قوية من الجيل الكبدية مثل خلايا الجنينية البشرية من السكان الخلايا الجذعية

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذه المادة سوف تركز على جيل من الأديم الباطن كبدي الإنسان من الجنينية البشرية السكان الخلايا الجذعية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. J. Vis. Exp. (56), e2969, doi:10.3791/2969 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

على الرغم من التقدم في النمذجة سمية الدواء الإنسان ، وفشل العديد من المركبات خلال التجارب السريرية وذلك بسبب الآثار الجانبية غير المتوقعة. تكلفة دراسات سريرية كبيرة ، ولذلك فمن الضروري أن يتم تطوير شاشات أكثر السموم التنبؤي ونشرها في وقت مبكر من تطوير العقاقير (Greenhough وآخرون 2010). خلايا الكبد البشرية تمثل النموذج الذهب القياسية الحالية لتقييم سمية الدواء ، بل هي مورد محدود الذي يحمل وظيفة متغير. ولذلك ، يعمل بشكل روتيني استخدام خطوط الخلايا خلد ونماذج الأنسجة الحيوانية بسبب الوفرة. في حين أن كلا من مصادر إعلامية ، تقتصر وظيفة من قبل الفقراء ، وتقلب الأنواع و / أو عدم الاستقرار في الثقافة (Dalgetty وآخرون 2009). الخلايا الجذعية المحفزة (الأمنية) هي مصدر بديل للجاذبية الإنسان مثل خلايا الكبدية (ثوابت قانون هنري هي) (ميدين وآخرون 2010). الأمنية قادرة على تجديد الذات والتمايز إلى جميع أنواع الخلايا الجسدية الموجودة في البالغين ، وتمثل بالتاليمصدر لا ينضب من الخلايا يحتمل أن تكون متباينة. وضعنا الداخلي التي هي بسيطة وفعالة للغاية ، قابلة للأتمتة وثوابت قانون هنري هي غلة الإنسان وظيفية (هاي وآخرون 2008 ؛ فليتشر وآخرون 2008 ؛ حنون وآخرون 2010 ؛ باين وآخرون 2011 وهاي وآخرون 2011). نعتقد دينا التكنولوجيا سيؤدي إلى تحجيم الإنتاج من ثوابت قانون هنري هي لاكتشاف المخدرات ، والنمذجة المرض ، والبناء من خارج الخلية الجسدية الأجهزة وربما علاجات زرع القائمة.

Protocol

1. تحضير أولي لجميع الأرصدة الكيماوية وطلاء بلستيكور الثقافة

على أن تتم جميع الخطوات في نسيج الثقافة هود في ظل ظروف معقمة.

  1. إعداد الإنسان الأساسية عامل نمو الخلايا الليفية (hbFGF)
    1. إعداد جيش صرب البوسنة 10 ٪ الحل في برنامج تلفزيوني ومرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
    2. من حل جيش صرب البوسنة 10 ٪ يعد حل جيش صرب البوسنة 0.2 ٪.
    3. إضافة 10 مل من 0.2 ٪ ميكروغرام solution/100 hbFGF BSA.
    4. قبل الرطب 0.22 ميكرون تصفية من خلال تصفية 5 مل حل جيش صرب البوسنة 10 ٪ من خلال التصفية. رفض 10 مل BSA يغسل.
    5. تصفية hbFGF من خلال تصفية ما قبل غسلها.
    6. قسامة في hbFGF في eppendorfs العقيمة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد الإنسان Activin حل للسهم
    1. إضافة 1 مل من جيش صرب البوسنة 0.2 ٪ في حقنة والرطب قبل تصفية.
    2. تمييع Activin ألف في جيش صرب البوسنة 0.2 ٪ إلى تركيز الأسهم من 100 ميكروغرام / مل.
    3. تصفية األنشطةن هناك حل وقسامة في eppendorfs عقيمة ، في مخزن -20 درجة مئوية.
  3. إعداد الحل ماوس ألبوم Wnt3a
    1. إضافة 200 ميكروليتر من PBS إلى قارورة ميكروغرام 2 من Wnt3a إلى تركيز الأسهم من 10 ميكروغرام / مل.
    2. قسامة في eppendorfs العقيمة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. إعداد الإنسان محلول المخزون HGF (1000X)
    1. تمييع HGF في برنامج تلفزيوني إلى تركيز الأسهم من 10 ميكروغرام / مل.
    2. تصفية حل HGF وقسامة في eppendorfs عقيمة ، في مخزن -20 درجة مئوية.
  5. إعداد الحل Oncostatin ألبوم M (1000X)
    1. تمييع OSM في برنامج تلفزيوني إلى تركيز الأسهم من 20 ميكروغرام / مل.
    2. تصفية حل OSM وقسامة في eppendorfs عقيمة ، في مخزن -20 درجة مئوية.
  6. طلاء للثقافة بلستيكور مع Matrigel
    1. تحسن رصيد 10 مل زجاجة Matrigel بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على الجليد ثم إضافة 10 مل من KO - DMEM. تخلط جيدا باستخدام ماصات مبردة وتخزين 1aliquots مل في -20 درجة مئوية.
    2. ذوبان الجليد an قسامة من Matrigel عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة أو طوال الليل لتجنب تشكيل مادة هلامية.
    3. أضف 5 مل من البرد KO - DMEM إلى matrigel ، مزيج جيد مع ماصة.
    4. جعل ما يصل الى 15 مل من البرد KO - DMEM وباستخدام مزيج ماصة.
    5. إضافة إلى لوحة matrigel أو قارورة تطلى (الجدول (ط))
لوحة / قارورة الحجم / حسنا أو قارورة
12 لوحة جيدا 0.5 مل لكل بئر
6 كذلك لوحة 1 مل لكل بئر
25cm 2 قارورة 2 مل في القارورة

