Todo Recordings celular do cérebro de adultos Drosophila

Biology

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Summary

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais usando a tecnologia de célula padrão todo. Inclui imagens de células GFP rotulados e neurônios visto durante a gravação.

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Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248, doi:10.3791/248 (2007).

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Abstract

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais. Começamos por descrever a solução de dissecação e captura das fêmeas adultas usadas em nossos estudos. O procedimento para a remoção de todo o cérebro intacto, incluindo ambos os lobos óptica, é ilustrado. Dissecção da traquéia sobrejacente também é mostrada. O cérebro isolado não é apenas pequena, mas necessita de cuidados especiais no manuseio, nesta fase, para evitar danos aos neurônios, muitos dos quais estão perto da superfície externa do tecido. Mostramos como um suporte especial que desenvolvemos é usado para estabilizar o cérebro na câmara de gravação. A eletrofisiologia padrão criado é usado para gravar a partir de neurônios individuais ou pares de neurônios. Uma imagem fluorescente, vistos através do microscópio de gravação, de uma linha de condução GAL4 expressão GFP (GH146) ilustra como os neurônios de projeção (PNs) são identificados no cérebro vivo. A imagem de alta potência Nomarski mostra uma visão de um único neurônio que está sendo alvo para gravação de células inteiras. Quando o cérebro é removido com sucesso sem danos, a maioria dos neurônios são espontaneamente ativos, disparando potenciais de ação e / ou exibindo entrada sináptica espontânea. Esta em preparação local, em que a gravação de células inteiras de neurônios identificados em todo o cérebro pode ser combinado com manipulações genéticas e farmacológicas, é um modelo útil para explorar fisiologia celular e plasticidade no SNC adulto.

Protocol

I. Dissecção de cérebros da mosca adulta

  1. Coloque uma pequena gota (~ mL 100) de dissecar solução no centro de uma placa de Petri 35 mm.
  2. Pegar fêmea adulta utilizando aspirador. Sob microscópio de dissecação, use duas agulhas de seringa para decapitar a voar.
  3. Cabeça no lugar uma pequena gota de solução salina de dissecação (com papaína adicionados) numa placa de Petri.
  4. Posição com cabeça com tromba de frente para fundo do prato.
  5. Segure a cutícula que cobre o olho composto esquerdo com agulha 1. Faça um corte diagonal que se estende desde o dorsal para a superfície ventral com agulha 2, apenas medial a agulha 1.
  6. Segure o aparelho bucal com agulha e usar uma agulha de 2 para fazer um corte horizontal que se estende desde a superfície ventral do olho esquerdo para o olho direito, ao nível da base da tromba.
  7. Segure a cutícula que cobre o olho composto direito, com agulha 1. Faça um corte diagonal que se estende desde o dorsal para a superfície ventral com agulha 2, apenas medial da agulha 1.
  8. Gire a cabeça para que o lado rostral está na superfície placa de Petri. Insira a agulha 1 entre a cutícula rostral e cérebro, e usar agulhas de 2 a seguir o mesmo caminho como a primeira agulha. Idealmente, a cápsula será se desfazer do cérebro com ambos os lobos óptica anexada uma vez que estes são importantes na estabilização do cérebro para a gravação.
  9. Traquéia, sacos de ar, e outros tecidos conectivos são cuidadosamente removidos com duas pinças de ponta fina.
  10. Dissecção todo deve tomar 30-10 minutos

II. Montagem do CNS

  1. O cérebro é transferido para a câmara de gravação usando uma pipeta de ponta amarela.
  2. Na câmara de gravação, o cérebro é estabilizado pela colocação do quadro de platina de forma que dois mira bem fazer contato com o tecido na junção entre os lobos ópticos e região do cérebro central.
  3. Cada cérebro é permitido descansar na câmara de gravação com perfusão contínua com solução salina oxigenada (95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5%) durante pelo menos 10 minutos. Perfusão da câmara com solução salina oxigenada é continuado durante todo o período de gravação. Preparação é visualizada utilizando um microscópio vertical (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Alemanha), com um palco fixo e uma objetiva de imersão 40x de água (Achroplan; abertura numérica, 0,8; Zeiss) e Nomarski óptica. GFP foi visto com um 505-530 BP de filtros de fluorescência.

III. Eletrofisiologia

  1. Pipetas de 14/08 Mohms são usados ​​para gravações de células inteiras
  2. Gravações braçadeira de tensão e corrente-clamp são realizadas usando uma Lista de EPC7 ou um amplificador Axopatch 200B, a Digidata 1322A DA conversor (dispositivos Molecular, Foster City, CA), um Dell Dimension 8200 computador (Dell Computer, Round Rock, TX), e pClamp 9 software (dispositivos Molecular).

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Discussion

A preparação do cérebro isolado todo ilustramos neste vídeo permite a avaliação dos mecanismos celulares subjacentes a excitabilidade ea transmissão sináptica em neurônios identificados, incluindo aqueles em vias de processamento olfativo, no adulto Drosophila cérebro (Gu e O Dowd, 2006). Esta abordagem é complementar ao estudo da atividade neuronal no cérebro de adultos intactos Drosophila (Wilson et all, 2004), em grande parte as gravações mesma forma dos neurônios em uma fatia do cérebro de mamíferos são complementares às gravações em mamíferos acordado comportando. Há duas grandes vantagens do em preparação situ voar cerebral quando comparado com as fatias de mamíferos. Primeiro, o cérebro da mosca toda se encaixa facilmente na câmara de gravação de modo que não é necessário para extirpar um pequeno pedaço de tecido de um grande circuito neural que ocorre ao fazer fatias de cérebro de mamíferos. Portanto, os circuitos neuronais no cérebro Drospohila isolados permanecem em grande parte intactos. Em segundo lugar, os corpos celulares da maioria dos neurônios estão perto da superfície do cérebro, facilmente acessível para a gravação de células inteiras e permanecem funcionalmente ativas quando continuamente perfundidos com solução salina oxigenado por várias horas.

Usando um vidro de câmara de gravação de fundo também permite a identificação de neurônios específicos em função da sua localização e / ou expressão GFP. Nessa preparação, a gravação durante a perfusão requer estabilização do cérebro. Isto não é compatível com os procedimentos padrão, incluindo fio de ouro estrategicamente colocadas ou malha de nylon, que são eficazes para os tecidos, tais como fatias do hipocampo, devido ao tamanho pequeno de todo o cérebro (~ 1mm). Portanto, um suporte projetado com uma moldura de platina e os cabelos de nylon cruz posicionado para contactar o cérebro em apenas dois locais para minimizar os danos aos neurônios localizados perto da superfície do cérebro. Isso estabiliza o cérebro, tanto com a superfície anterior ou posterior para cima ea superfície oposta apenas levemente apoiado no chão da câmara de gravação. Usando este dispositivo, somos capazes de manter estável rotineiramente gravações de células inteiras por até uma hora, até mesmo de neurônios pequenos, incluindo células Kenyon, ao fazer manipulações farmacológicas que exigem a aplicação de banho de drogas específicas. O titular também deve ser útil na obtenção de outras pequenas amostras de tecido para estudos eletrofisiológicos, como fatias de medula espinhal de roedores neonatal.

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Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por uma bolsa NIH NS27501 para DKOD. Suporte adicional para este trabalho foi fornecida por um Grant Programa HHMI Professor para DKOD.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
#5 Foceps Tool Fine Science Tools No. 11251-10 Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain Reagent Worthington Biochemical 3126 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope SMZ-2B Model:C-PS Nikon Instruments Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co 305175 & 309602 Cheap and durable
Upright microscope Axioskop2 FS plus Carl Zeiss, Inc. Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier 200 B Molecular Devices
Digidata D-A converter 1322A Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
  2. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).

Comments

5 Comments

  1. As a fly researcher with no prior experience in electrophysiology, I intend to set-up the necessary facility, gain skill and subsequently implement, in our ongoing Drosophila neuropharmacogenomic modeling work, recording from brains of intact organism as well as from single neurons from isolated brain as described in the present paper. In this backdrop, I would like to know if the materials and devices mentioned in this paper would be sufficient for recording from brains of intact organism. If not, what else will be required? Where from one can obtain them? Kindly also suggest alternative suppliers, if any, for material and devices that have already been successfully used in intact organism and single neuron recordings.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2007 - 6:50 AM
  2. We have not recorded from brains in intact Drosophila with our equipment but I believe the set up we describe in this video is very similar to that used by Rachel Wilson and her colleagues at Harvard who are recording from intact organisms. In our lab we use both the Axon Instruments and List patch clamp amplifiers and they both work well. We have only used the Zeiss upright microscope.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 19, 2007 - 8:09 PM
  3. Is it possible to obtain or buy the designed holder (platinum frame and nylon cross hairs)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 14, 2010 - 11:50 PM
  4. We make these in the lab. You just need a short piece of platinum wire. Bend to shape you want. Use nylon hairs glued to wire with super glue. Nylon fibers are from a fine nylon mesh. We make under microscope and the nylon fibers are stretched over frame, taped on either side so they are tight, and then super glue applied to frame over the fiber. Each fiber glued in place allowed to dry before next one put on. Then trim all excess at end.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 15, 2010 - 7:43 PM
  5. What is the diameter of the platinum wire? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2015 - 12:10 PM

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