Erkennung von Signaling Effektor-Komplexe Downstream von BMP4 Mit In situ PLA, einem Proximity Ligation Assay

Biology
 

Summary

Hier zeigen wir, wie Proximity Ligation Assay (PLA), mit einer Kombination von Antikörpern zu verwenden, um Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Signalisierung in fixierten Zellen sichtbar zu machen. Diese Technik erlaubt es uns, die nukleare Anreicherung von endogenen BMP aktivierten Effektor-Komplexe folgen und zu quantifizieren, ihre Werte im Laufe der Zeit unter BMP4 Stimulation.

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Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (49), e2631, doi:10.3791/2631 (2011).

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Abstract

BMPs sind verantwortlich für eine Vielzahl von Entwicklungs-und biologische Wirkungen. BMP-Rezeptoren aktivieren (phosphorylieren) die Smad1/5/8 Effektoren, die dann einen Komplex mit Smad4 und translozieren in den Zellkern, wo sie fungieren als Transkriptionsfaktoren an BMP spezifischen nachgelagerten Effekte 1 einzuleiten. Traditionelle Immun-Fluoreszenz-Verfahren mit Antikörpern gegen Phospho-Smad Peptide weisen eine geringe Empfindlichkeit, hohe Hintergrund und bieten grobe Quantifizierung, wie sie auf die Intensität des Antikörpers Signal besonders berufen, wenn dies lichtempfindliche fluoreszierend. Darüber hinaus können phospho-Smads nicht alle im Komplex mit Smad4 und engagiert in der aktiven Transkription.

In situ PLA ist eine Technologie zum Aufspüren von Protein-Interaktionen mit hoher Spezifität und Sensitivität 2-4. Diese neue Technologie Paare Antikörper-Erkennung mit der Amplifikation von DNA-Surrogat des Proteins. Es erzeugt eine lokalisierte, diskrete Signal in einer Form von Flecken enthüllt die genaue Position der Anerkennung Veranstaltung. Die Anzahl der Signale gezählt und verglichen die Bereitstellung einer Messung. Wir wandten in situ PLA, mit dem DuoLink-Kit, mit einer Kombination aus Antikörpern, die den Nachweis der BMP-Signalweg Effektoren phospho-Smad1/5/8 und Smad4 erlaubt nur, wenn diese in der Nähe, dh in einem Komplex, der tritt nur bei Signalisierung Aktivierung. Dieses zum ersten Mal, die Visualisierung und Messung der endogenen BMP-Signalweg mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit in einem zeitlichen Verlauf Experiment unter BMP4 Stimulation erlaubt.

Protocol

1. Beschichtung von Zellen und die Behandlung mit BMP

  1. Kultur Neuro2a Zellen in GMEM mit 10% FBS, 1x Non-essentiellen Aminosäuren (NEAM), 1x Natriumpyruvat und 1x L-Glutamin. Split die Zellen mit Trypsin (0,05%-EDTA) und Platte 15,000-20,000 Zellen pro Well in einer 16-Well-Kammer schieben.

    Kultur HEK293T oder Cos7 Zellen in DMEM mit 10% FBS, 1x L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin ergänzt. Sterilisieren Polysine gleitet durch Eintauchen in 70% Ethanol und mit Immedge Stift gezeichnet 1 cm 2 Brunnen. Split die Zellen mit Trypsin (0,05%-EDTA) und Platte 20,000-25,000 Zellen pro Well in 50 ul Medium.
  2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten, 5% CO 2-Inkubator.
  3. Nach 24 h ersetzen das Medium mit serumfreiem GMEM (ergänzt mit 0,1% Albumin, 1x NEAM, 1x Natriumpyruvat und 1x L-Glutamin) für Neuro2a oder mit serumfreiem DMEM (ergänzt mit L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin) für HEK293T / Cos7 und inkubieren Sie die Zellen für 2-3 h. Halten Sie drei Brunnen mit Zellen unter normalen Kulturbedingungen (dh 10% FBS) als Kontrollen.
  4. Behandeln Sie die Zellen mit dorsomorphin (Inhibitor des BMP-Weg, 2 pM) oder BMP4 (25 ng / ml) für die gewünschte Zeit (zB für 10 min-1 h) 5.

2. Fixierung und Permeabilisierung

  1. Bereiten Sie das Fixiermittel, 4% PFA. 4 g PFA eine 4% ige Lösung in 100 ml PBS vorzubereiten. Wärmen Sie die Lösung bei 50 ° C, bis klar ist. Filter die Lösung durch einen 0,22 um Filter und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. Verwenden Sie frische Fixierlösung (nicht länger als 2 Tage gelagert).
  2. Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen und waschen mit 1xPBS. Pipettieren Sie nicht die Lösungen direkt auf die Zellen, da dies in Ablösung der Zellen führen kann. Bevor wir zum nächsten Schritt, wenn Chamber Slides verwendet werden entfernen Sie den Kammern, aber lassen Sie das Silizium um den Brunnen.
  3. Dann werden 50 ul 4% PFA und Inkubation für 10min bei RT ohne Schütteln.
  4. Waschen Sie die Zellen mit PBS für 3 x 5 min in einem Coplin jar unter Rühren bei RT.
  5. Behandeln Sie die Zellen mit 0,5% Triton X-100 in PBS für 10 min ohne Schütteln bei RT.
  6. Waschen Sie die Zellen mit 0,05% Tween 20 in TBS (TBS-T) für 3 x 5 min in einem Coplin jar unter Rühren bei RT.

3. Sperrung

  1. Tippen Sie die TBS-T. Einen Tropfen DuoLink II Blocking Solution (1x) pro Vertiefung.
  2. Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer 1 h bei 37 ° C.

4. Primärantikörper

  1. Mix und verdünnen aP-Smad1/5/8 (Kaninchen polyklonal) bei 1:100 und ein-Smad4 (monoklonaler Maus) bei 1:100 in der DuoLink II Antibody Diluent (1x). Bereiten Sie auch aP-Smad1/5/8 und a-Smad4 allein bei den gleichen Konzentrationen für Kontrollen verwendet werden.
  2. Tippen Sie die Blocking Solution von den Folien. Entfernen Sie so viel Blockierungslösung wie möglich, aber seien Sie besonders vorsichtig, dass sich keine Zellen trocknen, bevor Sie den Antikörper. Zugabe von 40 ul des Antikörper-Lösungen in die Vertiefungen. In einem gut fügen Sie nur Antibody Diluent als zusätzliche negative Kontrolle.

5. PLA-Sonden

  1. Verdünnen Sie die beiden PLA-Sonden (DuoLink II anti-Maus-MINUS und DuoLink II anti-Rabbit PLUS) 1:5 in Antibody Diluent.
  2. Tippen Sie den primären Antikörper-Lösung aus den Folien. Waschen Sie die Slides 2 x 5 min mit jeweils 1x DuoLink II Waschpuffer A in einer Coplin jar unter Rühren bei RT.
  3. Tippen Sie den Waschpuffer A aus den Folien und fügen Sie den PLA-Sonde-Lösung (40 ul / well).
    Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer 1 h bei 37 ° C.

6. Ligation

  1. Vortex die DuoLink II Ligation Lager (5x) und verdünnen 1:5 in hochreinem Wasser und mischen. Bei der Berechnung des Volumens des Wassers berücksichtigt das Volumen der Ligase, dass bei einer endgültigen Verdünnung von 1:40 kurz vor der Zugabe der Mischung in die Vertiefungen hinzugefügt werden.
  2. Tippen Sie den PLA-Sonde Lösung aus dem Schlitten. Waschen Sie die Slides in 1x Wash Buffer A für 2 mal 5 min jeweils in einer Coplin jar unter Rühren bei RT.
  3. Nehmen Sie die Ligase aus der Tiefkühltruhe mit einem Einfrieren Block (-20 ° C). Fügen Sie die Ligase die Ligation-Lösung (hergestellt in 6,1) bei einer 1:40-Verdünnung und vortexen.
  4. Tippen Sie den Waschpuffer A aus den Folien und fügen Sie die Ligation-Ligase-Lösung in jede Vertiefung (40 ul / well). Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer für 30 min bei 37 ° C.

7. Verstärkung

Hinweis: Light sensitive Reagenzien. Halten Sie die Folien vor Licht geschützt.

  1. Verdünnen Sie die DuoLink II Amplification Lager (5x) 1:5 in hochreinem Wasser und mischen. Bei der Berechnung des Volumens des Wassers berücksichtigt das Volumen der Polymerase, dass bei einer endgültigen Verdünnung von 1:80 kurz vor der Zugabe der Mischung zu th hinzugefügt werdene Brunnen.
  2. Tippen Sie die Ligation-Ligase-Lösung von den Folien. Waschen Sie die Slides in 1x Wash Buffer A mit 2 mal 2 min jeweils in einer Coplin jar unter Rühren bei RT.
  3. Nehmen Sie die Polymerase aus dem Gefrierschrank mit einem Einfrieren Block (-20 ° C). Fügen Sie die Polymerase die Amplification-Lösung (hergestellt in 7,1) bei einer 1:80 Verdünnung und Wirbel.
  4. Tippen Sie den Waschpuffer A aus den Folien und fügen Sie die Amplification-Polymerase-Lösung in jede Vertiefung (40 ul / well). Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer für 100 min bei 37 ° C.

8. Vorbereitung für Imaging

Hinweis: Light sensitive Reagenzien. Halten Sie die Folien vor Licht geschützt.

  1. Tippen Sie die Amplification-Polymerase-Lösung aus der Dias und Wäsche für 2 mal 10 Minuten jeweils in 1x DuoLink II Waschpuffer B in einem Coplin jar unter Rühren bei RT.
  2. Tauchen Sie die Objektträger in 0,1 x Waschpuffer B.
  3. Entfernen Sie das Silikon aus den 16-Well-Objektträger vollständig. Add ~ 40 ul der DuoLink II Eindeckmedium mit DAPI auf dem Deckglas und legen Sie sie vorsichtig über die Proben drücken es leicht an, so dass es keine Luftblasen unter dem Deckglas. Fix und Deckglasränder auf dem Objektträger mit Nagellack. Warten Sie mindestens 15 Minuten, bevor Sie mit Bildgebung.
  4. Analysieren Sie die Proben mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop oder. Erhalten digitalen Bildern.

9. Quantifizierung

Hinweis: Light sensitive Reagenzien. Halten Sie die Folien vor Licht geschützt.

  1. Verwenden Sie DuoLink ImageTool, um die Signale auf die Bilder verlassen, dass eine Messung der Signal-Niveau zu erhalten.
  2. Vergleichen Sie die Messungen und eine Grafik.

10. Repräsentative Ergebnisse

Die Ergebnisse einer In-situ PLA Experiment zeigt, wie diskrete fluoreszierenden Flecken. Die Lage des Signals hängt von der spezifischen Proteine ​​untersucht.

Abbildung 1
Abbildung 1. In situ PLA auf Neuro2a Zellen nach BMP4 Stimulation. Die Zellen wurden mit 2 uM dorsomorphin (Inhibitor des BMP-Weg) (A) bzw. 25 ng / ml BMP4 behandelt (B) für 60 min oder unbehandelt (CE). Antikörper gegen P-Smad1/5/8 und Smad4 wurden verwendet, um die aktive Komplexe in A und B. Die primären Antikörper aP-Smad1/5/8 allein (C) und a-Smad4 allein (D) oder Unterlassung des primären erkennen Antikörper (E) wurden als Kontrollen verwendet. Blau: DAPI; Rot: PLA-Signal. Bilder wurden mit einem Leica SP5 konfokalen Mikroskop erreicht.

(F) Der PLA-Signale wurden mit dem DuoLink ImageTool Software gezählt und die durchschnittliche Zahl der Stellen in den Zellkern pro Zelle ist in der Grafik dargestellt. (G) Neuro2a Zellen blieben unbehandelt oder behandelt mit Dorsomorphin (2 uM) oder BMP4 (25 ng / ml) für 60 min. Die Zellen wurden lysiert und die Proteine ​​wurden auf SDS-PAGE unterzogen und analysiert durch Immunoblotting mit aP-Smad1/5/8 und a-PCNA als Ladekontrolle. (*) Nicht-spezifische Bande. Beachten Sie, dass die aP-Smad1/5/8 Antikörper kann nicht zwischen den 3 verschiedenen Proteinen zu unterscheiden, die in Komplex mit Smad4.

Discussion

Die Visualisierung von Protein-Komplexe in situ ist in der großen Nachfrage, insbesondere für Studien in die signalisieren, wo Protein-Interaktion und Modifikation von Proteinen der bedeutet, dass Zellen für das Senden eines Signals von der Oberfläche zum Kern sind. Es war nicht möglich, zu visualisieren und zu quantifizieren Komplexen zwischen zwei endogene Proteine ​​in situ mit Immunfluoreszenz vor. Co-Lokalisation von Antikörper weist eine geringe Auflösung und kann nicht verwendet werden, um echte Interaktion zu visualisieren. PLA ist eine neue Technik, die Forscher haben begonnen, mit in verschiedenen Systemen mit großem Erfolg 6, 7. Hier zeigen wir, wie PLA Nutzung nicht nur zu visualisieren, sondern auch zu quantifizieren endogenen Komplexen zwischen Smad Effektoren stromabwärts von BMP Stimulation im Laufe der Zeit aktiviert. Wir verwendeten verschiedene Gewebekulturzellen einschließlich Neuro2a und verließ sich auf kommerzielle Antikörper in verschiedenen Spezies (Maus a-Smad4 und Kaninchen aP-Smad1/5/8) angehoben, um diese (Abb. 1) zu erreichen. Diese Methode erlaubt uns, zum ersten Mal, um die Aktivierung von BMP-Effektor-Komplexe im Laufe der Zeit zu sehen und nicht nur die Anwesenheit des phosphorylierten Smad1/5/8, die nicht alle können in aktive Komplexe mit Smad4 engagieren. Wir zählten die Signale (Abb. 1F) und im Vergleich der Messung mit der Quantifizierung von Immunoblot der gleichen Zellen 8 (Abb. 1G) erhalten. Wir schlossen daraus, dass die Zahl der Stellen eine genaue vergleichende Messung der Signal-Niveau im Laufe der Zeit geben. Die Technik wurde auch bei anderen Zelllinien (HEK293T und Cos7) mit ähnlichen Ergebnissen (Daten nicht gezeigt) aufgebracht.

Das Prinzip der Technologie basiert auf zwei einzigartige Sonden mit den DuoLink Kit bereitgestellt werden. Jeder PLA Sonde besteht aus einem sekundären Antikörper an einer einzigartigen synthetischen Oligonukleotid, welches als Reporter fungiert. Die Nähe der Sonden ermöglicht DNA Ligation an den genauen Ort, wo diese Sonden in der Nähe angebracht werden. Der Abstand der Oligonukleotide, die DNA-Hybridisierung und Ligation ist klein (<40nm) und ermöglicht somit, kann nur Proteine, die interagieren können Ligation. Die ligierten DNA kann dann verstärkt und detektiert werden mit Hybridisierung von markierten Oligonukleotiden der amplifizierten Sequenz. Die Verstärkung ist spezifisch, wie es auf DNA-DNA-Hybridisierung Prinzipien abhängt und auch eine hohe Empfindlichkeit der ligierten DNA Mehrfaches was zu Verbesserung des ursprünglichen Ligationsereignis verstärkt wird. Die amplifizierte DNA wird durch Hybridisierung mit markierten Oligonukleotiden erkannt und erzeugt einen sichtbaren und ziemlich großen Fleck. Da die Spots gezählt werden kann, bietet der PLA-Signal nicht nur die exakte räumliche Informationen (Ort der Interaktion Ereignisse), sondern auch eine objektive Möglichkeit zur Quantifizierung dieser Ereignisse 2-4.

Andere Techniken, die für die Detektion von Protein-Interaktionen eingesetzt werden, sind Co-Immunopräzipitation, Immunfluoreszenz und Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET). Co-Immunpräzipitationsassays sind weit verbreitet ermöglicht die Isolierung von Protein-Komplexen. Das Verfahren ist durch Immunoblot was bedeutet, dass die Proteine ​​auf relativ hohem Niveau ausgedrückt werden muss, um erkannt zu werden begleitet. Probleme der hohen Hintergrund oder unspezifische Bindung von einigen Proteinen, die Perlen sind manchmal schwer zu in Co-Immunopräzipitation zu überwinden. Darüber hinaus ermöglichen Co-Immunopräzipitation Assays zum Nachweis von Proteinen, die Teil eines Protein-Komplex werden können, aber nicht unterscheiden kann, diejenigen, die in unmittelbarer Nähe physikalisches Zusammenwirken mit einander sind. Darüber hinaus können Co-Immunpräzipitationen keine Quantifizierung in einzelne Zelle Auflösung oder Informationen über die Lokalisation der Protein-Komplexe in der Zelle. Nachweis der Koexistenz von Proteinkomplexen in einer Zelle oder einem Zell-Kompartiment durch Immunfluoreszenz auf die Überlappung von diffusen Signalen beruht und daher eine geringe räumliche Auflösung und kann keine genauen Informationen über Protein-Interaktionen. Die Quantifizierung der Immunfluoreszenz-Signal kann durch visuelle Abschätzung erfolgen nur, wenn der Unterschied ist ein Mehrfaches, und kann nicht richtig oder messbar wie die PLA-Spots. FRET ermöglicht die Visualisierung von Proteinkomplexen in lebenden Zellen und überwindet die Notwendigkeit für Antikörper und die Exposition des Epitops. Allerdings FRET in der Regel abhängig von der Überexpression von künstlichen Fusionsproteine, die nicht widerspiegeln kann das endogene Protein-Komplexen, wie in der PLA.

Blocking Bedingungen in der PLA-Protokoll sind wichtig, denn Antikörper Aggregation auftreten und erhöhen den Hintergrund. Alternative blockiert Bedingungen können in Antikörper-Produkt zu entnehmen. Entsprechende Kontrollen mit primären und sekundären Antikörper Unterlassung liefern Informationen darüber, was kann falsch gelaufen sein und sie müssen immer aufgenommen werden. Es ist wichtig, verschiedene Antikörper, die am wenigsten Hintergrund, wenn sie allein verwendet werden und das beste Signal geben wird, wenn sie zusammen Bildschirm. Fixation von cells ist wichtig, da über die Festsetzung kann Protein-Komplexe vollständig denaturiert und abgebaut, während unzureichende Fixierung kann zum Verlust der Protein-Komplexen während der Schritte des Verfahrens führen. Dies kann durch eine Senkung der Konzentration des Fixiermittels 3% oder durch eine Begrenzung der Fixierung gesteuert werden. Allerdings hängt die Fixierung auch davon ab, ob der primäre Antikörper erkennen denaturierte Proteine ​​oder nicht. Da die PLA Technik ist sehr empfindlich sind, ist besondere Sorgfalt erforderlich, um die Inkubationszeiten und Mikro Bedingungen gleich zwischen den verschiedenen Proben zu halten.

Die Proben sollten nicht nach links auf jeden Fall vor dem letzten Schritt zu trocknen. Trocknung der Proben kann zu einer erhöhten Hintergrund führen. Die vollständige Entfernung der Blockierungslösung ist auch entscheidend, um Hintergrund zu vermeiden. Der Waschpuffer sollte immer vor dem Gebrauch Raumtemperatur gebracht werden, wie niedrige Temperatur verlangsamt sich die enzymatischen Reaktionen. Für weitere Informationen zur Fehlerbehebung, um das Handbuch des Kit beziehen.

Es ist nützlich, um Flecken zu verwenden, um die subzelluläre Lokalisation der PLA-Signal (zB DAPI, Aktin etc) zu ermitteln. Hier haben wir DAPI (in der Montage-Medium) benutzt, um die Kerne zu färben. PLA ist kompatibel mit der Verwendung von Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen Zelltyp oder zellulären Kompartiment (hier nicht dargestellt) zu bestimmen. Genaue Quantifizierung kann durch Zählen der Signale und die Verwendung einer bestimmten Software (DuoLink Image Tool, Olink Biosience) durchgeführt werden.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, wie man in situ PLA zu verwenden, mit dem DuoLink Kit zum Nachweis BMP-Signalweg in fixierten Zellen und präsentierte seine Vorteile: einfach zu bedienen, sehr empfindlich, keinen Hintergrund, und eine einzigartige Fähigkeit zur aktiven BMP quantifizieren Signalisierung in situ.

Die Begrenzung der Anwendung dieser Technik auf verschiedene Protein-Interaktionen zu studieren, hängt von der Verfügbarkeit und Qualität der primären Antikörper, die die Proteine ​​erkennen untersucht.

Disclosures

Die Produktion dieses Video-Artikel wurde von OLink gesponsert wer macht ein Reagenz in der Nähe Ligation Assay-Verfahren verwendet.

Acknowledgments

Diese Forschung wird von der MRC und der BBSRC Zuschüsse. Wir bedanken uns bei Agata Zieba und Katerina Pardalis in Ulf Landegren Lab, Universität Uppsala für die Hilfe bei der Einrichtung der Technik und nützliche Ratschläge. Olink Biosience für technische Hilfe und die Präsentation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GMEM Invitrogen 21710025
DMEM Invitrogen 21063029
FBS AutogenBioclear 7.01
Non-essential Amino Acids Invitrogen 11149068
Sodium Pyruvate Invitrogen 11360070
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140122
L-glutamine Invitrogen 25030-054
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
16-well chamber slides Lab-Tek 178599
Polysine VWR international 631-0107
Cover glass VWR international 631-0138
a-pSmad1/5/8 Cell Signaling Technology 9511
a-Smad4 (B8) Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-7966
Dorsomorphin Merck & Co., Inc. 171260-10MG
Recombinant Mouse BMP-4 R&D Systems 5020-BP-010
PFA Sigma-Aldrich P6148
Triton-X 100 Sigma-Aldrich T8787
Tween-20 Promega Corp. H5151
Duolink II Detection Reagents (Orange) Olink Bioscience 92007-0100
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS Olink Bioscience 92004-0100
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS Olink Bioscience 92002-0100
Duolink II Mounting Medium with DAPI Olink Bioscience 82040-0005
Duolink II Wash Buffers Fluorescence Olink Bioscience 82049

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References

  1. Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one morphogenetic protein receptors and signal transduction. J Biochem. 147, 35-51 (2010).
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  8. Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids. Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Thank you for the very extensive protocol, it is very helpful. Our question is: do you know of any differences in handling of reagents between the Duolink II and the Duolink I kit? In terms of incubation times and incubation temperatures for example?

    Reply
    Posted by: M v.
    January 28, 2016 - 6:15 AM

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