الجدول 1. مجلدات تم ترشيحها من matrigel لطلاء بلستيكور نموذجية للثقافة hESC.

    1. احتضان لوحة مطلية أو القارورة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو غرفةtempature لمدة 1 ساعة قبل الاستعمال.
    2. ويمكن تخزين لوحات أو القوارير التي تم المغلفة مع matrigel في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع. وينبغي أن تكون علامات واضحة مع التاريخ والمغلفة بها. تجاهل أي لوحات أو قوارير لم تستخدم خلال اسبوع واحد.
      1. قبل الاستخدام تسمح للحاوية الثقافة المغلفة ليصعد إلى درجة حرارة الغرفة داخل نسيج الثقافة هود.
      2. مباشرة قبل استخدام نضح في matrigel وإضافة تعليق الخلية إلى البئر أو القارورة.

2. الصيانة الروتينية للثقافات وتوصيف hESC

  1. إنعاش خطوط hESC
    1. إزالة hESCs من تخزين النتروجين السائل وذوبان الجليد بسرعة في حمام الماء ° 37 مئوية.
    2. نقل الخلية بعناية لتعليق أنبوب عقيمة مل تحتوي على العديد من المتوسط ​​الدافئة.
    3. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي @ سرعة منخفضة ل5min (1000 دورة في الدقيقة).
    4. نضح قبالة resus طاف وبلطف جدايعتمدون الخلايا في المتوسط ​​الدافئة وفاق لوحة خارج على طبقة المغذية MEF.
    5. خلايا Refeed يوميا مع الطازجة والمتوسطة وفاق على subconfluence ، والخلايا ، والخلايا تتطلب الركض.
  2. صيانة روتينية hESC
    تزرع الخلايا وفاق في لوحات أو قوارير المغلفة مع matrigel. الخلايا تحتاج إلى دراسة وتغذى يوميا :
    1. تفحص تحت المجهر لمورفولوجيا تلوث الخلية ، والتقاء.
    2. نضح المتوسط ​​المستهلك.
    3. إضافة حجم مناسب لمتوسطة جديدة ماوس الليفية مكيفة الجنينية (MEF - CM) + الإنسان bFGF (تركيز النهائي 4 نانوغرام / مل) أو غيرها من وسائل الإعلام الحرة في الدم 6.
  3. الركض مع الخلايا كولاجيناز
    وسوف خطوط hESC (H1 ، وRCM H9 - 1) تصل إلى نقطة التقاء كل 5-7 أيام بعد الركض في نسبة انقسام 01:03. hESCs مرور في وقت مبكر من وجود سدى تنمو أبطأ والوقت على matrigel يمكن أن تصبح عاملا هاما. المجالس الاقتصادية والاجتماعية لا ينبغي أن يترك الإنسان أطول من 14أيام في نفس matrigel بسبب تدهور المصفوفة وفي هذه الحالة قد يكون من الضروري لتمرير الخلايا في الانقسام نسبة 1:1 أو 01:02 إذا كانت الخلايا subconfluent.

    انزيم الحضانة
    1. على أن تتم جميع الخطوات في نسيج الثقافة هود في ظل ظروف معقمة.
    2. ضمان عدم وجود طبق matrigel جديدة مغلفة أو القارورة كما أعدت في القسم 1.6.
    3. تقرر على نسبة انقسام للخلايا المطلوب. ويشارك عدد من العوامل في تحديد نسبة انقسام :
      1. ويمكن العودة إلى passaged حجم أصغر بشكل جيد أو يمكن passaged 01:01 والتي سوف تتخلص من بعض سدى ، وبالتالي زيادة نسبة إلى مستعمرة سدى ، وتعزيز النمو hESC : مستوى عال من سدى مع انخفاض عدد المستعمرات.
      2. يمكن passaged مستوى عال من سدى مع مستعمرات كبيرة ، اعتمادا على عدد من المستعمرات ، 1:1 أو 01:02 إذا كان هناك مستعمرات hESC كبيرة بما فيه الكفاية.
      3. نموذجي hESCs المتنامية مع شارع قليلايمكن passaged OMA سدى أو لا و / أو بعض التمايز 1:02 أو 3.
      4. نضح في وسائل الاعلام من البئر أو القارورة.
      5. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني تراخيص 2 (2 - MgCl ، CaCl - 2).
      6. إضافة حجم مناسب لكولاجيناز (200 U / مل مخففة في KO - DMEM) واحتضان 2-5 في 37 دقيقة لدرجة مئوية. في الفترة من 2 دقيقة فصاعدا فحص بانتظام تحت المجهر (فترات 1 دقيقة). عند نقطة الخلايا المتمايزة تبدأ برفع قبالة المستعمرات والبدء في رفع على حافة الخلايا جاهزة للpassaged.
    تجريف وتجميع hESCs
      1. نضح في كولاجيناز.
      2. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني تراخيص 2 (2 - MgCl ، CaCl - 2).
      3. إضافة حجم مناسب لMEF - CM اعتمادا على نسبة الانقسام ، واستخدام مكشطة خلية جسدية إزالة الخلايا من سطح البئر أو قارورة ، ثم جنرال متمزجtly بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 2-3 مرات باستخدام ماصة 10 مل. من المهم أن يتم الاحتفاظ hESCs في كتل من الخلايا وعدم تقسيمها إلى خلايا واحدة.
    Replating في hESCs
      1. Replate تعليق على الخلية الناتجة من قوارير matrigel جديدة مغلفة أو الآبار.
      2. جعل حجم MEF - CM تصل إلى 4 مل للبئر لوحة 6 - جيدا.
      3. عند وضع الخلايا في الحاضنة تستنهض الهمم الحاوية زراعة الأنسجة لضمان حتى قدر ممكن من التوزيع المستعمرات والمستعمرات تميل إلى أن تستقر في مركز زراعة الأنسجة لوحة / القارورة التي تؤثر على الخلايا والتمايز replating.
  4. توصيف الروتينية للسكان hESC بواسطة التدفق الخلوي
    1. ويتم فحص السكان hESC عبر التدفق الخلوي مرة واحدة في الشهر لعلامات مثل الخلايا الجذعية 3 أكتوبر / 4 ، 10-60 وترا SSEA - 4.
    2. hESCتتم إزالة السكان من الركيزة بصفتهم تعليق خلية واحدة بعد 5 دقائق مع العلاج التربسين / EDTA (Invitrogen).
    3. Resuspend الخلايا واحد في الخلايا 1x10 6 / مل في برنامج تلفزيوني تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1 ٪ و 0.1 ٪ أزيد الصوديوم.
    4. احتضان الاستعدادات الخلية في 4 درجة مئوية مع الأجسام المضادة المناسبة لمدة 40 دقيقة.
    5. غسل الخلايا مرتين مع PBS تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1 ٪ و 0.1 ٪ أزيد الصوديوم لإزالة الأجسام المضادة غير منضم وresuspend إلى الحجم النهائي من 100 ميكروليتر وتحليلها من قبل التدفق الخلوي.
    6. يتم الحصول على بيانات عن 30000-40000 الأحداث "العيش" في كل عينة باستخدام عداد الكريات العيار FACS مجهزة ليزر 488 نانومتر وتحليلها باستخدام برامج CellQuest (بيكتون ديكنسون ، سان خوسيه ، كاليفورنيا). يتم تضمين الخلايا غير ملوثين والضوابط. استبعدت الخلايا الميتة وأفكارك مع الحطام من التحليل باستخدام البوابة الالكترونية على الهواء مباشرة إلى الأمام والمعلمات مبعثر مبعثر الجانب.

3. التفاضليةالنسبة من hESCs إلى الأديم الباطن كبدي

  1. إعداد الإعلامي للتمايز hESCs إلى الأديم الباطن كبدي. ينبغي أن يتم إعداد جميع وسائل الإعلام في نسيج الثقافة هود في ظل ظروف معقمة.
    1. إعداد RPMI : B27 المتوسطة فتيلة للتمايز الأديم الباطن
      1. لRPMI - B27 المتوسطة ، مزيج RPMI 1640 (500 مل) و B27 (50x ، 10 مل)
      2. دوامة لخلط المكونات.
      3. إضافة إلى كافة مكونات وحدة التصفية والتصفية بموجب تخزين ، والفراغ في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد SR - DMSO المتوسطة للتمايز الكبدية
      1. لSR - DMSO المتوسط ​​، 80 ٪ خليط KO - DMEM ، و 20 ٪ كو ريال ، و 0.5 ٪ L - الجلوتامين ، 1 ٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 0.1mM β - المركابتويثانول وDMSO 1 ٪.
      2. تصفية حل تحت vacum وتخزين عند 4 درجة مئوية ، وقسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
      3. استخدام 4 مل لكل بئر من لوحة 6 - جيدا ، و 6 مل في القارورة T25.
    3. إعداد المتوسطة النضج L15 لهيباtocyte نضوج
      1. L - 15 للمتوسط ​​، مزيج 500 مل يبوفيتش L - 15 متوسطة ، tryptose الفوسفات مرق (تركيز النهائي 8.3 ٪) ، والحرارة الجنين البقري المعطل المصل (تركيز النهائي 8.3 ٪) ، هيدروكورتيزون 10 ميكرومتر hemisuccinate 21 ، 1 الأنسولين ميكرومتر (البنكرياس البقري ) ، 1 ٪ L - الجلوتامين ، و 0.2 ٪ حامض الاسكوربيك.
      2. تصفية حل تحت vacum وتخزين عند 4 درجة مئوية ، وقسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
    4. إعداد RPMI النهائي : B27 المتوسطة فتيلة
      1. الاستغناء عن حجم المطلوب من المتوسط ​​فتيلة للتجربة (1 مل لكل بئر من لوحة 6 - جيدا ، و 2 مل من القارورة في T25).
      2. إضافة Activin ألف إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل.
      3. إضافة المؤتلف Wnt3a إلى تركيز النهائي من 50 نانوغرام / مل.
      4. مزيج جيد ووسائل الإعلام الآن جاهزة للاستخدام.
      5. وينبغي بذل هذه الوسائط النهائية تصل طازجة كل يوم.
    5. إعداد النهائي المتوسطة L - 15 نضوج
      1. الاستغناء عن المطلوبحجم L - 15 المتوسطة للتجربة (4 مل لكل بئر من لوحة 6 - جيدا ، و 6 مل في القارورة T25).
      2. HGF إضافة إلى التركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل.
      3. OSM إضافة إلى التركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل.
      4. مزيج جيد ووسائل الإعلام الآن جاهزة للاستخدام.
      5. وينبغي بذل هذه الوسائط النهائية تصل طازجة كل يوم.
  2. hESCs فتيلة إلى نهائي الأديم الباطن
    1. ثقافة hESCs (H1 ، وRCM H9 - 1) ونشر على لوحات مغلفة matrigel مع الليفية الماوس الجنينية MEF - CM تستكمل مع bFGF.
    2. بدء المفاضلة كبدي hESCs عندما تصل الى مستوى confluency من حوالي 30 ٪ -60 ٪ (اعتمادا على خط hESC) بالاستعاضة عن MEF - CM المتوسطة مع فتيلة (B27 - 1640 RPMI تستكمل مع 100 نانوغرام / مل Activin ألف و 50 نانوغرام / مل Wnt3a.
    3. يتم تربيتها في الخلايا المتوسطة فتيلة لمدة 3 أيام (تغيير المتوسط ​​كل 24 ساعة) ، ويرصد النهائي المتوسطة فتيلة مع A Activin وWnt3a تصل طازجة كل يوم.
    4. الثقافة في 8 ايام في الخلايا المتوسطة النضج والصيانة (L - 15) استكملت مع 10 نانوغرام / مل و 20 hHGF OSM نانوغرام / مل لمدة 9 أيام (تغيير المتوسط ​​كل 48 ساعة). يتم النضج والصيانة والمتوسطة مع hHGF OSM تصل طازجة كل يوم.
    5. الخلايا المعرض تدريجيا تغيرات شكلية من شكل شائك / الثلاثي على مورفولوجيا الكبد مميزة عرض مظهر مضلع (الشكل 2A).
    6. تخطيطي للتمايز الخلايا الكبدية :

4. توصيف من الأديم الباطن hESC كبدي المشتقة

  1. Immunostaining
    1. يغسل ثوابت قانون هنري هي مشتقة hESC مرتين مع برنامج تلفزيوني ، 1 دقيقة كل غسل.
    2. إصلاح ثوابت قانون هنري هي PFA مع 4 ٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، (الخليةويمكن تخزين الصفحات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية وملون في تاريخ لاحق). يمكن أيضا أن تكون ثابتة مع خلايا الميثانول الجليد البارد لمدة 10 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    3. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني ، كل 5 دقائق يغسل.
    4. احتضان الخلايا لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الإيثانول بنسبة 100 ٪ لتلطيخ النووية (غير مطلوبة هذه الخطوة إذا تم استخدام الميثانول التثبيت).
    5. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني ، كل 5 دقائق يغسل.
    6. كتلة الخلايا مع PBS / T (0.1 ٪ توين) / جيش صرب البوسنة 10 ٪ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    7. إزالة عازلة تمنع وإضافة الضد منها الأولية مخففة في برنامج تلفزيوني / T (0.1 ٪ توين) / BSA 1 ٪ واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع الانفعالات.
    8. غسل الخلايا 3 مرات مع PBS / T (0.1 ٪ توين) / 1 BSA ٪ في درجة حرارة الغرفة ، و 5 دقائق كل غسل.
    9. إضافة المناسبة الثانوية اليكسا فلور الأضداد (1:400) المخفف في برنامج تلفزيوني للخلايا ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام مع الانفعالات. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ، كل 5 دقائق يغسل.
    10. جبل بشكل جيد مع كل MOWIOL 4-88 ودابي (1:1000). تغطي بشكل جيد مع زلة تغطية ، الضغط على ساترة بلطف لضمان أن تتم إزالة جميع فقاعات الهواء وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام.
  2. العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي
    1. غسل ثوابت قانون هنري هي مشتقة hESC مع برنامج تلفزيوني ونضح.
    2. إضافة 1 مل من كاشف TRIZOL ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. تتخلص من الخلايا وتضعها في إيبندورف مل 1.5 (مخزن في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا إذا لزم الأمر).
    4. إضافة 0.5 مل من الكلوروفورم لإيبندورف وتخلط بواسطة قلب ؛ تأكد من القيام بذلك في غطاء الدخان.
    5. الحل الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    6. جمع طبقة مائية والمكان الى إيبندورف نظيفة ، وتأكد من عدم وجود تلوث من واجهة.
    7. إضافة 1 مل من مزيج من قبل والأيزوبروبانول قلب ، وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لprecipiتيت الحمض النووي الريبي.
    8. الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    9. نضح في وطاف تأكد من عدم تعكير صفو بيليه الحمض النووي الريبي. تغسل مع 0.5 مل من الايثانول 70 ٪ وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    10. الطرد المركزي في 8000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    11. نضح الإيثانول ويترك ليجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق.
    12. مرة واحدة كل الايثانول قد تبخرت ، وresuspend بيليه في 30 ميكروليتر من الماء deionised. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
    13. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام nanodrop.
  3. عكس النسخ PCR
    1. إعداد رد فعل سابقا باستخدام الحمض النووي الريبي معزولة (200 نانوغرام) ، hexamers عشوائي ، النيوكليوتيدات (10MM) الناسخ العكسي والعازلة منها في رقيقة الجدران إيبندورف مل 0.5.
    2. انشاء RT السلبية ، فإن رد الفعل أعلاه دون الناسخ العكسي.
    3. مكان الأنابيب في cycler الحرارية ، PCR آلة ، وإعداد ع التاليةrogram :
      1. 37 درجة مئوية -- 5 دقائق (1 دورة)
      2. 42 درجة مئوية -- 1 ساعة (1 دورة)
      3. 95 درجة مئوية -- 5 دقائق (1 دورة)
    4. [كدنا] في تخزين -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا إذا لزم الأمر.
  4. TAQMAN الناسخ العكسي الكمية بوليميريز سلسلة حصاد تفاعل الخلايا في نقاط زمنية مختلفة في جميع أنحاء بروتوكول تمايز. استخراج الحمض النووي الريبي وتنفيذ عكس qPCR النسخ باستخدام بادئات التالية والفحص عند الطلب ، (النظم البيولوجية التطبيقية) البروتوكول :
    1. 4 أكتوبر Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. ألبومين Hs00910225_m1
    4. بروتين جنيني ألفا Hs00173490_m1

لعزل الحمض النووي الريبي واستخراج يرجى الرجوع إلى الفرع 3.3.2

  1. وعكس النسخ qPCR TAQMAN
    1. تأخذ 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي وعكس لتدوين [كدنا] باستخدام النسخ Invitrogen في الثالث مرتفع عكسعدة ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. 1 ميكرولتر من [كدنا] المستخدمة في رد فعل TAQMAN 25 ميكرولتر تتألف من الاشعال المناسب من النظم البيولوجية التطبيقية ، 18S الاشعال والتحكم الريباسي Invitrogen في 2X البلاتين qPCR supermix UDG مع ROX وحجم مناسب من الماء.
    3. مزيج جيد ومكان 10 ميكرولتر من كل عينة في بئرين من إما 96 أو 384 لوحة qPCR جيدا.
    4. حالما يتم تحميل جميع العينات ، بالإضافة إلى الضوابط المناسبة) ، وختم لوحة وتحليل النظم البيولوجية على الجهاز التطبيقية TAQMAN 7900HT.
    5. يتم التعبير عن النتائج على النحو التعبير النسبية على عينة السيطرة.
  1. السيتوكروم التحليل الوظيفي للالأديم الباطن hESC الكبدي المشتقة فحوصات P450 -- http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. احتضان يوم 17 hESC المستمدة سعادة مع الركيزة محددة لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية (ن = 3). استخدام وسائل الإعلام باعتبارها زراعة الأنسجةالسيطرة السلبية واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات.
    2. جمع supernatants وتنفيذ مقايسة حسب تعليمات الشركة المصنعة.
    3. قياس المستويات النسبية للنشاط القاعدية وتطبيع للبروتين ملغ على النحو الذي يحدده الفحص BCA (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm؟fldID=02020101).

تلاحظ

  1. وتستند كافة وحدات التخزين على شكل لوحة 6 - جيدا. ضبط كميات تبعا للوحة المطلوبة أو القارورة.
  2. يتم تصفية جميع المتوسطة فتيلة ، والتمايز والنضج تحت فراغ قبل الاستخدام.
  3. يتم تخزين فتيلة ، والتمايز والنضج المتوسط ​​عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع. تقييم كم هو المطلوب المتوسطة للتجربة وسائل الإعلام وقسامة المتبقية وتخزينها على -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  4. يرصد Matrigel تصل حسب تعليمات الشركة المصنعة ، ويمكن تخزين aliquots مل 1 في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. غروويمكن تخزين العوامل وث مرة واحدة وتصل في aliquoted -20 درجة مئوية ، ويمكن تخزينها عند إذابة عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع.
  6. الأجسام المضادة الأولية عادة ما تستخدم لتوصيف hESC ثوابت قانون هنري هي مشتقة من الزلال (1:250 ، سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO).

5. ممثل النتائج :

حافظت توصيف hESCs من قبل التمايز كبدي

من أجل توصيف حالة الخلايا الجذعية من hESCs H9 التي استخدمت في الدراسة قمنا بدراسة عدد من المعلمات. عرضت الخلايا التشكل hESC الصغيرة والخلايا معبأة بإحكام المتنامي في المستعمرات تعريف (الشكل 1A) وأعرب عن الخلايا الجذعية علامات الجينات المحفزة ، أكتوبر 3 / 4 وNanog (الشكل 1B). لم نجد اختلافات كبيرة في التعبير عن هذه الجينات بالمقارنة مع خط السيطرة H7 hESC إيجابية. بالإضافة إلى ذلك ، كان 90،1 ٪ من السكان hESCs إيجابية للخلية الجذعية علامة SSEA - 4 (الشكل 1C).

هوSC التمايز إلى الأديم الباطن كبدي

يمكن أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتباينة بكفاءة لالأديم الباطن الكبد في المختبر (هاي وآخرون 2008). في يوم 9 من التمايز ، وكانت تحصد الخلايا وجرى تقييم لتمايز hESC ثوابت قانون هنري هي. كما ذكرت سابقا في معارضها hESCs سلسلة من التغييرات البنيوية العميقة ، ويوم 9 ، عرضت التشكل الكبدي المبكر النامية مظهر مضلع (الشكل 2A). وعلاوة على ذلك ، لوحظ downregulation من 4 / 3 أكتوبر على مدار اليوم الساعة 9 (2B الشكل). في المقابل ، كانت محاضر لوكالة فرانس برس الكبد والزلال يصل التنظيم (الشكل 2C) ابتداء من 7 أيام.

النضج في المختبر من الأديم الباطن كبدي

وقد نضجت الأديم الباطن الكبد في المختبر باستخدام إجراءات المتبعة (هاي وآخرون 2008). في اليوم الأخير من تمايز الثقافات وimmunostained عن علامات كبد الإنسان الزلال ، و E لوكالة فرانس برس كادهيرين. العائد من ثوابت قانون هنري هي باستخدام لدينا الإجراء هو عادة 90 ٪ (هاي وآخرون 2008 ؛ حانون وآخرون 2010 ؛ باين وآخرون 2011). ملطخة ثوابت قانون هنري هي ايجابية للالزلال ، بروتين جنيني ألفا و E - كادهيرين (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. توصيف للhESCs المستخدمة في هذه الدراسة. (أ) : لاحظ ممثل المرحلة النقيض من الصور المجهري hESC التشكل في الثقافة في التكبير 4X و 10x. تم القبض على الصور باستخدام TE3000 / U نيكون المجهر المقلوب (B) ومثقف hESCs Octamer (أكتوبر 3 / 4) إيجابية إيجابية وNanog. وكانت H7 hESCs استخدامها بوصفها تعدد القدرات لمراقبة مستويات التعبير الجيني. التعبير النسبية تشير إلى طيات تحريض مقارنة مع سيطرة الجين الذاتية ، β - 2 - المكروغلوبولين (C) FACS إظهار مؤامرات hESC مستويات التعبير سطح علامة ، بما في ذلك المرحلة الجنينية مستضدات محددة SSEA 4.

69/2969fig2.jpg "/>
الشكل 2. (أ) على النقيض من الصور المجهري ممثل المرحلة hESC المستمدة من التشكل الكبدي الأديم الباطن في يوم 9 من التمايز التي لوحظت في الثقافة ، والتكبير في X4 X10 (ب) توصيف تغيرات في التعبير الجيني. تم استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل كمي [كدنا] بواسطة بوليميريز سلسلة من ردود الفعل ، وتبين downregulation التدريجي للخلايا غير متمايزة التعبير الجيني (أكتوبر 04/03) و (C) upregulation من التعبير الجيني الكبدية (الألبومين وα بروتين جنيني). التعبير النسبية تشير إلى طيات تحريض مقارنة مع سيطرة الجين الذاتية ، β - 2 - المكروغلوبولين في اليوم 0 من التمايز. هو الرمز P <0.05 * و ف <هو الرمز 0،001 *** يقاس من قبل الطلاب في اختبار t مقارنة hESCs في اليوم 0. أشرطة الخطأ تمثل 1 الانحراف المعياري.

الشكل 3
الشكل 3. الفصلaracterisation hESC المستمدة من الأديم الباطن كبدي
كيمياء سيتولوجية مناعية تظهر علامات التعبير الكبدية ، الزلال ، لوكالة فرانس برس وE - كادهيرين في hESC (H9) المستمدة الأديم الباطن كبدي. تم تنفيذ ضوابط السلبية مع الغلوبولين المناعي G المقابلة (مفتش) ، وممثلين تظهر الصور.

الشكل 4
الشكل 4. hESC (H9) ثوابت قانون هنري هي مشتقة معرض النشاط الأيضي. في يوم 17 ، H9 متمايزة لثوابت قانون هنري هي معارضها CYP3A النشاط الأيضي = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد طورنا نموذجا بسيطا ، متجانسة وقابلة للتكرار للغاية في المختبر لتوليد مستويات متدرجة من ثوابت قانون هنري هي الإنسان. وقد تم التحقق من صحة النموذج لدينا من قبل عدد من المختبرات الخارجية المتعاونة. نحن نصنف بشكل روتيني ثوابت قانون هنري هي الخلايا الجذعية المستمدة باستخدام أداة لدينا في المربع منزل علامات التنموية والكبد المقايسات وظيفية محددة (معظمها متوفر تجاريا). المراحل الحاسمة في عملية لدينا هي : الحفاظ على الخلايا الجذعية تعدد القدرات ، والقدرة على توجيه تمايز الخلايا الجذعية إلى نهائي الأديم الباطن ، ومواصفات الثقافات متجانسة من الأديم الباطن كبدي والقدرة على اشتقاق ناضجة الأديم الباطن وظيفة الكبد العارضة واسعة النطاق في المختبر.

كان واحدا على سبيل الحصر ، نشر على نطاق واسع من الخلايا الجذعية المستمدة HLC التكنولوجيا الدالة على المدى القصير متمايزة من الأديم الباطن كبدي نضجا في الثقافة (~ 4 أيام على matrigel). على هذا النحو يكون لدينا فحص البوليمرمكتبة ليدعم الخلوية الحيوية النشطة والرواية. وقد أدى هذا إلى التعرف على الدعم الذي يحافظ على الرواية وظائف الكبد ما لا يقل عن 15 يوما. التوجهات المستقبلية لهذه التقنية في البداية تطبيق الصناعي في عملية اكتشاف المخدرات (هاي وآخرون 2011). مكاسب متوسطة المدى تشكل هذه التقنية من المرجح أن تكون البشرية : دعم الكبد من خارج الأجهزة مادية لسد أو علاج المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد. ويمكن تحقيق مكاسب على المدى الطويل من هذه التكنولوجيا في العلاج زرع الخلايا استنادا لأمراض الكبد ، إلا أن البيانات الحالية تبين أن هذه الاستراتيجية تتطلب بذل جهد كبير قبل أن يمكن استخدامه بأمان في العيادة (باين وآخرون 2011).

في الختام ، على أهمية التكنولوجيا في المختبر لدينا هو القدرة على توليد الثقافات متجانسة وغير محدود من ثوابت قانون هنري هي الدقة العالية الإنسان للبيولوجيا التطبيقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وكان وكان مدعوما من قبل الدكتور هاي زمالة RCUK ، أيد الدكتور الغربية من قبل قسم الجراحة ، أيد الدكتور ميدين بمنحة من الصندوق فتقول الأساسية ، وأيد السيد بالتازار Lucendo - فيلارين بواسطة Studenship دكتوراه MRC. وأيد الدكتور تشو بواسطة منحة من الحكومة الصينية.

Materials

Matrigel coating plates and flasks

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
  4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

  1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

  1. Confluent well or flask of hESCs.
  2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
  3. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
  6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  8. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
  10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  12. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

  1. Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
  8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
Primary antibodies
Antigen* Type Supplier Dilution
ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500
E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100
α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500
SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100
IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
  2. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
  4. Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
  5. Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
  6. Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
  7. Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
  8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
  9. Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics