 dakika 6000 rpm'de santrifüj, 1 mL Mikroskopi orta bakteriyel pelet iki kez yıkayın.
  9. ~ 5x10 8 CFU / ml 'lik bir konsantrasyon elde etmek için, 4.5 ml Mikroskopi ortama yıkanmış ve yeniden süspanse bakteriler 0.5 ml sulandırınız .
  10. Canlı hücreler gözlenmesigerçek zamanlı bir peristaltik pompa (uzun uzunlukları için bir besin akışını sağlamak için) ve sıcaklık kontrolörü ile birleştiğinde bir görüntüleme odası gerektirir. Biz Bioptechs FCS2 (Focht Live-Cell) uygun uzunlukları 1 / 16 ile düşük bir akış mikro-perfüzyon pompa inci C-flex boru kesme bağlı kısırlık için otoklava odasına ve FCS2 oda denetleyicisi üzerinden sıcaklık düzenlenir kullanın. Biz mikroskop hemen yanında bulunan 37 ° C su banyosunda giriş kaynağı orta tutmak.
  11. Akışını odasının birleştirin. FCS2 odası kendi kendini kilitleme tabanı (görüntüleme sırasında sahne adaptör üzerinde oturur) ve perfüzyon tüpleri ve oda kontrolörü bağlı bir üst yarısında içerir. Devrildiğinde önce odasının baş-aşağı, montajı ve sahne adaptörü üzerine yerleştirilir. Odanın üst yarısında baş aşağı perfüzyon tüpler görünür olduğundan tutun ve perfüzyon tüpleri üzerine 0.75 mm kalınlığında kauçuk conta boşluk delikleri hizalayın. Yivli yüzü yukarı olduğundan emin olun, lastik conta üstüne odasına microaqueduct slayt Yığın ve kauçuk conta slayt üstüne başka bir yerde. Bu ikinci conta kalınlığı ve iç geometri odasının hacmi belirleyecektir. Biz genellikle 30 mm yuvarlak iç geometri ile 0.75 mm kalınlığında kauçuk conta ile çalışır.
  12. 1 ml ekleyin önceden ısıtılmış (37 ° C) slayt merkezinde Mikroskopi orta.
  13. Hücre kültürü inkübatör 60 mm çanak al, harcanan orta kaldırmak ve hücreler, önceden ısıtılmış Mikroskopi orta 3 ml ile bir kez yıkayın. Bu adım, hücre büyümesi, orta bulunan fenol kırmızısı ve antibiyotikler ortadan kaldırılması sağlar. Antibiyotik P. yok ise fenol kırmızısı, hafif floresan ve görüntüleme ile müdahale aeruginosa bakteri biyofilmler kurabilir.
  14. Etanol yıkanmış forseps kullanma, çanak lamel almak ve odasının üzerine yerleştirilir Mikroskopi orta boncuk üzerine baş aşağı düşürmek. Lamel şimdi ikinci kauçuk conta dinlenme ve hava yolu hücreleri tek tabaka aşağı karşı karşıya.
  15. Holding, bir yandan parçalarla yığının üstüne odasının tabanına yerleştirin ve böylece her şeyi sağ tarafında hızla üzerine odasına açmak. Halka çevirerek yerleştirin tabanı kilitleyin.
  16. Düşük akım mikro-perfüzyon pompası giriş tüp bağlayın ve 20 ml / saat hızında akışını başlatmak; bu akış hızı P. yüzme hızı yeteneği içinde aeruginosa. 37 yerleştirilir Mikroskopi orta bir balona pompa boru bağlantıları ikinci bir parça mikroskop hemen yanında bulunan ° C su banyosu.
  17. Steril önceden kesilmiş 1 / 16 th C-Flex boru takın, odanın giriş ve çıkış perfüzyon tüpler sıcaklık kontrolörü bağlamak, sonra ters bir floresan mikroskop mikroskop sahneye monte odasına koyun.
  18. 1 mL'lik tek kullanımlık şırınga kullanarak, in-line pompa ve oda arasında yerleştirilen iki yollu vana odasına önceden hazırlanmış bakteri süspansiyonu enjekte. Bizim özel ayar, odasına ulaşmak için bakteriyel süspansiyon 0.6 mL hacimde alır. Özellikle tüp uzunluğuna göre ses seviyesini ayarlayın. Ayrıca, pompa ve upstream yüzme ve giriş balon kirlenmesine neden olan bakterileri engellemek için iki yollu vana arasındaki filtre-line tek bir 0.22 mikron yere yararlı bulabilirsiniz.
  19. Bakterilerin hava yolu hücreleri eklemek için izin vermek için, 2h pompa durdurun. Akış sonra deney geri kalanı için yeniden başlatılmasına ve 20 ml / h muhafaza edilebilir.
  20. Tek tabaka hasar belirtileri kontrol etmek için deney boyunca diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi, hava yolu hücrelerinin bütünlüğünü izleyin. Aynı zamanda, GFP etiketli P. gelişimini takip aeruginosa ters bir konfokal veya geniş alan floresan mikroskobu ile görüntüleri satın alarak havayolu hücrelerinin apikal yüzeyinde biyofilm.

3. Temsilcisi Sonuçlar

Biz P. bir yük kullanın GFP 6 kurucu ifade sağlar pSMC21 plazmid içeren aeruginosa. Bu nedenle, bir CFBE tek tabaka üzerinde büyüyen GFP etiketli biyofilm Epifloresans mikroskopi tarafından görüntülenmiştir. Alternatif olarak, biyofilm görselleştirme etiketsiz P. boyama ile elde edilebilir 1 saat 37 ° C 1% 1 calcofluor beyaz çözümü aeruginosa.

Akış tayininde CFBE hücreleri üzerinde görüntüleme biyofilm oluşumu için, biz, ısmarlama bir sahne adaptör kullanımı, ancak Birçok şirket, artık özel donanımlı sahne adaptörler sağlayabilir. Biz ORCA-AG derin soğutma CCD kamera ve bir x60 yağ immersiyon objektif (sayısal açıklık 1.40) ile donatılmış bir Olympus IX70 inverted mikroskop ile çalışır. Filtre wtopuk 480/40 nm bant geçiren eksitasyon filtresi ve 535 / 30 nm bant geçiren emisyon filtresi ile donatılmıştır. Openlabın 4.0.3 yazılım paketi (Doğaçlama) ile dijital görüntüler elde edildi ve hacimleri Volocity 3.5.1 yazılım (Doğaçlama) kullanarak restorasyon yinelemeli tarafından deconvolved. 3D biyofilm yapıların kantitatif analiz COMSTAT görüntü analiz yazılımı paketi 7,8 ile elde edildi.

Kabul herhangi bir ko-kültür modeli için, bir model bileşenleri arasında gelişmekte olan sitotoksisite özellikle dikkat etmelidir. Statik ve akış hücre deneyleri, CFBE tek tabaka P. varlığı dayanacak bulundu. 8 saat sonra aşılama değişiklik belirtisi olmadan aeruginosa. Tek tabakalı epitel bütünlüğü ters bir mikroskop 1 (Şekil 1A) kullanarak faz-kontrast mikroskobu veya 5 deney boyunca diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi ile tespit edilebilir. Zamanla, P. aeruginosa birikir ve epitel hücre tek tabaka tamamen veya bölümler halinde (Şekil 1B-1C) zarar verebilir toksinler ve virülans faktörleri üretecektir. Sitotoksisite kantitatif epitel hücreleri serbest laktat dehidrogenaz (LDH) ölçmek için çeşitli kitleri kullanılarak değerlendirilebilir. LDH hücre parçalama veya hücre ölümü üzerine ekstrasellüler ortamda yayımlanan istikrarlı bir sitozolik bir enzimdir.

hava yolu tek tabaka bütünlüğünü tehlikeye değildir (genellikle ~ 8 saat aşağıdaki aşılama), P. aeruginosa biyofilm başarıyla formu ve havayolu hücrelerinin apikal yüzeyinde açıklanan ortak kültür modelleri (Şekil 2A-2B) gelişebilir. 3D rekonstrüksiyon (Şekil 2C) ve ölçülmesi, biyokütle birikimi doğru bir şekilde tespit edilebilir. Ayrıca birçok fenotipik deneyleri bu ko-kültür biyofilm kullandık. Örneğin, yukarıda da belirtildiği gibi, biyofilm CFU kolayca seri agar plaklarına lizat ve kaplama seyreltilmesi, epitel hücreleri parçalama tespit edilebilir. Biz farklı suşlarının antibiyotik tedavisine direnç belirlenmesinde bu tekniğin avantajlı bulduk. Ayrıca, epitel hücreleri üzerinde biyofilm toksisite piyasada bulunan LDH algılama kitleri kullanılarak ölçülebilir. Bu şekilde, biyofilm toksisitesi virülans faktörleri rol değerlendirilebilir. Bu model sistemler de organizatörü füzyon çalışmaları, RT-PCR ve mikroarray analizi 1,5,9 de dahil olmak üzere bir dizi gen ekspresyonu uygulamaları desteklemektedir.

Şekil 1
Şekil 1. CFBE hücreleri ve temsili görüntüler, Monolayer nedeniyle havayolu hücre mono tabakaları P. için tehlikeye ve hasar aeruginosa biyofilm büyüme (A) CFBE hücrelerinin doku kültürü plakaları yetiştirilen konfluent tek tabaka Temsilcisi görüntü, faz-kontrast mikroskobu ile değerlendirildi. Ölçeği bar, 120 mm. (B) Örnek bir tehlikeye CFBE tek tabaka. Tek tabaka hasar henüz belirgin gözle görülür gösterilecek etmese bile, P. aeruginosa bakteri, epitel hücreleri ve bazolateral zarlarında kazanıyor sıkı kavşaklar arasında yayıldığı görülür . Biyofilm oluşumu genellikle bozulan tek tabaka nedeniyle bu şartlar altında elde değil. Ölçeği bar, 20 mm. (C) Örnek büyümüş bir P. aeruginosa biyofilm 24 saat sonrası aşılama gözlemledi. Biyofilm oluşumu başarıyla destekleyen sonra, CFBE tek tabaka zarar görmüş ve tamir edilemeyecek artık neredeyse hiç yok. Bakteri düz bir tabaka olarak büyüyor Artık biyofilm, cam lamel takılarak gösterilmiştir. Ölçeği bar, 20 mm.

Şekil 2
Şekil 2 P. GFP-ifade P. aeruginosa Statik Co-kültür Biyofilm Model ve Akış Hücre Co-kültür Biyofilm Modeli kullanarak konfluent CFBE hücrelerinin apikal yüzeyinde yetişen biyofilmler (A) Temsilcisi görüntü aeruginosa biyofilm konfluent Epifloresans mikroskobu ile değerlendirildi Statik Co-kültür Biyofilm Modeli, CFBE hücreleri kullanarak bir tek tabaka üzerinde büyüdü. Resim, faz kontrast kanal kaplama ve floresan kanal. Ölçeği bar, 35 mm. GFP etiketli P. (B) Temsilcisi görüntü aeruginosa biyofilm konfluent Akış Hücre Co-kültür Biyofilm Model CFBE hücreleri kullanarak tek tabaka 6 saat için yetiştirilir. Hava yolu tek tabaka görselleştirme kolaylaştırmak için, çekirdek P. ile aşılama öncesinde 30 dakika süreyle 10 mcg / mL Hoechst 33.342 (Molecular Probes) ile boyandı aeruginosa. Birleştirilmiş ve yalancı görüntüler diferansiyel girişim kontrast (DIC) tarafından bakıldığını ve ilgili floresan görüntüleri gösterilmiştir. Yeşil kümeleri CFBE hücrelerinin apikal yüzeye bağlı olarak başvuran Biyofilmler, hava yolu hücreleri dağılmış. Ölçeği bar, 20 mm. (C) Üç boyutlu rekonstrüksiyo6 saat yaşındaki P. tipik mantar gibi yapılar gösteren z-serisi görüntü yığınları ÇALIŞMA aeruginosa biyofilm CFBE bir hücre tek tabaka oluştururlar. Ölçeği bar, 10 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biyofilmler çevresel uyaranlara yanıt form bakteri toplulukları. Bu çevresel sinyaller, bir yüzey, toplama, exopolysaccharides üretim ve artan antibiyotik direnci 10 gibi diğer fenotipleri bağlanarak her bakteri içinde küresel düzenleyici değişimlere neden olmaktadır . Son birkaç on yıllar boyunca, pek çok kanıt biyofilmler kronik enfeksiyonların patogenezi büyük bir rol oynadığı hipotezini desteklemiştir. Örneğin, çok iyi kabul edilir P. aeruginosa, biyofilm 11 oluşturarak, Kistik Fibrozis (KF) hastalarda akciğerleri kronik enfeksiyonların kurmak mümkün. CF, CFTR genindeki mutasyonların uygunsuz klorür sekresyonunu 12 yol açan bir genetik bozukluk . KF hastalarının genellikle havayolu fizyoloji mikrobik 13 eş zamanlı, hava yollarında kalın bir mukus fişler önde gelen ve değiştirilmediğini deneyim. Geç ergenlik, CF solunum yollarının hakim enfeksiyöz ajan P. aeruginosa, antibiyotikler 14 dirençli kronik bir biyofilm enfeksiyon.

Bu yazıda anlatılan protokoller yaşayan akciğer hücreleri üzerindeki biyofilm oluşumu eğitimi için model sistemler olarak hareket etmek geliştirilmiştir. Bakteriyel biyofilm, birçok hastalık durumlarında rol ve, ama, çoğunlukla, cam ve plastik 15,16 gibi cansız katı yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Sadece abiyotik yüzeylerde biyofilm oluşumunu ve gelişimini inceleyerek, bir patojen ve sadece Yukarıdaki protokollerin açıklandığı gibi bir model sistemi ile oluşabilir ev sahibi arasında önemli etkileşimler eksiktir. Özellikle, Statik Co-kültür Biyofilm Model ve Akış Hücre Co-kültür Biyofilm Model P. yeteneği yararlanmak aeruginosa ile etkileşim ve akciğer epitel yüzeyine bağlamak. Bu modelleri kullanarak, ko-kültür biyofilm antibiyotik tedavisine yanıt benzersiz olduğunu ve bu modellerin doğru bulaşıcı devlet 1,5 yansıtmak için daha fazla olduğunu göstermiştir. Bu bakımdan, biz, P.> tarafından tobramisin artar direnci 25 kat daha bildirdin aeruginosa biyofilm cam 5 gibi abiyotik yüzeyler üzerinde yetiştirilen biyofilm göre hava yolu hücreleri üzerinde yetiştirilmektedir. Bu teknikler akciğer 17 erken kolonizasyon sırasında meydana gelen olayları yansıtıyor olması muhtemeldir. Bu nedenle, ko-kültür model sistemler P. CF epitel erken enfeksiyon anlamak için yenilikçi araçlar temsil aeruginosa 1.

Doku kültürü sistemleri yaygın olarak host ve patojen arasındaki etkileşimleri anlamak için istihdam edilmiştir. Biz canlı insan epitel hücreleri üzerinde biyofilm oluşturan bu etkileşimlerin bir adım daha ileri almış. Gelecekte, modelleri değiştirilmiş sürümlerini burada açıklanan diğer bulaşıcı devletlerin farklı bakterilerin biyofilm oluşumunu araştırmak için potansiyel olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Biz bu modellerin geliştirilmesinde rehberlik ve önerileriniz için G. Ç Toole teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kistik Fibrozis Vakfı (ANDERS06F0 GGA, STANTO07RO ve STANTO08GA BAS), Ulusal Sağlık Enstitüleri (GGA ve R01-HL074175 - BAS T32A107363) tarafından desteklenen ve Biyomedikal Araştırma Mükemmellik için, Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezleri Merkezi (BAS Cobre P20-RR018787).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FCS2 (Focht Live-Cell) chamber Bioptechs 060319131616
FCS2 chamber controller Bioptechs 060319-2-0303
40 mm glass coverslips Bioptechs PH 40-1313-0319
MEM Mediatech, Inc. #10-010-CV
MEM without phenol red Mediatech, Inc. Mediatech, Manassass, VA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
  2. Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
  3. Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
  4. Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
  5. Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
  6. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
  7. Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146, (Pt 10), 2409-2415 (2000).
  8. Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  9. Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
  10. Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
  11. Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, Suppl 2. 49-54 (2005).
  12. Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
  13. Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
  14. Furukawa, S., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
  16. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
  17. Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).

Comments

4 Comments

  1. HI thanks for this video it was really great. I was wondering if you have tried using A549 cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 12:28 PM
  2. Not to my knowledge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 5:27 PM
  3. Can this system be used to study effect of various antibiotics on P.
    aeruginosa biofilm formation

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2011 - 11:14 PM
  4. Yes, and we have done so (see references #1 and #5 of the protocol).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 8, 2011 - 1:42 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics