الحساسية العالية 5 - hydroxymethylcytosine كشفها في أنسجة المخ BALB / C

Neuroscience
 

Summary

يمكن استخدام EpiMark 5 - 5 - مؤسسة حمد الطبية وأدوات التحليل MC لتحليل وquantitate methylcytosine 5 و 5 hydroxymethylcytosine داخل موضعا cific جمعية مهندسي البترول. عدة يميز MC - 5 - 5 من مؤسسة حمد الطبية عن طريق إضافة السكر إلى مجموعة الهيدروكسيل من HMC - 5 عبر رد فعل الأنزيمية باستخدام β - ناقلة الغلوكوزيل (T4 - BGT). عند 5 - HMC يحدث في سياق CCGG ، يحول هذا التعديل MspI شطورة موقع إلى موقع غير شطورة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Davis, T., Vaisvila, R. High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue. J. Vis. Exp. (48), e2661, doi:10.3791/2661 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Glucosylation الحمض النووي ومراقبة ردود الفعل

  1. في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر على الجليد ، مزيج 50-10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني (لتركيز النهائي 30 ميكروغرام / ملليلتر) ، 12.4 microliters من UDP - الجلوكوز (لتركيز النهائي من 80 micromolar) ، و 31 من microliters NEBuffer 4 وتصل إلى 310 microliters nuclease خالية من المياه لتحقيق الحجم الكلي إلى 310 microliters.
  2. تقسيم هذا الخليط التفاعل إلى أنبوبين من 155 microliters لكل منهما.
  3. ثم إضافة 30 وحدة ، أو microliters 3 من T4 - ناقلة الغلوكوزيل - β لأنبوب واحد. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. الأنبوب الثاني هو رد فعل السيطرة ، إضافة لذلك microliters 3 من المياه ، بدلا من BGT - T4.
  4. احتضان كل من أنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 18 ساعة ، وخلال الوقت الذي T4 - BGT سيضيف الجلوكوز إلى مجموعة الهيدروكسيل من 5 hydroxymethylcytosine المجموعات في العينة.

2. تقييد انزيم الهضم

  1. التسمية three - PCR 0.2 ملليلتر الشريط الأرقام من 1 إلى 3 أنابيب. قسامة 50 من المجاهدين في كل خليط التفاعل.
  2. التسمية three - PCR 0.2 ملليلتر الشريط أعداد أنابيب من 4 إلى 6. قسامة 50 ماي من خليط التحكم في كل منها.
  3. إضافة 100 وحدة ، أو ميكروليتر 1 من MspI في أنابيب 1 و 4. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
  4. إضافة 50 وحدة ، أو ميكروليتر 1 من HpaII في أنابيب 2 و 5. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
  5. لا تضيف شيئا إلى أنابيب 3 و 6 ، كما هي الضوابط.
  6. احتضان جميع أنابيب 6 إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
  7. إضافة 1 ميكروليتر من بروتين كاف في كل أنبوب واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. تثبيط بروتين التي يحتضنها K في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.

3. تحليل الحمض النووي عن طريق PCR / qPCR

يستخدم هذا البروتوكول في NEB LongAmp طق لنقطة النهاية PCR وهو ما ثبت لأداء جيدا. يمكن أن تكون بديلا غيرها من البروتوكولات PCR.

  1. إضافة المكونات التالية لأنبوب 0.2 ملليلتر تفاعل PCR على الجليد : 10 microliters من 5X LongAmp الاحتياطي الرد طق ، 1.5 microliters من 10 dNTPs millimolar ، 1 ميكروليتر التمهيدي من 10 انتقل micromolar ، 1 ميكروليتر من 10 عكس micromolar التمهيدي و 3 من قالب microliters الحمض النووي من الخطوات السابقة ، 1 ميكروليتر من البلمرة DNA LongAmp طق ، وخالية من المياه nuclease تصل إلى 50 microliters. قد تتغير هذه الكميات وفقا لبروتوكول PCR المستخدمة.
  2. المزيج بلطف التفاعل. إذا لزم الأمر ، وجمع كل السائل إلى أسفل الأنبوب التي تدور بسرعة.
  3. تراكب العينة مع الزيوت المعدنية في حالة استخدام thermocycler دون غطاء ساخنة.
  4. نقل أنابيب PCR من الجليد لthermocycler مع الكتلة محمى إلى 94 درجة مئوية وبدء برنامج ركوب الدراجات. لروتين 3 - PCR الخطوة ، ينبغي أن تكون هناك خطوة واحدة تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية تمسخ و 55 إلى 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية الصلب ، و 65 درجة مئوية التمديد لمدة 20 ثانية ، أو 50 ثانية لكل كيلوبايت. وينبغي أن يتبع ذلك من قبل أحد التمديد النهائي في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ويمكن أيضا في الوقت الحقيقي PCR أن يؤديها لquantitate مبالغ methylcytosine - 5 و 5 hydroxymethylcytosine. يرجى الرجوع إلى دليل المنتجات ، والعثور على neb.com عن معلومات محددة.

4. ممثل النتائج :

الشكل 1
الشكل 1. مقارنة بين 5 - hydroxymethylcytosine المبالغ في 12 موضعا في عينات الأنسجة المختلفة الماوس BALB / C. (A) ، نقطة النهاية PCR. (B) ، في الوقت الحقيقي PCR.

وقد تم تحليل الحمض النووي من الأنسجة الماوس الأربعة. لأغراض المقارنة ، تم تطبيع PCR الوقت الحقيقي للبيانات الحمض النووي غير المصقول. واستخدمت لتحديد المنحنى القياسي في عدد النسخ. ويمكن تطبيع عينات بقسمة عدد نسخ أي من العينات 1-6 قبل عدد نسخة من التحكم الذي هو عسر الهضم (رقم 5). محاصر حارة هلام يظهر التباين في 5 HMC الحالي.

Discussion

هناك أشياء عدة حاسمة في الاعتبار عند إعداد هذه التجربة. أولا ، من المهم أن glucosylation من الحمض النووي الجينومي العائدات على الانتهاء. ولا يعرف خصوصية تسلسل BGT - T4 ، ويبدو أن لا خيار لتسلسل الركيزة. ولذلك ، في بعض الحالات ، قد تكون أوقات أطول الحضانة اللازمة. ثانيا ، يجب MspI HpaII الهضم وتكون كاملة من أجل تجنب إشارة الخلفية. لتقييد هذه الإنزيمات ، نوصي وقت الحضانة من 4 ساعات ، ولكن لا يمكن أن يؤديها يعد حضانات عندما لوحظ انقسام غير مكتملة. ثالثا ، يمكن تعديلها إدخال كمية الحمض النووي اعتمادا على توافر ، يمكن استخدامها منذ 20 NGS من الحمض النووي لنقطة النهاية PCR. وأخيرا ، فإننا نوصي باستخدام الحمض النووي التحكم الموردة والتي قد تكون بالتوازي مع الحمض النووي الجيني لMC - 5 - 5 وتقدير مؤسسة حمد الطبية.

Disclosures

كل من تيد والغجر ، والمؤلفين من هذه المادة ، والعاملين في NEB ؛ الغجر هي المطور الرئيسي للمجموعة ، مع تيد يجري مدير قسم التطوير والتطبيقات التي أشرفت على إعداد هذه المجموعة.

Acknowledgments

Sriharsa برادان ، شانون موري كيني ، هانغ كيونغ شين ، Jurate Bitinaite ، يو تشنغ ، بيير اوليفييه استيف Romualdas Vaisvila ، والمختبرات ستيفن هاء جاكوبسن ثانية ، جامعة كاليفورنيا. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R44GM095209 - 01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit New England Biolabs E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0323
dNTPs New England Biolabs N0447
molecular biology grade water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).
  2. Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).
  3. Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).
  6. Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5, (1), e8888-e8888 (2010).

Comments

3 Comments

  1. Will you please send me this article of "High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue". I just cannot download it.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 11:15 PM
  2. Linkejimai nuo Audriaus Buskeviciaus. Sekmes.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 23, 2011 - 2:48 PM
  3. Can glucosylation of C happen in vivo and is it possible that MspI digestion could be partially blocked by such a modification (without prior treatment with T4 BGT)? Thanks.

    Reply
    Posted by: Lise R.
    October 2, 2012 - 5:09 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics