Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

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Biology

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Summary

Este protocolo describe un procedimiento para estudiar la respiración de las mitocondrias aisladas de los músculos esqueléticos. Este método fue adaptado de Scorrano

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Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (49), e2452, doi:10.3791/2452 (2011).

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Abstract

Las mitocondrias son orgánulos que controlan la vida y la muerte de la célula. Participan en las principales reacciones metabólicas, síntesis de la mayor parte de la ATP, y regular una serie de cascadas de señalización 2,3. Los investigadores del pasado y actuales tienen mitocondrias aisladas de tejidos de ratas y ratones, como el hígado, cerebro y corazón 4,5. En los últimos años, muchos investigadores se han centrado en estudiar la función mitocondrial de los músculos esqueléticos.

Aquí se describe un método que hemos utilizado con éxito para el aislamiento de las mitocondrias de los músculos del esqueleto 6. Nuestro procedimiento requiere que todos los tampones y reactivos son frescas y la necesidad de 250-500 mg de músculo esquelético. Hemos estudiado las mitocondrias aisladas de gastrocnemio de ratas y ratones y el diafragma y los músculos extraoculares rata. Concentración de proteína mitocondrial se mide con el ensayo de Bradford. Es importante que las muestras se mantendrán mitocondrial helado durante la preparación y que los estudios funcionales se realizará en un plazo relativamente corto (aproximadamente 1 hora). Respiración mitocondrial se mide utilizando la polarografía con un electrodo tipo Clark (sistema Oxygraph) a 37 ° C 7. La calibración del electrodo de oxígeno es un paso clave en este protocolo y debe realizarse diariamente. Mitocondrias aisladas (150 mg) se añadió a 0,5 ml de solución tampón experimental (EB). Estado 2 de respiración comienza con la adición de glutamato (5 mm) y malato (2,5 mM). Entonces, la adenosina difosfato (ADP) (150 M) se añade al estado de inicio 3. Oligomicina (1 M), un bloqueador de la sintasa de ATP-asa, se utiliza para estimar el estado 4. Por último, el cianuro carbonilo p-[trifluorometoxi]-fenil-hidrazona (FCCP, 0,2 M) se añade a measurestate 5, o no enganchados respiración 6. La relación del control respiratorio (RCR), la relación entre el estado 3 al estado 4, se calcula después de cada experimento. Un RCR ≥ 4 se considera como evidencia de una preparación de mitocondrias viable.

En resumen, se presenta un método para el aislamiento de las mitocondrias viable de los músculos esqueléticos que pueden ser utilizados en estudios bioquímicos (por ejemplo, la actividad enzimática, inmunodetección, proteómica) y funcionales (respiración mitocondrial).

Protocol

1. Preparación de tampones

  1. Encienda 5804R centrífuga y se puso a 4 ° C. A su vez en baño de agua Isotemp 3006D y se puso a 37 º C.
  2. Prepare las siguientes soluciones antes de que el aislamiento del músculo:
    • PBS: Disolver tampón fosfato salino (PBS) tabletas en agua destilada (5 comprimidos / litro). Mezclar bien.
    • PBS más 10 mM EDTA: Para preparar una solución de 100 ml, añadir 2 ml de 500 mM EDTA y 98 ml de PBS.
    • Buffer 8X mitocondrias: 10,28 g de sacarosa, para una concentración final de 0,6 M, 400 mg de ácidos grasos libres de albúmina sérica bovina (BSA) para una concentración final de 0,8%, 2,08 g de HEPES para una concentración final de 160 mM, pH a 7.4 y QS de 50 ml con agua destilada.
    • Buffer de aislamiento 1 (IB1): Añadir 200 l de 500 mM EDTA para una concentración final de 10 mM, 0,392 g de D-manitol para una concentración final de 215 mM, 1,25 ml de buffer 8X mitocondrias pH, a 7.4 y QS a 10 ml con agua destilada.
    • Buffer aislamiento 2 (IB2): Añadir 60 l de EGTA 500 mM para una concentración final de 3 mm, 0.392 g de D-manitol para una concentración final de 215 mM, 1,25 ml de buffer 8X mitocondrias pH, a 7.4 y QS a 10 ml con agua destilada.
    • Buffer experimental (EB): añadir 100 ml de 500 mM de MgCl 2 para una concentración final de 5 mM, 0,392 g de D-manitol para una concentración final de 215 mm, 25 l de 2,5 mM KH 2 PO 4 para una concentración final de 6,25 M, 2 l de 100 mM EGTA, para una concentración final de 20 mM, 1,25 ml de solución tampón mitocondrial, el pH a 7.4 y QS de 10 ml con agua destilada.

2. Aislamiento de los músculos

  1. En un cubo de hielo, poner tres vasos de 10 ml, Potter-Elvehjem molinos tejidos y todo lo necesario de otros instrumentos / suministros en el hielo. Todo debe estar helado durante todo el experimento.
  2. Lugar IB1 y IB2 en un cubo de hielo y EB en el baño de agua caliente cuando haya terminado.
  3. En los tres vasos de 10 ml, las soluciones se debe agregar:
    • Matraz de 1: 10 ml de PBS
    • Vaso 2: 10 ml de PBS / EDTA
    • Vaso de 3: 3 ml de IB1
  4. Matar a una rata humana, aprobado por el local de Atención de Animales institucional y el empleo.
  5. Aislar rápidamente 250-500 mg de músculo esquelético, enjuague en el vaso 1, entonces la transferencia de vaso 2.

3. Homogeneización / aislamiento mitocondrial

  1. Transferencia de músculo para vaso 3 y finamente picada el músculo con la tijera.
  2. Transferir la solución a la homogeneizador Potter-Elvehjem. Homogeneizar el músculo con un mortero de motor (un taladro puede hacer el trabajo) 10 veces manteniendo el tubo en hielo en todo momento.
  3. Transferencia de homogeneizado de pre-enfriado tubos de microcentrífuga de 2 ml y centrifugar a 700 g durante 10 minutos a 4 ° C.
  4. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado. Deseche pellet.
  5. Centrifugar el sobrenadante a 10.500 g durante 10 minutos a 4 ° C.
  6. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado y SN1 etiqueta (número sobrenadante 1) y el tipo de músculo.
  7. Vuelva a suspender el pellet en 500 l de IB2.
  8. Centrifugar a 10.500 g durante 10 minutos a 4 ° C.
  9. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado y SN2 etiqueta (número sobrenadante 2) y el tipo de músculo.
  10. Suspender el precipitado final mitocondrial en 100 l de IB2.
  11. Volver a girar la suspensión definitiva mitocondrial en minifuge durante unos segundos. Si hay una bolita, la transferencia de sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado y desechar el sedimento.
  12. Determinar la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford 8.

4. La calibración de electrodos

NOTA: La calibración del electrodo durante el aislamiento completo mitocondrial.

  1. Añadir 100 ml de agua destilada al matraz de 250 ml. Agitar vigorosamente durante 20 minutos para equilibrar el agua con gas atmosférico.
  2. Añadir unas gotas de 50% de KCl con el electrodo Oxygraph.
  3. Coloque un pedazo pequeño de papel azul Rizla rodando en la parte superior del electrodo.
  4. Coloque un pedazo de membrana PTFE en la parte superior del papel de fumar.
  5. Aplicar el anillo interior, utilizando el aplicador de anillo y coloque el anillo exterior en la ranura de los electrodos.
  6. Conectar los electrodos y montar el resto del equipo: más grande base de anillo de plástico, cámara de las mitocondrias, y mangueras de agua.
  7. A su vez en cajas de Oxygraph y comenzar software Oxygraph.
  8. Agregue el agua a la cámara de equilibrio mitocondrial.
  9. Añadir una barra de agitación y gire a una velocidad de 60.
  10. Comenzar un nuevo experimento.
  11. Haga clic en calibrar y calibración de fase líquida para el Cuadro 1. Los cambios de temperatura a 37 ° C y haga clic en "Aceptar" dos veces.
  12. Cuando "Override" cambia a "OK" haga clic en él y abrir el tanque de gas nitrógeno.
  13. Coloque la punta conectadosal tanque de nitrógeno en la cámara y establecer el oxígeno cero. Haga clic en "Aceptar" cuando se cambia de "anulación".
  14. Aspirar el agua y añadir 500 l de tampón EB a las cámaras de las mitocondrias.
  15. Junta de la cámara con el émbolo.
  16. Si utiliza varias cajas, repita los pasos 11-15 para la calibración de la caja 2.

5. La respiración mitocondrial

  1. Iniciar un nuevo experimento, se deja correr durante 1 minuto para estabilizar la señal.
  2. Añada el volumen necesario de la suspensión mitocondrial (paso 3.11) por 150 g en cada cámara, evento marca, y se deja correr durante 1 minuto.
  3. Añadir 10 l de agua tibia 250 mM/125 mM de glutamato / malato para una concentración final de 5 mM mM/2.5. Mark y deje correr durante 1 minuto. Esta se define como la etapa 2.
  4. Añadir 7,5 l de 10 mM de ADP, para una concentración final de 150 M, la marca, y dejar funcionar durante 30 segundos. Esta se define como Estado 3.
  5. Añadir otro 7,5 l de 10 mM de ADP, la marca, y deje correr durante 1,5 minutos.
  6. Añadir 0,5 l de oligomicina frío de 10 mm para una concentración final de 1 M, marca, y dejar funcionar durante 3 minutos. Esta se define como Estado 4.
  7. Añadir 1 l de frío mM FCCP 0.1 para una concentración final de 0,2 M, marca, y dejar funcionar durante 3 minutos. Esta se define como Estado 5.
  8. Cuando haya terminado, al final experimento y guardar.
  9. Adquirir las tasas de respiración utilizando el software Oxygraph.
  10. Introduzca factor de normalización: si la adición de 150 mg de proteína mitocondrial, el factor de normalización será 0,15.
  11. Calcular las tasas de respiración normalizado para los estados de respiración diferente.
  12. Calcular la relación de control respiratorio (RCR), dividiendo por el Estado 3 Estado 4.

6. Los resultados representativos:

Figura 1
Figura 1. Muestra un representante de seguimiento del consumo de oxígeno por las mitocondrias del músculo esquelético. Después de la señal del electrodo se haya estabilizado, la muestra de las mitocondrias se añade a la cámara de Oxygraph. Estado 2 de respiración comienza con la adición de glutamato y malato. Además de ADP aumenta el consumo de oxígeno, la definición de estado de tres respiración. ATP sintasa está bloqueada por la adición de oligomicina para obtener el estado 4 de respiración. Por último, FCCP se añade a desacoplar la respiración mitocondrial (estado 5). La Tabla 1 muestra las tasas de consumo de oxígeno representante de los estados 2, 3, 4 y 5. La relación del control respiratorio (RCR) se calcula para cada experimento. RCR ≥ 4 se considera como evidencia de una preparación de mitocondrias viable.

Estados

Tarifas normalizado

El estado 2

34.74

Estado 3

153,40

El estado 4

16.49

Estado 5

143,70

RCR

9.30

Tabla 1. Las tasas de respiración mitocondrial. Representativeoxygen las tasas de consumo de las mitocondrias del músculo esquelético. Los valores se normalizan a la cantidad de mitocondrias añadido a la cámara. La relación del control respiratorio (RCR) se determina dividiendo el estado 3 en el estado 4. Un RCR ≥ 4 representa una preparación de mitocondrias viable.

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Discussion

Se presenta un protocolo para aislar viable mitocondrias de los músculos esqueléticos. Si el rendimiento es un problema, el protocolo puede ser modificado mediante la incubación de los músculos aislados en 5 ml de tripsina PBS/10mM EDTA/0.01% durante 30 minutos en hielo. Para asegurar la digestión completa del músculo con tripsina, el músculo tiene que ser totalmente picada. Después de la incubación de 30 minutos, la solución PBS/10mM EDTA/0.01% de tripsina debe ser reemplazado por completo con 3 ml de tampón de aislamiento 1 (IB1). Además, la utilización de tripsina pueden interferir con determinados sustratos mitocondriales durante el protocolo de la respiración. Todos los sustratos utilizados en este resultado el protocolo de buenas preparaciones mitocondriales cuando se utiliza la tripsina.

Para que los músculos esquelético del ratón, lo mejor es combinar los músculos gemelos de ambas piernas, o usar el diafragma conjunto. Para que los músculos esquelético de rata, una pequeña sección de gemelos o el diafragma es suficiente. La masa muscular excesivo puede complicar el procedimiento de aislamiento y el resultado en un menor rendimiento. Para el aislamiento de los músculos muy pequeños, como los músculos extraoculares, es necesario que los músculos de la piscina de más de un animal para obtener la masa muscular necesaria.

Este protocolo se refiere a dos sobrenadantes diferentes: SN1 y SN2. Estos sobrenadantes son el resultado de centrifugación diferencial y no contienen proteínas mitocondriales. Las proteínas de estos sobrenadantes y de la final de pellet mitocondrial puede ser utilizado en transferencias del oeste para verificar la pureza de la preparación de las mitocondrias. Western blots utilizando anticuerpos mitocondrial y citoplasmático confirmar la pureza de su preparación mitocondrial en el precipitado final.

Limpieza del equipo de respiración mitocondrial es fundamental para un experimento exitoso. Después de cada experimento, las cámaras deben ser limpiados a fondo de la siguiente manera: aclarar cámaras de cinco veces con agua destilada, enjuagar una vez con etanol al 70% para eliminar soluble en etanol, sustratos, enjuague con una solución saturada de PBS / BSA durante unos 5 minutos, por último, enjuagar cámaras de 5 veces con agua destilada. Tipo Clark electrodos deberán limpiarse después de cada uso de un enjuague varias veces con agua destilada y suavemente frota con un cepillo de dientes. Entonces, debe estar completamente seca con la Cuaresma sin paños y se almacena en un desecador. Una vez a la semana, los electrodos deben ser pulidas con el kit de pulido Oxygraph.

Sustratos mitocondriales se preparan como soluciones madre, alicuotar y almacenados a -20 ° C. No recomendamos la reutilización de los sustratos. En nuestra experiencia, la mayoría de los sustratos son estables a -20 º C durante varios meses, a excepción de oligomicina que deberá ser sustituido cada 2 meses o así. Siempre se refieren a las especificaciones del fabricante para obtener más detalles.

Finalmente, este protocolo también se puede utilizar para aislar las mitocondrias de corazón. En cuanto a otros músculos, el tamaño del animal (rata vs el ratón) se determinará qué fracción del órgano es necesario para obtener suficientes mitocondrias.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Ojo (R01 EY12998) para FH Andrade.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95% CO2 / 5% O2 mix Local Gas Supplier
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Blue Rizla Paper Hansatech 890101
Bradford protein assay Bio-Rad 500-0006
Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Centrifuge 5804R Eppendorf
Compressed nitrogen Local Gas Supplier
D-mannitol Sigma-Aldrich M9647
Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio-Rad 161-0728
Free fatty acid bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806
Glutamic acid Sigma-Aldrich G5889
HEPES sodium salt Sigma-Aldrich H7006
Isotemp 3006D Fisher Scientific
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Male Sprague Dawley Rats Harlan Laboratories 300-500g
Malic acid Sigma-Aldrich M9138
Minifuge ISC Bioexpress C1301P
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxygen electrode disc Hansatech S1
Oxygraph Hansatech
Oxygraph Plus V1.01 Software Hansatech
pH-meter Mettler Toledo 1225506149
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P8416
Potter-Elvehjem homogenizers Fisher Scientific 08-414-14A
PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane Hansatech S4
SKIL 3320 drill press Hardware store
Sucrose Sigma-Aldrich S5016

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References

  1. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
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  3. Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. (2009).
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  7. Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

Comments

1 Comment

  1. I'm sorry, I don't typically feel the need to interject, but I feel that the information in this protocol is lacking and at times inaccurate. While the buffers and general protocol are by and large correct, following the procedures shown in the video will yield low State 3 rates and the absence of a true "State 4," without the addition of oligomycin. While it is true that State 4 rates in the literature are generally reported in the presence of oligomycin, the absence of a progression to State 4 as described by Chance and Williams in 1955 indicates swollen, broken, leaky mitochondria and a poor preparation. Furthermore, State 5 here is described as after FCCP addition, which is in reality a modified State 3, sometimes called as "State 3U", or State 3 Uncoupled, as described in a letter by John Lemasters. State 5 is actually characterized by the absence of oxygen in the reaction chamber, and therefor a very low oxygen consumption rate.

    Reply
    Posted by: Dieter K.
    March 6, 2013 - 8:08 PM

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