वयस्क मच्छरों (ए gambiae) में आरएनएआई Assays के लिए प्रोटोकॉल

Biology

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Summary

रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण मच्छरों में वेक्टर रोगजनकों के लिए जो जीन underly प्रतिरोध का निर्धारण करने के लिए अत्यंत उपयोगी सिद्ध कर दिया है. यह वीडियो एक Dimopoulos प्रयोगशाला द्वारा प्रयोग किया जाता विधि एनोफ़ेलीज़ gambiae, मच्छरों, जो मलेरिया परजीवी बंदरगाह में dsRNA इंजेक्षन प्रोटोकॉल दिखाता है. इंजेक्शन सेटअप छेड़खानी और छाती में dsRNA इंजेक्शन तकनीक सचित्र है.

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Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230, doi:10.3791/230 (2007).

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Abstract

रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण मच्छरों में वेक्टर रोगजनकों के लिए जो जीन underly प्रतिरोध का निर्धारण करने के लिए अत्यंत उपयोगी सिद्ध कर दिया है. यह वीडियो एक Dimopoulos प्रयोगशाला द्वारा प्रयोग किया जाता विधि एनोफ़ेलीज़ gambiae, मच्छरों, जो मलेरिया परजीवी बंदरगाह में dsRNA इंजेक्षन प्रोटोकॉल दिखाता है. इंजेक्शन सेटअप छेड़खानी और छाती में dsRNA इंजेक्शन तकनीक सचित्र है.

Protocol

मच्छरों में आरएनएआई की मध्यस्थता जीन मुंह बंद पूर्व और विशिष्ट dsRNAs है कि ब्याज की जीन लक्ष्य की तैयारी शुद्धि की आवश्यकता है. DsRNA संश्लेषण के लिए, हम Ambion Megascript किट जो इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में T7 पोलीमरेज़ की मध्यस्थता शाही सेना का उपयोग करता है की सलाह देते हैं. DsRNA शुद्धि के लिए, हम Qiagen RNeasy किट की सिफारिश. DsRNA के नमूने और मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए 3 μg / μL पानी में समायोजित. ठीक - इत्तला दे दी संदंश, गिलास स्लाइड, कांच microcapillary सुइयों, microinjector (हम है Drummond Nanoject द्वितीय का उपयोग करें), एक प्रकाश एक ठंडा ब्लॉक, एक कवर गिलास पेट्री डिश, कागज तौलिए और बर्फ की बाल्टी के ऊपर घुड़सवार माइक्रोस्कोप: अन्य सामग्री आप की आवश्यकता होगी शामिल . तुम भी एक तरह कपास 10% sucrose में भिगो गेंद के रूप में एक खाद्य स्रोत के साथ साथ मच्छरों और उनके लिए उपयुक्त कंटेनर इकट्ठा की आवश्यकता होगी.

  1. अपने मच्छरों को ले लीजिए, एक बैटरी संचालित Aspirator का प्रयोग, मच्छरों आप इंजेक्षन करना चाहते हैं. एक कागज तौलिया या कपास तो कोई मच्छरों से बचने और जलाशय निकाल सकते हैं के साथ नोक प्लग. के बाद से ठंडे तापमान मच्छरों anesthetize, बर्फ की एक बाल्टी में जलाशय को दफनाने और 5-10 मिनट इंतजार करने के लिए आगे बढ़ बंद मच्छरों के लिए. Anesthetization भी एक ठंडे कमरे या रेफ्रिजरेटर में जलाशय रखकर या सीओ 2 का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. इन 5-10 मिनट के दौरान, अगले कदम के लिए जारी है.

  2. अपने कार्य क्षेत्र तैयार 2 करने के लिए एक फ्लैट सतह ठंड ब्लॉक सेट ° सी और उस पर एक गिलास स्लाइड जगह. यह वह जगह है जहां मच्छरों के रूप में आप उन्हें इंजेक्षन आराम करेंगे. Microinjector पर एक गिलास सुई संलग्न है और अपने संदंश का उपयोग इच्छित चौड़ाई के लिए सुई की नोक तोड़. यह महत्वपूर्ण है कि चौड़ाई काफी बड़े के लिए तरल के लिए पर्याप्त कमरे के माध्यम से एक उचित दर पर प्रवाह करने की अनुमति है, लेकिन बहुत संकीर्ण करने के लिए इंजेक्शन के दौरान एक न्यूनतम घाव दण्ड है. एक अच्छा सुई टिप काफी संकीर्ण थोड़ा मोड़ हो सकता है लेकिन नहीं टूटेगा. वांछित उत्पादन मात्रा (आरएनएआई के लिए, हम 69 NL का उपयोग करें) करने के लिए अपने इंजेक्शन उपकरण सेट. डूब अपने नमूना में अपने सुई की नोक और निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर सुई में अपने तरल नमूना आकर्षित. तरल नमूना dsRNA समाधान, जीवाणु निलंबन, या अन्य किया जा सकता है, इंजेक्शन प्रक्रिया सभी के लिए समान है. बर्फ की बाल्टी में एक गिलास पेट्री डिश एम्बेड इतना है कि डिश के तल पूरी तरह बर्फ से संपर्क है. यह वह जगह है जहाँ आप मच्छरों डाल जब तक आप उन्हें इंजेक्षन करने के लिए तैयार हो जाएगा.

  3. अपने गिलास पेट्री डिश के लिए जलाशय से मच्छरों स्थानांतरण 50-100 मच्छरों को तैयार है. उन्हें एक एकल परत करने के लिए पतली है, यकीन है कि सबसे पकवान की ठंड नीचे के साथ संपर्क है उन्हें anesthetized रखने बना अपने संदंश का प्रयोग करें. पकवान के साथ इन मच्छरों को कवर कवर जब उपयोग में नहीं है. बर्फ बाल्टी जलाशय लौटें मच्छरों के बाकी anesthetized रखने.

  4. ठंड खंड पर मच्छरों माउंट. एक समय में एक मच्छरों पकवान से गिलास प्रकाश खुर्दबीन के नीचे ठंड खंड पर घुड़सवार स्लाइड हस्तांतरण अपने ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग करें. मच्छरों धीरे पैर, अधिमानतः संभाल. रेखा स्लाइड पर मच्छरों के रूप में कई के रूप में 30 पक्ष द्वारा साइड, सुनिश्चित करें कि आप microinjector के साथ हर एक को पाने के लिए और सुनिश्चित करें कि हर एक ठंडे स्लाइड के साथ संपर्क में आता है बना सकते हैं. यकीन है कि अपने मच्छरों को लाइन में खड़ा कर रहे हैं अर्दली ताकि के रूप में आप के साथ जाने आप जानते हैं जो है और जो इंजेक्शन नहीं किया गया है. अन्य ठंडा पेट्री डिश में कवर मच्छरों को छोड़ दें.

  5. मच्छरों के अपने पहले समूह इंजेक्षन. एक हाथ में अपने ठीक इत्तला दे दी इत्तला दे दी संदंश पकड़ो और दूसरे हाथ में एक पेंसिल की तरह microinjector पकड़. को मच्छर के कदम के रूप में आप की जरूरत है (उन्हें पैरों द्वारा संभाल करने के लिए चोट से बचने) और मच्छर स्थिर के रूप में आप इंजेक्षन रखने संदंश का प्रयोग करें. यह सबसे अच्छा काम करता है अगर आप संदंश का उपयोग करने के लिए मच्छर के एक पक्ष का समर्थन के रूप में आप दूसरे पक्ष से इंजेक्षन. ध्यान से मच्छर छाती में सिर्फ सुई टिप सम्मिलित करें. यह सबसे अच्छा है चोट कम से कम छल्ली का एक तना हुआ अभी तक पतली भाग में इंजेक्षन. इसके अलावा, बहुत गहराई से इंजेक्शन से बचने, तुम सिर्फ छाती के अंदर टिप चाहते, गहरी इंजेक्शन के कारण अधिक से अधिक घाव जो अस्तित्व समझौता होगा. एक बार सुई टिप स्थिति में है, प्रेस और microinjector तंत्र है जो dsRNA के अपने पूर्व निर्धारित मात्रा में वितरित कर देगा के पैर पेडल रिलीज. एक दूसरे या दो रुको और मच्छर से सुई हटायें. यदि तरल पदार्थ की एक बूंद घाव साइट के बाहर दिखाई देता है, यह घाव में अवशोषित करने के लिए एक कुछ सेकंड रुको. यदि यह एक कुछ सेकंड के भीतर अवशोषित नहीं करता है कि मच्छर त्यागने और फिर कोशिश करें. अपने गिलास स्लाइड पर सभी मच्छरों के लिए इंजेक्शन की प्रक्रिया जारी रखें.

  6. जब आप समाप्त कर रहे हैं अपने मच्छरों को स्टोर, लेबल कंटेनर के अंदर अपनी इंजेक्शन मच्छरों जगह (हम 1 पिंट मोम लाइन गत्ता कप द्वारा कवर पसंद करते हैंजाल और रबर बैंड और एक गत्ता ढक्कन के साथ सुरक्षित) जाल.

  7. इंजेक्शन जारी रखें जब तक समाप्त करने के लिए स्लाइड पर मच्छरों जगह जारी रखें, सुई और कप के लिए स्थानांतरण जब तक आप नमूना आकार आप की इच्छा है. . कुछ मौतों के शुरुआती के लिए खाता है कई मच्छरों इंजेक्शन के सदमे से मर जाएगा. इस अभ्यास के साथ सुधार अपने मच्छरों के लगभग 100% तक इंजेक्शन जीवित रहने जाएगा.

  8. जब समाप्त हो, एक खाद्य स्रोत के साथ एक जोड़ कप पर गीला कागज तौलिया जगह और कवर प्लास्टिक लपेटो या एक प्लास्टिक पेट्री ढक्कन जैसे नमी बनाए रखने के लिए कुछ के साथ कप. इंजेक्ट मच्छरों बाहर सुखाने इतना गीला तौलिया और प्लास्टिक के द्वारा बनाए रखा द्वारा प्रदान की नमी इसे रोकने में मदद मिलेगी के लिए प्रवण हैं.

  9. ऊष्मायन के लिए एक पर्यावरण नियंत्रित कक्ष में अपने मच्छरों रखें.

नोट: जीन मुंह बंद करने की क्षमता अत्यधिक परिवर्तनशील है और प्रतिलेख और मोड़ पर दरों प्रोटीन, कोशिकाओं और अंगों द्वारा और dsRNA तेज दक्षता सहित कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है. हमने पाया है कि मुंह बंद करने के रूप में 1 दिन के बाद इंजेक्शन के रूप में जल्दी शुरू होता है, और 6 दिनों के बाद इंजेक्शन के लिए पिछले कर सकते हैं. प्रतिलेख और प्रोटीन जैसे मात्रात्मक पीसीआर और पश्चिमी तरीकों का पता लगाने के लिए मुंह बंद मान्य सोख्ता का उपयोग करें.

नोट: मच्छर इंजेक्शन और आरएनएआई की मध्यस्थता जीन मुंह बंद तकनीक के कई कदम पर कई रूपों रहे हैं. कुछ द्वारा वर्णित हैं बदलाव: Boisson, एट अल (2006) और Blandin, एट अल (2002)..

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Discussion

जीन मुंह बंद करने की क्षमता अत्यधिक परिवर्तनशील है और प्रतिलेख और मोड़ पर दरों प्रोटीन, कोशिकाओं और अंगों द्वारा और dsRNA तेज दक्षता सहित कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है. हमने पाया है कि मुंह बंद करने के रूप में जल्दी के रूप में 1 दिन पोस्ट इंजेक्शन शुरू होता है और 6 दिनों के बाद इंजेक्शन के लिए पिछले कर सकते हैं. प्रतिलेख और प्रोटीन जैसे मात्रात्मक पीसीआर और पश्चिमी तरीकों का पता लगाने के लिए मुंह बंद मान्य सोख्ता का उपयोग करें.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Megascript kit Ambion for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy Qiagen For dsRNA purification
dsRNA should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector Drummond Scientific Nanoject II
light microscope mounted above a cold block
Petri dish covered, glass
paper towels
10% sucrose food
A. gambiae Animal mosquitos

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References

  1. Boisson,, et al. (2006).
  2. Blandin,, et al. (2002).

Comments

1 Comment

  1. precise steps

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2008 - 2:38 PM

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