Bal arısı burnumun Extension Tepki Klasik Koşullanma Davranış Farmakoloji ( Apis mellifera)

* These authors contributed equally
Neuroscience
 

Summary

Biz sistemik ilaç uygulama tarafından bal arıları iştahlı bir koku alma klima paradigma (Apis mellifera) bir davranış farmakoloji yöntemi nasıl uygulanacağını göstermektedir. Bu yöntem, soruşturma mekanizmalarının altında yatan basit ve güvenilir bir şekilde öğrenme ve bellek oluşumu sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282, doi:10.3791/2282 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bal arısı (Apis mellifera), iletişim ve yönlendirme becerileri ve etkileyici öğrenme yeteneği 1,2 bilinmektedir. Bir bal arısı kolonisi hayatta gıda kaynaklarının sömürülmesi bağlı olduğundan, toplayıcı arıların öğrenmek ve değişken çiçek sitelerin yanı sıra karlılık ezberlemek. Toplayıcı arılar doğal ortamda kolaylıkla eğitilebilir bir beslenme yerinde yem ve koku veya renk olarak ilgili sinyalleri öğrenmeye. Iştahlı ilişkisel öğrenme klima bireysel harnessed bal arıları 3,4 burnumun uzantısı yanıt (PER) tarafından da laboratuarda kontrollü şartlar altında incelenebilir. Bu öğrenme paradigması, basit ve son derece güvenilir bir şekilde 5-12 öğrenme ve bellek oluşumu altında yatan nöronal ve moleküler mekanizmaların çalışma sağlar. Davranış farmakolojisi yaklaşım moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılır. İlaçlar, öğrenme ve bellek oluşumu 13-16 sırasında ya da sonrasında belirli molekülleri fonksiyonu ile müdahale sistemik olarak enjekte edilir .

Burada PER klima harnessed bal arıları nasıl eğitmek ve arı uçuş kas içine enjeksiyon yoluyla sistemik ilaçların nasıl uygulanacağını göstermektedir.

Protocol

1. Hive yakalamak arı

  1. 2 ve 16:00 arasında, deney başlamadan bir gün önce, arıların kovanı terk yakalanmış. Bunu yapmak için, UV ışık geçirgen pleksiglas piramit (yükseklik = 30 cm, apeks 3,5 x 3, 5 cm, taban 18 x 18 cm), apeks ve baz kapaklı, 20 düzenleniyor baz açık ve apeks ile kovan girişinin önünde 30 cm mesafe arıların kovanı terk piramidin tabanına girmek o kadar kapalı. Taban sonra kapalı ve yakalanan arılar daha fazla kullanım için laboratuvar haline getirilir.

2. Cam şişeler içine Piramit arı aktarma

  1. Laboratuarda, piramidin tabanı üzerinde yer almaktadır. Piramidin duvarları kararmış (örneğin bir havlu ile), fakat apeks bırakıldığı. Çünkü olumlu phototaxis, arılar açıldığında apeks ile piramit bırakacaktır. Bir tek, arılar açık apeks üzerine şişeleri tutarak piramit cam şişe içine transfer edilir. Bir flakon arı başına kullanılır. Bu nedenle, apeks bir arı flakon girdiğinde kapalıdır.

3. Tüpler Harnessing arı

  1. Arılar 2.5-3.5 dakika buz cam şişe soğutma immobilize. Arı izlemek ve en kısa sürede durduğu buz kaldırmak için tavsiye edilir.
  2. Immobilize tek bir arı burnumun özgürce değil, kafa, toraks veya bacaklarda hareket etmek mümkün olduğu gibi yapışkan bant ile küçük bir plastik tüp, koşulmuştur. Boyun sıkıştırılmış olmadığı önemlidir.
  3. Her arı plastik bir tüp içinde sabit, daha iyi yol tutuşu ve tanımlama için bir raf numaralı kuyu içi içine konur. Klima ya da hafıza alımı için tüp çıkarıldıktan sonra her zaman tam olarak aynı Kuyu döndü.

4. Besleme arı

  1. Ilk akşam (4-6 pm), yakalanmadan sonra, arılar, sakkaroz çözeltisi (0,88 M, musluk suyu içinde çözünmüş rafine beyaz ev şeker) ile doyma beslenir. Bir arı beslemek için, PER sukroz solüsyonu ile antenlerine değdirerek ve hayvan sakaroz çözeltisini bir damlacık (4 mcL) harcamasına izin tarafından ortaya. Onların antenleri sakaroz çözeltisini dokunduğu zaman artık hızlı ve güvenilir bir BAŞINA göstermek kadar arı sürekli birbiri ardına beslenir.
  2. Deney arıların sonraki her akşam (4-6 pm) 1 damlacık sakaroz çözeltisini (4 mcL, 0,88 M, musluk suyunda çözülmüş rafine beyaz şeker) ile başka bir dört kez ardına beslenir. Sakaroz çözeltisini, beslenme sırasında arı antenler veya burnumun ve tüpler, sukroz solüsyonu ile kontamine değildir bulaşmış olduğu önemlidir. Arılar sakaroz stimulus ile eğitim bağlamında ilişkilendirerek olasılığını dışlamak için klima yerinde veya yakınında verilmemelidir.

5. Harnessed arı Gecelik tutmak

  1. Arılar oda sıcaklığında bir gece boyunca plastik bir kabın içinde muhafaza edilir. Musluk suyu kase (yaklaşık 0,5-1 cm yüksekliğinde) doldurulur. Harnessed arılar Raflar ELISA plakaları bir platform olarak kullanarak su üstündeki kase yerleştirilir. Son olarak, kase karton ile kaplıdır.

6. Olfaktör İklimlendirme

Deneyin ilk sabah (sabah 10), koku alma klima yürütülmektedir. Şartlı uyaran (CS) bir koku, koşulsuz uyaran (US) sakaroz çözümdür.

  1. Koku (örneğin karanfil yağı) 4 mcL sonra 20 ml şırınga eklenir yuvarlak filtre kağıdı (1,3 cm çap) üzerine pipetlenir. Koku, bir başlık altında pipetlenebilir ve filtre ipuçları pipet kirlenmesini önlemek için kullanılır.
  2. Harnessed arılar ile raf Klima sitesi 30 dakika yakın yerleştirilir klima prosedürü başlamadan önce, ama bir mesafeden tek arılar klimalı bir egzoz borusunun önünde yer.
  3. Şartlandırma 10 dakika arası bir deneme aralığı (ITI) ile üç koku eşleşmeleri (şartlı uyaran, CS) ve sukroz solüsyonu (koşulsuz uyaran, ABD, 1,25 M) oluşur. Bir akustik sinyal ses çalar üzerinden deneyci teslim uyaran başlangıçlı, uyaran ofset, uyaran süresi ve yerleştirme hassas zamanlama sağlar. Bir kazanım deneme hayvanın bir egzoz önünde 10 sn yerleştirme ile başlar. 10 saniye sonunda kısa bir süre önce koku içeren şırınga arı arı Kullanıcı antenler hedef önünde 3 cm yerleştirilir. Daha sonra, koku 20 ml şırınga ile hava basarak, 5 saniye için sunulmuştur. Ilk 3 saniye sonra her iki anten distal kamçı, kürdan ve hayvanlar 4 sn moistend kürdan yalamak için izin çözüm nemlendirilmiş bir sakaroz ile dokundu. 13 saniye CS stimülasyon biter, arılar sonra eğitim bağlamında alınır ve geri rafa yerleştirilir. Toplamda bir eğitim deneme 28 sn sürer.
    Arı antenleri, ne de burnumun ne Klima sonra sakaroz ile kaplı olduğu önemlidir. Bu nedenle kürdan sadece sukroz solüsyonu ile ve kürdan sakaroz çözeltisini formu herhangi bir damla olduğunu nemlendirilmiş olduğunu sağlanmalıdır.
  4. Klima sonra rafları kase içinde geri yerleştirilir.
  5. Deney sırasında hayvanların davranışlarını, yani yerleştirme ve CS ve ABD sunum sırasında BAŞINA oluşumu izlenir ve deneyci tarafından not.

7. Bellek Tutma

  1. Tutma testleri, herhangi bir zaman aralığı (gün dak) yapılabilir. Hafıza testi başlamadan önce arılar ile raf Klima sitesi 30 dakika yakın yerleştirilir.
  2. Bir bellek testinde, ABD sunum olmadan 5 sn CS sunum oluşur. Egzoz önünde 10 sn hayvan yerleştirme testi ile başlar. Daha sonra, yukarıda açıklandığı gibi koku 5 sn sunulmuştur. Hayvan davranışı, yerleştirme sırasında yani BAŞINA oluşumu ve CS sunum, deney sırasında not.
  3. Deneyin sonunda burnumun genişleme yanıt yine hayvan hala burnumun uzatmak mümkün olduğundan emin olmak için, sukroz solüsyonu ile antenlerine değdirerek tarafından ortaya.

8. Sistemik Enjeksiyon

Sistemik enjeksiyon zaman noktası, deneysel tasarım bağlıdır.

  1. Küçük bir delik, bir tek derialtı iğne (21 G) kullanarak uçuş kas 17 Yukarıdaki scutal fissür yanında scutum arka kısmının cuticula yapılır .
  2. Cam bir kapiler tüp kullanarak, 1 mcL çözüm uçuş kas içine cuticula delikten enjekte edilir. Eğitimli deneyciler enjeksiyon ve klima hassas bir zamanlama sağlayan, her 30 saniyede bir arı enjekte etmek mümkün.

9 - Deney sırasında Besleme arı

  1. Klima sonra akşam (4-6 pm), arılar sakaroz çözeltisini 1 damlacık (4 mcL, 0,88 M, musluk suyu içinde çözünmüş rafine beyaz şeker) ile başka bir dört kez ardına beslenir. Sakaroz çözeltisini, beslenme sırasında arı antenler veya burnumun ve tüpler, sukroz solüsyonu ile kontamine değildir bulaşmış olduğu önemlidir. Arılar sakaroz stimulus ile eğitim bağlamında ilişkilendirerek olasılığını dışlamak için klima yerinde veya yakınında verilmemelidir.

10 Veri Toplama ve Veri Analizi

  1. Deney sırasında probosis uzantısı yanıt oluşumu izlenmektedir. Bu, açık kısaydı bir sanal hattı geçerken, CS ve ABD'nin sunumu (eğitim sırasında) başlangıcı arasındaki veya CS sunum sırasında (test aşamasında) burnumun uzanır bir arı olumlu puan aldı.
  2. Analiz hayvanlarda dahil olmak için iki kriterin yerine getirilmesi gerekir: tüm deney hayatta gerekir ve bu deney sonunda sakaroz çözeltisini koşulsuz burnumun uzantısı yanıt (PER) göstermek zorundadır. Her CS tanıtımı için satın alma ve saklama testleri sırasında BAŞINA gösteren arıların yüzde çizilir.

11. Temsilcisi Sonuçlar:

İki deneyleri burada sunulmaktadır.

Ilk deneyde, fosfat tamponlu salin (PBS sistemik enjeksiyonu etkisi bakmak; mM: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7 , 2) uzun vadeli öğrenme ve bellek oluşumu. Arıların üç gruba 10 dakika arası bir deneme aralığı ile üç CS-ABD eşleşmeleri ile eğitilmiştir olmayan bir tedavi edilen grup, bir grup eğitim öncesi 1 mcL PBS 30 dakika ile enjekte edildi ve sahte-enjekte edilen grupta tedavi PBS-enjekte edilen bir grup olarak değil, PBS enjekte etmeden aynı şekilde. Eğitim bellek 24 saat sonra her üç grupta da bir CS sunumu ile test edildi. Klima sırasında şartlı tepki gösteren hayvanların yüzde üç eğitim çalışmalar boyunca önemli ölçüde artar (Şekil 1, faktör kez tekrarlanan ölçüm için ANOVA F 2378 = 340.456, p <0.05). PER fark yok (ANOVA faktör grupları F2, 189 = 1,299, p> 0,05 için tekrar ölçümü için) Klima sırasında üç grup arasında gözlenen olabilir. PBS-enjekte edilen ve plasebo-enjekte edilen hayvanların arıtılmamış hayvanlar karşılaştırırken bu 24 saat tutma testi (F2, 187 = 0.752, p> 0,05) için de geçerlidir.

Ikinci deneyde üç bellek tutma inhibisyonu ve protein sentezi inhibitörü anisomycin (10 mM) sistemik üç CS-ABD eşleşmeleri 30 dakika sonra enjekte edildi eğitim dört gün sonra göstermektedir. PBS-enjekte edilen bir grup ile bir anisomycin enjekte grubun karşılaştırılması t tutma sırasında gruplar arasında önemli bir fark ortayaest (Şekil 2, faktör grup F1, 94 için tekrar ölçümü için ANOVA = 8,86, p <0.05). Bir önemli fark, günde 3 ve 4. günde hafıza testi görülebilir. Bu Wüstenberg ark sonuçları benzer 18, farklı bir protokol ile de olsa, üç CS-ABD eşleşmeleri arılar klimalı kim.

Şekil 1
Şekil 1. PBS Cuticula lezyon veya enjeksiyon satın alma ve bellek tutma değiştirmez. Hayvanlar üç CS-ABD eşleşmeleri (satın alma) ile eğitilmiştir. 24 saat sonra, bellek (Memory Tutma) test edildi. Otuz dakika eğitim öncesinde, bir delikten iki grup arasında cuticula yapıldı (lezyon, PBS) ve bu gruplardan birine 1 mcL PBS (PBS) ile enjekte edildi. Üçüncü grup (tedavi) değişmeden kalır. Sunan hayvanların her grup BAŞINA koku sunum yanıt yüzdesi. Satın alma aşamasında gruplar arasında anlamlı farklar ortaya bir ANOVA (F2, 189 = 1,299, p> 0.05) veya bellek saklama (F2, 187 = 0,752, p> 0.05). Değildir

Şekil 2
Şekil 2. CS-ABD son eşleşme 40 dakika sonra anisomycin enjeksiyon bellek tutma üç gün ve dört gün sonra eğitim azaltır. Hayvanlar üç CS-ABD eşleşmeleri (satın alma) ile eğitimli ve 1 mcL 10 mM anisomycin (Aniso) veya 1 mcL PBS ile enjekte edildi 1 saat sonra ilk eğitim çalışması. Bellek (Hafıza Tutma) 24 saat, 48 saat sonra, 72 saat ve 96 saat test edildi. Sunan bir BAŞINA koku sunum yanıt grup başına hayvanların yüzdesi. Anisomycin enjeksiyon eğitim bellek tutma 72 saat ve 96 saat sonra önemli bir azalma (F1, 94 = 8.86, p <0.05) bir ANOVA ortaya koyduğu gibi yol açar.

Discussion

  1. Yakalamak arılar deneyimli besin arayan arılar toplamak için, arılar genç arıların oryantasyon uçuşlar 19 kez kaçınarak, sabah veya öğleden sonra ya yakalanırlar. Yem makineleri ya da polen ve nektar toplamak. Şeker yanıt verme ve kendi öğrenme yeteneklerine 20 göre polen ve nektar yem arasındaki farklar gözlenmiştir. Sadece nektar yem yakalamak için, sukroz solüsyonu ile dolu yapay bir besin kaynağı kovanı ve hayvanların yanına monte edilebilir orada toplanabilir. Kovana dönen Polen yem ve arka bacaklar 20 polen sepetleri ile tespit edilebilir.
  2. Tespit ve taşıma: deney sonuna kadar öğrenmek ve hayatta kalmak için yeteneğini etkileyebilir, çünkü buz üzerinde arıların Genişletilmiş soğutma kaçınılmalıdır. Tarsi tüp içinde sakkaroz solüsyonu ile yanlışlıkla uyarılması önlemek için dikkatli bir şekilde sabit olması. Arılar succrose çözüm 3,21 ile tarsal uyarılması öğrenmek için gösterilmiştir, çünkü bu önemlidir.
  3. Olfaktör klima: klima çalışmaların sayısı arası deneme aralığını ve test süresi noktası 3,22 çalışmanın odak bağlı olarak çeşitli olabilir.
  4. Beslenme: arıların doyma düzeyi, öğrenme performansı ve bellek tutma 3,23 etkilediği bilinmektedir . Bu deneyler planlama dikkate alınmalıdır.
  5. Enjeksiyon: Hava keselerinde balarısı toraks 17 bulunmaktadır. Solunum sistemi ile ilgili bu hayati parçaları, hayatta kalmak için gerekli. Böylece bakım, enjeksiyon sırasında hava keseciklerinin zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Hava kabarcıkları serbest hava keseciklerinin zarar gösterir.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

DE Öğrenme (BFNL) Nöronal Temeli Randolf Menzel yazının önceki bir sürümüne değerli yorumları için teşekkür ediyorum: Bu çalışma, Alman Federal Eğitim ve Araştırma (BMBF) Bernstein Odak içinde Bakanlığı hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Omnifix 20 ml B. Braun Medical 4616200 V
White refined household sugar Kaisers Supermarket, Berlin, Germany
Clove oil Bombastus, Freital, Germany
Multipette plus Eppendorf 4981 000.019
Rack for 30 bee tubes Home made
Plastic tubes Home made
UV light-permeable plexiglass pyramid Home made height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm
Sticky tape Tesa, Hamburg, Germany
Capillator sticks 1-5μl Selzer
Capillator tips 1-5μl Selzer
Filter paper 0.16-0.2 mm thick Macherey-Nagel MN 616 or MN615 Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter
Disposable hypodermic needle B. Braun Medical 4657683 0.45 mm diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menzel, R., Giurfa, M. Cognitive architecture of a mini-brain: the honeybee. Trends Cogn Sci. 5, 62-71 (2001).
  2. Menzel, R., Leboulle, G., Eisenhardt, D. Small brains, bright minds. Cell. 124, 237-239 (2006).
  3. Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. Lawrence Erlbaum Associates Publishers. Hillsday, New Jersey, Hove, London. (1990).
  4. Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical-Conditioning of Proboscis Extension in Honeybees (Apis-Mellifera). J. Comp. Psyc. 97, 107-119 (1983).
  5. Menzel, R., Muller, U. Learning and memory in honeybees: from behavior to neural substrates. Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).
  6. Menzel, R. Memory dynamics in the honeybee. Journal of Comparative Physiology A-Neuroethology Sensory Neural and Behavioral Physiology. 185, 323-340 (1999).
  7. Menzel, R. Searching for the memory trace in a mini-brain, the honeybee. Learn. Mem. 8, 53-62 (2001).
  8. Eisenhardt, D. Learning and memory formation in the honeybee (Apis mellifera) and its dependency on the cAMP-protein kinase A pathway. Animal Biology. 56, 259-278 (2006).
  9. Hourcade, B., Muenz, T. S., Sandoz, J. C., Rossler, W., Devaud, J. M. Long-term memory leads to synaptic reorganization in the mushroom bodies: a memory trace in the insect brain. J. Neurosci. 30, 6461-6465 (2010).
  10. Denker, M., Finke, R., Schaupp, F., Grun, S., Menzel, R. Neural correlates of odor learning in the honeybee antennal lobe. Eur. J. Neurosci. 31, 119-133 (2010).
  11. Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst. Neurosci. 2, 3-3 (2008).
  12. Okada, R., Rybak, J., Manz, G., Menzel, R. Learning-related plasticity in PE1 and other mushroom body-extrinsic neurons in the honeybee brain. J. Neurosci. 27, 11736-11747 (2007).
  13. Muller, U. Prolonged activation of cAMP-dependent protein kinase during conditioning induces long-term memory in honeybees. Neuron. 27, 159-168 (2000).
  14. Locatelli, F., Bundrock, G., Muller, U. Focal and temporal release of glutamate in the mushroom bodies improves olfactory memory in Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 11614-11618 (2005).
  15. Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera. J. Neurosci. 25, 4485-4492 (2005).
  16. Stollhoff, N., Eisenhardt, D. Consolidation of an extinction memory depends on the unconditioned stimulus magnitude previously experienced during training. J. Neurosci. 29, 9644-9650 (2009).
  17. Snodgrass, R. E. Anatomy of the honeybee. Comstock Publishing Associates. New York. (1956).
  18. Wustenberg, D., Gerber, B., Menzel, R. Short communication: long- but not medium-term retention of olfactory memories in honeybees is impaired by actinomycin D and anisomycin. Eur. J. Neurosci. 10, 2742-2745 (1998).
  19. Vollbehr, J. Zur Orientierung junger Honigbienen bei ihrem 1. Orientierungsflug. Zool. Jb. Physiol. 79, 33-69 (1975).
  20. Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp Physiol [A]. 185, 1-10 (1999).
  21. Sanchez, B. rito, G, M. Behavioral studies on tarsal gustation in honeybees: sucrose responsiveness and sucrose-mediated olfactory conditioning. J. Comp Physiol A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 194, 861-869 (2008).
  22. Menzel, R., Manz, G., Menzel, R., Greggers, U. Massed and spaced learning in honeybees: the role of CS, US, the intertrial interval, and the test interval. Learn. Mem. 198-208 (2001).
  23. Friedrich, A., Thomas, U., Muller, U. Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory. J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).

Comments

5 Comments

  1. I'm curious about the way you mount the bees. I work in a bee lab at the University of Puget Sound in Tacoma Washington in the USA, and we've been using shaped 1000 micro-pipette tips for mounting and two pieces of tape to keep the bees strapped. For various reasons I've decided that I wanted to change my mounting set up to one similar to yours. What sort of tape do you use over the shoulder and back? I've tried string, tape, and other little strapping devices and I haven't found one yet that seems as easy as the method you use.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 7, 2011 - 2:52 PM
  2. Dear J. Preston Van Buren,
    First of all please apologize for the late response. The tape we are using is from the company ²²0;tesa²²1; and the specific product is called ²²0;tesa® extra Power Perfect²²1;. The product number is 56341. You can easily find this product on their webpage. If you have any additional questions, remarks or suggestions let me now.
    Johannes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 13, 2011 - 10:24 AM
  3. This "tesa" tape is what you use to secure the back of the bee, right? Is this also the tape you use to strap over the bee's shoulder to keep her head from moving? From the video it looks like you're using the blue tape for the bee's back, but a white tape for the bee's shoulder. What type of tape is this white tape? Thank you for your help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2011 - 4:30 PM
  4. The blue and the white tape is exactly the same tape type. At the neck as well as on the back we place a second layer of the same tape type at the holding tape to make sure that the bees do not stick on to the otherwise exposed sticky side. But all the tape we are using is the same just different colors.
    Greetings Johannes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 15, 2011 - 3:39 AM
  5. Just a quick question- do you know if bees that had been removed from the hive for a longer time period, say ² or 3 days, would still retain the scent? That is to say, would bees that no longer are part of a hive still learn a new scent and exhibit a PER, or would they have no interest in doing so?
    Also, I really enjoyed your video presentation and experiment. Thanks for sharing!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2011 - 7:29 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics