Desarrollar ovario de hámster chino anfitrión-ensayos con células de proteínas utilizando la tecnología de membrana acústica de micropartículas

Bioengineering
 

Summary

Desarrollo de ensayos personalizados en la plataforma de Vibe para más sensibles, reproducibles, automatizado en matrices complejas se describe. El cartucho universal permite ensayos para ser adaptado fácilmente para su uso con los ensayos de costumbre. Esta versatilidad permite un rápido desarrollo y validación de nuevos ensayos o versiones automatizadas de los actuales ensayos manuales, ejemplificado en este video.

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Dickerson, M., Leong, K., Sheldon, K., Madison, L. Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology. J. Vis. Exp. (48), e2493, doi:10.3791/2493 (2011).

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Abstract

Los ensayos de encargo de proteínas únicas a menudo se limitan a la detección manual de tiempo y técnicas de cuantificación, como ELISA o Western blot, debido a la complejidad del desarrollo de plataformas alternativas. Propiedad BioScale de membrana acústica de micropartículas (AMMP) permite inmunoensayos sándwich para ser fácilmente desarrollado para su uso en la plataforma de VIBE, proporcionando una mejor sensibilidad, reproducibilidad y funcionamiento automatizado. Siempre como un ejemplo, este protocolo se describe el procedimiento para el desarrollo de una costumbre de ovario de hámster chino-Host proteína celular (CHO-HCP) de ensayo. Los principios generales enunciados aquí se puede seguir para el desarrollo de una amplia variedad de inmunoensayos.

Un ensayo de las medidas de parte del proyecto de concentración del antígeno mediante la medición de los cambios en la frecuencia de oscilación causada por la unión de las micropartículas de la superficie del sensor para calcular. Consta de cuatro componentes principales: (1) un cartucho que contiene un chip sensor funcionalizados ocho (2) anticuerpo marcado micropartículas magnéticas, (3) anticuerpos hapteno marcado que se une a la superficie del chip funcionalizadas (4) las muestras que contienen el antígeno de de interés. Biosensor BioScale es un dispositivo de resonancia que contiene ocho membranas individuales con distintos caminos fluidos. Las membranas de cambio de frecuencia de oscilación en respuesta a la acumulación de masa en la superficie y el cambio de frecuencia se utiliza para cuantificar la cantidad de masa añadida.

Para facilitar su uso en una amplia variedad de inmunoensayos se funcionaliza el sensor con un anticuerpo anti-hapteno. Anticuerpos específicos de ensayo se han modificado a través de la conjugación covalente de una etiqueta a un anticuerpo hapteno y biotina a la otra. La etiqueta de biotina se utiliza para enlazar el anticuerpo unido a la estreptavidina partículas magnéticas que, en combinación con el anticuerpo hapteno-etiquetados, se utilizan para capturar a analizar en un sándwich. El complejo se une al chip a través de la interacción anti-hapten/hapten. Al final de cada ensayo de ejecución de los sensores se limpian con un ácido diluido que permite el análisis secuencial de las columnas de una placa de 96 pocillos.

A continuación, presentamos el método para el desarrollo de una costumbre CHO-HCP ensayo Como parte del proyecto para el desarrollo de bioprocesos. El desarrollo de ensayos Como parte del proyecto o la modificación de los ensayos existentes en los ensayos de parte del proyecto se puede proporcionar un mejor rendimiento (reproducibilidad, sensibilidad) en muestras complejas y el tiempo del operador. El protocolo se muestran los pasos para el desarrollo y la sección de discusión revisa los resultados representativos. Para una explicación más detallada de la optimización del ensayo y parámetros de personalización de contacto BioScale. Este kit ofrece genérico ensayos de desarrollo de bioprocesos, tales como proteína residual Un título del producto, y HCP-CHO.

Protocol

1. Preparación de micropartículas

  1. Los anticuerpos con biotina etiqueta NHS Química
  2. Determinación del grado de biotinilación
  3. Conjugado estreptavidina bolas con anticuerpos con biotina
    1. Volver a suspender las bolas en el vial original por agitación durante 1-2 minutos
    2. Alícuota del volumen deseado de granos en un tubo de microcentrífuga
    3. Lavar las perlas de tres veces con PBST:
      1. Coloque el tubo que contiene las cuentas en el imán durante 2 minutos
      2. Eliminar el sobrenadante por aspiración con el tubo en el imán. Tenga cuidado de no alterar las cuentas
      3. Retire el tubo del imán y añadir 1 ml de PBST
      4. Vortex durante 20 segundos para volver a suspender las cuentas
      5. Centrifugar durante 5 segundos para eliminar las cuentas de la tapa
      6. Repetir dos veces más 2.3.1-2.3.5
    4. Después del tercer lavado lugar el tubo en el imán y aspirar el PBST
    5. Añadir anticuerpo biotinilado a las perlas y resuspender
    6. Si es necesario llevar el volumen de los anticuerpos con biotina hasta 300 ml con PBS. Si el volumen de anticuerpos ya es mayor de 300 l no añadir PBS
    7. Incubar la suspensión de bolas / anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador vortex o rotor del tubo
    8. Lavar 3 veces con PBST como en el paso 3.
    9. Bloquear cuentas con biotina BSA
      1. Después del tercer lavado añadir 10 mg / mg biotina BSA, ajustar el volumen a 300 ml con PBS, si es necesario, e incubar con agitación durante 30 minutos
    10. Lavar 3 veces con PBST como en el paso 3
    11. Volver a suspender las bolas en 100 L de PBS/0.05% de BSA. Azida de sodio puede ser agregado para almacenamiento a largo plazo
  4. Utilizando protocolos estándar NHS con fluoresceína, fluoresceinato el anticuerpo detector
  5. Determinar el grado de Fluorescination

2. HCP - Desarrollo

  1. Prepare las soluciones de trabajo:
    1. Anticuerpos fluoresceína (FL-Ab): La mayoría de los ensayos de CHO-HCP uso Fl-Ab a una concentración final de 400 ng / mL. El FL-Ab se agrega como ¼ del volumen final del ensayo, por lo tanto, la concentración de la solución de trabajo es de 1,6 mg / ml. Preparar esta solución diluyendo acciones gordura con BioScale bolas / diluyente de flacidez.
    2. Cuentas: La mayoría de los ensayos de CHO-HCP utilizar cuentas a una concentración final de 2x10 5 cuentas / ml. El reactivo de cuentas constituye una cuarta parte de el volumen final del ensayo, por lo tanto la concentración de la solución de trabajo es de 8x10 5 cuentas / ml. Preparar esta solución diluyendo acciones de bolas con bolas BioScale / diluyente de flacidez. Vortex el stock de cuentas y para asegurarse de que todas las cuentas están en suspensión antes de extraer una alícuota.
    3. Running Buffer: La composición del tampón de que tenga que ser optimizado para los anticuerpos utilizados para desarrollar el ensayo, sin embargo, varios CHO-HCP ensayos se han desarrollado utilizando tampón HEPES 10 mM, 1% de Tween, pH 7,5. BioScale ha desarrollado un aditivo para el funcionamiento de amortiguación (suministrado con el kit de desarrollo) que se añade al tampón a una concentración del 1% antes de su uso.
  2. Diluir los calibradores y las muestras con diluyente de la muestra BioScale.

3. VIBE de configuración del sistema

  1. A su vez la estación de trabajo Vibe
  2. Conecte el sistema de suministro y de los residuos
  3. Cebe el sistema de
  4. Introducir los cartuchos de ViBE
  5. Ruta de los tubos
  6. Preparar plantilla de ensayo rellenando la hoja de la etiqueta "Configuración de la muestra". BioScale ofrece la posibilidad de tener una plantilla de ensayo para cada ensayo de estación de trabajo VIBE. Esto permite al usuario editar y guardar notas específicas en las "Notas" hoja de la plantilla para los ensayos de diferentes manteniendo un registro completo de la experiencia.
  7. Plantilla de ensayo de la configuración inicial: Comience por llenar la mesa (en la esquina superior izquierda) del rango de concentración de los estándares en el ensayo en la "configuración de muestra" de hoja.
  8. A continuación, introducir información adicional en la tabla a la derecha de las normas (configuración de columna simple lectura, One Agregar reactivo y dos configuraciones de reactivo Añadir) para instruir a la estación de trabajo ViBE el número de muestras a largo necesario para la incubación, la cantidad de volumen de reactivo se va a transferir , ¿cuánto tiempo la acumulación de la muestra tiene que ser, y si de acondicionamiento del sensor y la descontaminación de las sondas y el cartucho son necesarios, etc
  9. Rellene el diseño de la placa.
  10. Carga de la muestra / reactivos en las placas. El VIBE proporcionará los volúmenes necesarios para el plato de reactivos. Volumen de la muestra puede variar, pero en medio de un volumen de ensayo total de 120 l es un buen punto de partida.
  11. Aplicar cubiertas de la placa. Placas de carga sobre la cubierta de estación de trabajo.
  12. Realizar el ensayo en marcha el asistente, vaya a través de asistente e iniciar la prueba.

4. Resultados representante

Figura 1
Figura 1: Como parte del proyecto de Inmunoensayo Sandwich En una estación de trabajo VIBE, un ensayo parte del proyecto se mide la concentración de antígeno. La señal se mide cuando el anticuerpo-antígeno-cordón hapteno se une al sensor a través del hapteno / interacción anti-hapteno. Regeneración lleva el sensor de nuevo al estado comenzando por la eliminación de los complejos inmunes.

Figura 2
Figura 2: CHO-HCP Ensayo Como parte del proyecto curva de calibración

La figura 2 es un ejemplo de una curva de calibración CHO HCP Como parte del proyecto de ensayo. El análisis puede llevarse a cabo en muestras de toda la corriente de purificación incluyendo el reactor de alta precisión y reproducibilidad.

Figura 3
Figura 3: Proteína Una curva de calibración del ensayo parte del proyecto

La figura 3 es una curva de calibración para una proteína residual Un ensayo Como parte del proyecto, realizado con una proteína residual VIBE un kit de ensayo. El mismo kit puede ser utilizado para un ensayo más rápido con un período de incubación de 30 minutos, o para obtener resultados más sensible y más amplio rango dinámico, con un período de incubación más largo, sin pérdida de precisión o exactitud, los cuales suelen ser mejores que sus equivalentes ELISA en los usuarios manos

Figura 4
Figura 4: El producto Titer Como parte del proyecto de ensayo

La estación de trabajo ViBE también se puede utilizar para un ensayo Titer producto, resultados que se muestran en la Figura 4. Realiza de forma diferente que los otros ensayos Como parte del proyecto, este ensayo no requiere tratamiento de la muestra que no sea la simple dilución, o perlas, y la cuantificación se ha verificado en "sin efecto" las muestras que contienen más de 10 millones de células en un amplio rango de viabilidad.

Figura 5
Figura 5: Ensayo Como parte del proyecto curva estándar para GST-Gadd34 biomarcador ensayo

Muestra en la Figura 5 es una curva de nivel de señal que se obtiene por el Bioanalyzer Vibe (Grupo A) o Tecnología AlphaScreen utilizando recombinante GST-Gadd34. Resultados en la plataforma ViBE fueron de aproximadamente un registro más sensible con los mismos anticuerpos. Como parte del proyecto aprovecha la medición de partículas de mayor tamaño menos y aún así los beneficios de la captura en fase de solución y la formación de complejos de detección.

Figura 6
Figura 6: Curva Como parte del proyecto de ensayo estándar para la GST-Gadd34 en una muestra de tumor

En la figura 6, la inducción de Gadd34 de CWR22 xenoinjertos fue probado en la presencia o ausencia de un inhibidor del proteasoma boronato como se ha analizado tanto por el Bioanalyzer Vibe (Grupo A) o AlphaScreen (Grupo B). La plataforma ambiente era capaz de producir resultados sensibles y reproducibles en los xenoinjertos de tumores in vivo, mientras que la señal se interrumpió con AlphaScreen mg cada vez mayor de proteínas.

Este ejemplo muestra el poder de la tecnología Como parte del proyecto en las muestras de gran complejidad. Debido a que el chip de detección sensibles y de alto rendimiento del imán cerca de los chips, bajo número de micropartículas magnéticas de manera eficiente y reproducible para la meta recoger baja abundancia en medio de la complejidad de la lisis celular (incluidos los reactivos de lisis) y restos de sangre.

Discussion

Los ejemplos anteriores muestran muy sensibles los resultados cuantitativos Como parte del proyecto en muestras complejas. Esta actuación, cuando se entrega con la facilidad y el control de formato de reactivos en el sistema es propicio para una variedad de aplicaciones. Estas aplicaciones pueden ser específicos para un objetivo, como en Gadd34 en el tumor, o genérico para un espectro de objetivos, como en la detección de proteínas de la célula huésped y la cuantificación de las muestras que cruzar el arroyo de purificación. La plataforma de arriba ViBE bajas combinadas con AMMP altamente flexible proporciona una herramienta poderosa para la entrega de los ensayos de crítica.

Disclosures

Los autores de este artículo son empleados por Bioscale, Inc, que produce algunos de los instrumentos y reactivos utilizados en este artículo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads BioScale (10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes New England Biolabs cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent BioScale to dilute beads and FlAb
Sample Diluent BioScale to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive BioScale

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