अनुकूलित Mycoplasma के पीसीआर आधारित डिटेक्शन

Biology
 

Summary

Lookout Mycoplasma पीसीआर जांच किट पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), जो सेल संस्कृतियों और अन्य सेल जैव व्युत्पन्न संस्कृति में Mycoplasma, Acholeplasma और Ureaplasma संदूषण का पता लगाने के में उच्चतम संवेदनशीलता के लिए पसंद की विधि के रूप में स्थापित है का इस्तेमाल.

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Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

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Abstract

Protocol

1. Mycoplasma जांच

  1. सेल संस्कृति supernatants सीधे परीक्षण किया जा सकता है या एक बाद की तारीख में उपयोग के लिए नमूना तैयार कर सकते हैं. के लिए तैयार बाद में एक बाँझ प्रवर्धन ट्यूब और सेते में 95 में जगह सतह पर तैरनेवाला के 100 μl डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए उपयोग एक बार यह पूरा नमूना 2-8 ° सी में एक सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है. बस से पहले नमूना संक्षिप्त गोली (5 सेकंड) अपकेंद्रित्र किसी भी सेलुलर मलबे चलाने के लिए.
  2. पीसीआर के लिए नमूने तैयार करने के लिए, जम्पस्टार्ट Taq डीएनए पोलीमरेज़ / पुनर्जलीकरण प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक बफर की कुल मात्रा का निर्धारण. हम 5 कुल प्रतिक्रियाओं की तैयारी हो जाएगा. पांच प्रतिक्रियाओं Taq के 2.5μl और पुनर्जलीकरण बफर के 114.5μl की आवश्यकता होगी. यह एक इकाई के प्रति प्रतिक्रिया और नमूना प्रतिक्रिया और नकारात्मक से अधिक सकारात्मक नियंत्रण के लिए पुनर्जलीकरण बफर के 24.5μl नियंत्रण के प्रति पुनर्जलीकरण बफर के 22.5μl Taq के एक न्यूनतम में शामिल होंगे. प्रतिक्रिया प्रति डीएनए पोलीमरेज़ की 1 यूनिट पुनर्जलीकरण बफर का उचित मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए. यह प्रयोग किया जाता Taq के साथ अलग अलग होंगे.
  3. एक साफ microcentrifuge ट्यूब में Taq डीएनए पोलीमरेज़ की गणना मात्रा प्लेस और पुनर्जलीकरण बफर की गणना की मात्रा के साथ पालन करें. डीएनए बफर / पोलीमरेज़ पुनर्जलीकरण ट्यूब flicking द्वारा धीरे मिलाया जाना चाहिए. इस मिश्रण vortexed नहीं होना चाहिए.
  4. नकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए और नमूने पारदर्शी प्रतिक्रिया किट में दिए गए ट्यूबों का उपयोग करें. प्रतिक्रिया किट में प्रदान की ट्यूब को पहले से ही nuclueotides, प्राइमरों और आंतरिक नियंत्रण डीएनए होते हैं. जम्पस्टार्ट Taq डीएनए बफर पोलीमरेज़ पुनर्जलपूरण / मिश्रण, के रूप में पिछले चरणों में तैयार की 23 μl नकारात्मक नियंत्रण और नमूना ट्यूबों के प्रत्येक में रखा जाना चाहिए. नकारात्मक नियंत्रित करने के लिए डीएनए मुफ्त पानी के 2 μl जोड़ें और नमूना ट्यूब और लेबल के प्रत्येक नमूना के 2 μl जोड़ने. ट्यूबों flicking द्वारा सामग्री का मिश्रण. सामग्री vortexed नहीं होना चाहिए.
  5. तैयार करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण गुलाबी प्रतिक्रिया किट में प्रदान ट्यूबों का उपयोग करें. प्रतिक्रिया किट में प्रदान की ट्यूब को पहले से ही nuclueotides, प्राइमरों और आंतरिक नियंत्रण डीएनए होते हैं. प्रतिक्रिया ट्यूबों और लेबल के लिए जम्पस्टार्ट Taq डीएनए बफर / पोलीमरेज़ पुनर्जलपूरण मिश्रण के 25 μl, के रूप में पिछले चरणों में तैयार जोड़ें. ट्यूबों flicking द्वारा सामग्री का मिश्रण. सामग्री vortexed नहीं होना चाहिए. नकारात्मक नियंत्रण, सकारात्मक नियंत्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूना ट्यूबों सेते हैं.
  6. के लिए पीसीआर जगह लेने के लिए नमूने के लिए एक थर्मल cycler में रखा जाना चाहिए. जब जम्पस्टार्ट Taq का उपयोग कर एक सक्रियकरण कदम की आवश्यकता नहीं है. थर्मल cycler में प्रतिक्रिया ट्यूबों रखें. चक्र के रूप में सेट किया जाना चाहिए: 94 ° C 30 सेकंड के लिए, 55 ° सी के लिए 30 सेकंड और 40 सेकंड के लिए 72 ° सी. ये चक्र 40 बार चलाया जाएगा.
  7. एक बार पीसीआर चक्र पूरा कर लिया है नमूनों उन्हें थर्मल cycler से हटाने और उन्हें बर्फ में रखकर 4-8 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाना चाहिए. जब नमूने ठंडा है वे agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए पर लोड किया जाना चाहिए. लोड हो रहा है जेल और डाई के लिए आवश्यक के रूप में वे पहले से ही कर रहे हैं प्रतिक्रिया ट्यूबों में मौजूद नहीं हैं. सीधे प्रत्येक पीसीआर के लिए एक अलग लेन में 8 μl लोड. 3.0 सेमी - 2.5 के प्रवास के बाद वैद्युतकणसंचलन बंद करो.

2. प्रतिनिधि परिणाम

नकारात्मक नियंत्रण लगभग 481 बीपी पर एक बैंड दिखाने चाहिए. यह है कि वीडियो की शुरुआत में दिखाया गया है वैद्युतकणसंचलन जेल पर नकारात्मक नियंत्रण स्तंभ में देखा जा सकता है. 481 बीपी पर नकारात्मक नियंत्रण बैंड के अभाव में एक अच्छा संकेत है कि पोलीमरेज़ की गतिविधि sufficienttaq काफी संवेदनशील नहीं था नहीं था है.

Mycoplasma सकारात्मक नमूनों बैंड 270 की रेंज में ± 8 बीपी दिखाएगा. बैंड अत्यधिक प्रदूषित नमूनों के लिए भारी और हल्के ढंग से दूषित नमूने के लिए बेहोश हो जाएगा. तीव्रता में बदलाव वैद्युतकणसंचलन जेल पर सकारात्मक नमूना स्तंभों है कि वीडियो की शुरुआत में दिखाया गया है में देखा जा सकता है. सभी नमूनों को एक आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण को दिखाना है कि पीसीआर हुई उम्मीद के रूप में होते हैं. यह अत्यधिक प्रदूषित नमूनों पर आंतरिक नियंत्रण के अभाव देखने के लिए सामान्य है.

यदि सकारात्मक या नकारात्मक रेंज में अपने नमूना पर एक बैंड रेंज में एक बैंड नहीं है यह एक अच्छा संकेत है कि अपने नमूनों हिचकते हैं. यदि नमूना हिचकते है पीसीआर inhibitors एक डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन से हटाया जा सकता है है.

चित्रा 1
. चित्रा 1 प्रासंगिक Amplicon बैंड: पीसीआर द्वारा mycoplasma का पता लगाने के परिणाम दिखाए गए हैं. 2 लेन नकारात्मक नियंत्रण है, जो लगभग 481 बीपी पर एक बैंड दिखाने चाहिए. 481 बीपी पर नकारात्मक नियंत्रण बैंड के अभाव में एक अच्छा संकेत है कि Taq प्रयोग किया जाता काफी संवेदनशील नहीं था है. Mycoplasma सकारात्मक नमूने 270 की रेंज में बैंड दिखाने + 8 के रूप में 3 गलियों में दिखाया बीपी जाएगा - 6. बैंड hea जाएगाvy अत्यधिक प्रदूषित (6 लेन) नमूने और हल्के ढंग से दूषित नमूने (4 लेन) के लिए बेहोश के लिए. सभी नमूनों को एक आंतरिक नकारात्मक (481 बीपी) को नियंत्रित करने के लिए दिखाना है कि पीसीआर हुई उम्मीद के रूप में होते हैं. यह अत्यधिक प्रदूषित नमूनों पर आंतरिक नियंत्रण के अभाव देखने के लिए सामान्य है.

Discussion

किट की अति संवेदनशीलता की वजह से, जब सही ढंग से प्रदर्शन किट सटीक संकेत है चाहे या नहीं अपने नमूना mycoplasma संदूषण परिणाम उपज चाहिए. किट जम्पस्टार्ट Taq डीएनए पोलीमरेज़ के साथ प्रयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. अन्य taqs जब नमूनों की तैयारी में इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन 481 बीपी पर आंतरिक नियंत्रण बैंड वैकल्पिक Taq के समुचित संवेदनशीलता का संकेत मौजूद होना चाहिए. यह संभव है के लिए सकारात्मक बैंड विभिन्न संदूषण के स्तर पर निर्भर करता है घनत्व प्रदर्शन के लिए. यह भारी दूषित नमूनों पर आंतरिक नियंत्रण बैंड के अभाव का पालन करने के लिए संभव है. सतर्कता और उचित तकनीक का प्रयोग जब नमूने की तैयारी के लिए प्रदूषण को रोकने के उचित के लिए महत्वपूर्ण हैं. पता लगाने जब तलाश Mycoplasma पीसीआर जांच किट का उपयोग कर.

Disclosures

लेखकों सिग्मा Aldrich के कर्मचारियों है कि इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और उपकरणों का उत्पादन कर रहे हैं.

Acknowledgements

सिग्मा Aldrich द्वारा वित्त पोषित

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

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References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

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