Induktion und Überwachung von Active Delayed Type Überempfindlichkeit (DTH) in Ratten

Hallo, ich bin Christine Beaton. Ich arbeite im George Chandy Labor in der Abteilung für Physiologie und Biophysik der UCI. Heute zeige ich Ihnen, wie man aktives DTH bei Ratten induziert.

Dafür werde ich eine Emulsion von KLH vorbereiten, das mein Antigen in Frankreich als Adjuvans gilt. Und dann werde ich diese Emulsion an die Basis des Schwanzes von Lewis-Ratten injizieren. Und dies wird die Immunisierung der Ratten gegen KH induzieren. Und in einer Woche werde ich die Ratten mit KH herausfordern und die DTH-Reaktion durch Schwellungsmessung der Schwellung messen.

Das ist die Herausforderung, und wir nutzen sie im Labor, um die Wirkung von PO-Kanalblockern auf Entzündungsreaktionen wie DTH zu sehen. Hier ist also das unvollständige Trans-Adjuvans, das ich zur Herstellung der Emulsion verwenden werde. Ich könnte auch ein komplettes Trans-Adjuvans verwenden.

Hier ist Quarz von KLH, der heute mein Antigen ist, und ich habe hier eine Lösung mit zwei Milligramm pro ml. In PBS werde ich diese Fünf-ml-Spritze verwenden, um das unvollständige Trans-Adjuvans herauszunehmen und es in ein 15-mil-Röhrchen zu übertragen. Dann lege ich ein Röhrchen auf den Scheitel und füge während des Vortexens mein Antigen Tropfen für Tropfen zum Adjuvans hinzu.

Und dann werde ich weitere fünf Minuten wirbeln. Nachdem das erledigt ist, werde ich diese Fünf-M-Glasspritze mit meiner Mischung füllen und es muss eine Glasspritze sein, da das Adjuvans dazu neigt, Plastik zu fressen. Und die fünf M-Spritzen, die wir gefunden haben, eignen sich am besten für die Herstellung der Emulsion.

Kleiner oder größer sind nicht so gut. Und sobald ich meine Spritze mit der Mischung gespürt habe, werde ich diese Metallbrücke verwenden, um diese Glasspritze mit einer anderen Fünf-Mil-Glasspritze zu verbinden. Und dann übe ich Druck auf die Spritzen aus, damit meine Mischung so schnell wie möglich von einer Spritze zur anderen geht, bis es wirklich hart wird, bis die Emulsion wirklich hart wird und dann bereit für die Injektion ist.

Also werde ich 2,5 mil meines Adjuvans geben. Also injiziere ich einfach Luft, um das Adjuvans leichter herauszubekommen, und gebe dann das gesamte Adjuvans in meine Tube. Was ich jetzt also tun werde, ist, 2,5 mls davon zu nehmen und dort auf den Vortex zu geben.

Da ich 2,5 mil des Adjuvans eingenommen habe, werde ich 2,5 mil meines KLH einnehmen. Wenn ich also Tropfen für Tropfen hinzufüge, sehen Sie, dass die Mischung ihre Farbe ändert und weiß wird. Jetzt habe ich also das ganze Antigen zum Adjuvans hinzugefügt.

Was ich also tun werde, ist, die Mischung für weitere fünf Minuten zu wirbeln. Aber da ich das Rohr nicht fünf Minuten lang halten möchte, werde ich es an den Wirbel kleben, um den Wirbel im Rohr zu erzeugen, sei es, wenn Sie es nicht wollen, Sie wollen es so schnell wie möglich, damit es nicht überläuft. Also lasse ich es fünf Minuten lang so.

Die fünf Minuten sind also vorbei. Ich werde jetzt den Wirbel stoppen und mein Mix ist weiß. Also nehme ich den Schlauch raus. Hoppla.

Die Mischung ist mittlerweile komplett weiß, aber immer noch ziemlich flüssig. Und ich wollte härter für die Injektion. Was ich also tun werde, ist, dass ich den gesamten Mix in eine Fünf-M-Glasspritze übertrage.

Also wurden diese Spritzen autoklaviert. Also bebinde ich eine komplette Spritze mit meiner Brücke. Und von der anderen Spritze verbinde ich nur den Zylinder.

Ich lasse den Kolben weg und gieße dann meine Mischung in die obere Spritze. Ich werde alles in die untere Spritze übertragen. Dann muss ich der Luftblase hinterherjagen, die ich hier habe.

Also werde ich die obere Spritze abklemmen und der Luftblase nachjagen. Die Blase ist schwer zu erkennen, aber sie ist genau hier. Also jage ich der Luftblase hinterher.

Ich jage sie auch aus der Brücke und verbinde dann die obere Spritze neu. Ich stelle sicher, dass alles fest miteinander verbunden ist, und dann gebe ich meinen Mix von einer Spritze zur anderen. Am Anfang ist es also einfach, aber bald wird die Mischung schwierig.

Heute Abend wird es immer schwieriger und ich will die Brücke nicht brechen, also drehe ich einfach meine Spritzen. Manchmal dauert es länger. Es variiert von Emulsion zu Emulsion.

Es hängt wahrscheinlich auch von der Temperatur und dem Feuchtigkeitsgehalt ab. Aber ich denke, meine Emulsion ist fertig. Er ist viel dicker als beim Einschenken.

Es ist komplett weiß. Und es gibt nur eine Phase. Sie sollten niemals eine Trennung der ACO-Phase vom Öl haben.

Jetzt ist es also bereit zum Injizieren. Jetzt ist das Eintauchen also bereit zum Injizieren. Um es zu injizieren, verwende ich 200 Mikroliter pro Hütte.

Und dafür werde ich drei Mil Spritzen verwenden. Und ich verwende Lu-Lock-Tip-Spritzen, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht herausspringt, da die Emulsion sehr dickflüssig und schwer zu injizieren sein kann. Und die Nadeln, die ich benutze, versuche ich, die kleinstmöglichen Nadeln zu verwenden, die wir lassen, lassen wir die Emulsion durch.

Und ich habe festgestellt, dass die 20 3G gut genug für diese Emulsion sind. Für dickere Emulsionen müssen Sie möglicherweise größere Spritzen verwenden. So wie wir es jetzt machen, lassen wir eine Person die Ratte halten und die andere Person injizieren.

Und für maximale Sicherheit darf die Person, die die Ratten hält, obwohl diese Ratten sehr ruhig sind und daran gewöhnt sind, angefasst zu werden, diese zahnsicheren Handschuhe für Nagetiere verwenden, nur für maximale Sicherheit, an denen wir nicht vorbeigehen wollen. Also gebe ich die gesamte Emulsion in eine Glasspritze und trenne die leere Glasspritze von der Brücke. Und an seine Stelle setzte ich meine untere Plastikspritze mit drei mil Verschluss ein.

Jetzt übertrage ich mehr, als ich für eine Spur Emulsion benötige. Ich jage der Luftblase hinterher. Da ich 200 Mikroliter pro Brunft injizieren werde, lebe ich 300 Mikroliter in meiner Spritze.

Ich trenne die Brücke, stecke meine Nadel auf meine Plastikspritze, fülle meine Nadel und setze meinen Kolben auf 200 Mikroliter ab. So bin ich mir sicher, dass ich keine Luftblasen habe. Und jetzt sind wir bereit für die Injektion.

Wir wollen also sicherstellen, dass sich die Ratte nicht bewegt. Also greifen wir die Ratte und ich lege einen Finger über die Schulter, einen darunter, und dann halte ich mit der anderen Hand die Hinterbeine und den Schwanz und wir injizieren hier in die Flanken und auf dieser Seite Mikroliter und dann Mikroliter auf der anderen Seite. Also habe ich letzte Woche die Ratten mit einer Emulsion immunisiert, die KLH als Antigen enthält.

Und heute werde ich sie intradermal auf dem Rücken mit KLH, meinem Antigen, und mit o Albumin, einem relevanten Antigen, herausfordern, aber um sie auf den Rücken intradermal injizieren zu können, muss ich sie zuerst rasieren. Und dafür benutze ich nur einen einfachen Elektrorasierer. Ja, ich wechsle die Nadeln zwischen den einzelnen Ratten, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht stumpf ist.

Es macht es viel einfacher, intradermal zu injizieren, vor allem, wenn ich kleine Mengen von 20 Mikrolitern jedes Antigens injiziere. Also habe ich allen Ratten meine beiden Antigene injiziert und werde sie bis morgen in ihren Käfigen lassen. Und morgen werden wir in der Lage sein, eine Entzündung zu sehen.

Die Injektionsstelle wird also rot und geschwollen sein, und wir werden in der Lage sein, den Durchmesser der Entzündungsstelle als Maß für die Entzündung zu messen. Gestern habe ich die Ratten in Intradermal hinten mit meinem relevanten Antigen, dem KLH, und einem irrelevanten Antigen, das von Albumin ist, herausgefordert. Und jetzt, 24 Stunden später, werde ich mir die Ratten ansehen, ob ich eine Entzündung habe.

Ich erwarte also eine Entzündung nur an der KLH-Stelle und die Entzündung zeigt sich als Rötung und Schwellung. Und nachdem ich eine Entzündung gesehen habe, werde ich den entzündeten Bereich messen, indem ich einfach den Durchmesser des Bereichs messe. Das hier ist also die KH-Injektionsstelle und Sie können ohne Probleme sehen, dass es eine große Entzündung gibt.

Sie ist im Vergleich zu normaler Haut sehr gerötet und geschwollen. Wenn wir uns nun die andere Stelle ansehen, an der Albumin aufgenommen wird, können Sie die Injektionsstelle genau hier sehen, aber es gibt keine signifikante Rötung oder Schwellung. Die Negativkontrolle hat also funktioniert.

Jetzt werde ich also den Ort der Entzündung messen. Dafür verwende ich ein normales Lineal und mache eine Messung in Millimetern. Das wiegt sechs Millimeter und ich nehme ein zweites Maß.

Dieser wiegt fünf Millimeter. Es gibt sehr wenig Rötung, wird gemessen, aber es ist kaum ein Millimeter. Was ich Ihnen hier gezeigt habe, ist, wie man eine Emulsion mit einem Antigen herstellt, wie man Ratten mit dieser Emulsion immunisiert und sie dann Woche später mit dem Antigen herausfordert, das ich zur Immunisierung und auch im relevanten Antigen verwendet habe, und wie man den Grad der Entzündung im verwendeten und im Chan-Labor visualisiert und misst.

Wir verwenden diese Technik ziemlich routinemäßig als einfachen Assay, um die Wirkung von Kaliumkanalblockern auf Entzündungen bei Ratten zu messen.