Optimerad PCR-baserad detektion av Mycoplasma

Biology
 

Summary

Jakt Mycoplasma PCR Detection Kit utnyttjar polymeraskedjereaktion (PCR), som är etablerat som metod i valet för högsta känslighet för att upptäcka Mycoplasma, Acholeplasma och ureaplasma föroreningar i cellkulturer och andra cellodling härrör biologiska läkemedel.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Underhållet av smitta utan cellinjer är avgörande för cell-baserad forskning. Bland de största främmande oro är mykoplasma kontamination. Även om mykoplasma brukar inte dödar förorenade celler, de är svåra att upptäcka och kan orsaka en rad effekter på odlade celler, inklusive förändrad metabolism, saktade spridning och kromosomavvikelser. Kort sagt, kompromisser mykoplasma föroreningar värdet av dessa cellinjer för att ge tillförlitliga uppgifter för biovetenskaplig forskning.

Källorna av mykoplasma föroreningar i laboratoriet är väldigt utmanande att helt styra. Eftersom vissa mykoplasma arter finns på mänsklig hud, de kan införas genom dålig aseptisk teknik. Dessutom kan de komma från förorenade kosttillskott såsom fetalt bovinserum, och viktigast av andra förorenade cellkulturer. När mykoplasma förorenar en kultur, kan det spridas snabbt kan infektera andra delar av labbet. Strikt efterlevnad av god laboratoriesed såsom god aseptisk teknik är viktiga, och rutinprovning för mykoplasma rekommenderas starkt för framgångsrik kontroll av mykoplasma kontamination.

PCR-baserad detektion av mykoplasma har blivit en mycket populär metod för rutinmässigt cellinje underhåll. PCR-baserade metoder för upptäckt är mycket känsliga och kan ge snabba resultat, vilket ger forskare möjlighet att reagera snabbt att isolera och eliminera förorening när den upptäcks i jämförelse med den tid som krävs med hjälp av mikrobiologiska tekniker. Jakt Mycoplasma PCR Detection Kit är mycket känslig, med en detektionsgräns på endast 2 genomet per mikroliter. Med utnyttjande av de mycket speciella JumpStart Taq DNA-polymeras och en egen primer design, är falsklarm minskas kraftigt. Den bekväma 8-tube-formatet, hjälper band pre-belagda med dNTPs och tillhörande primer öka genomströmningen för att möta behoven hos kunder med större samlingar av cellinjer.

Med tanke på den extrema känslighet kit, måste stor försiktighet vidtas för att förhindra oavsiktlig kontaminering av prover och reagenser. Steg-för-steg-protokollet vi visar belyser försiktighetsåtgärder och praxis krävs för en tillförlitlig mykoplasma upptäckt. Vi visar också och diskuterar typiska resultat och deras tolkning. Vårt mål är att säkerställa framgång för forskare som använder LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

Protocol

1. Mycoplasma Detection

  1. Cellodling supernatanterna kan testas direkt eller provet kan förberedas för användning vid ett senare tillfälle. För att förbereda för senare bruk plats 100 ìl av supernatanten i ett sterilt förstärkning rör och inkubera vid 95 ° C i 5 minuter. När detta är klart provet kan förvaras vid 2-8 ° C i upp till en vecka. Strax innan du kör centrifugen prov kort (5 sekunder) till pellets någon cellulära skräp.
  2. För att förbereda prover för PCR, avgöra den totala volymen av Jumpstart Taq DNA-polymeras / rehydrering buffert som behövs för reaktioner. Vi kommer att förbereda 5 totalt reaktioner. Fem reaktioner kräver 2.5μl Taq och 114.5μl av rehydrering buffert. Denna kommer att innehålla minst en enhet av Taq per reaktion och 22.5μl av rehydrering buffert per prov reaktion och negativ kontroll samt 24.5μl av rehydrering buffert för den positiva kontrollen. 1 enhet av DNA-polymeras per reaktion bör läggas till lämplig volym av rehydrering buffert. Detta kommer att variera med den som används Taq.
  3. Placera den beräknade volymen av Taq DNA-polymeras till ett rent mikrocentrifugrör och följ med den beräknade volymen rehydrering buffert. Den DNA-polymeras / rehydrering buffert ska blandas försiktigt genom att ställa röret. Denna blandning bör inte vara vortexed.
  4. För att förbereda den negativa kontrollen och prover använda OH reaktionsrören ingår i kitet. Reaktionen rören i kitet innehåller redan nuclueotides, primers och intern kontroll DNA. 23 ìl av Jumpstart Taq DNA-polymeras / Rehydrering buffert mix, som utarbetats i föregående steg, bör placeras i varje negativa kontrollen, och provrör. Tillsätt 2 l DNA-fritt vatten för att den negativa kontrollen och tillsätt 2 l av provet med vart och ett av provrören och etiketten. Blanda innehållet genom att ställa rören. Innehållet bör inte vortexed.
  5. För att förbereda den positiva kontrollen Använd den rosa reaktionsrören ingår i kitet. Reaktionen rören i kitet innehåller redan nuclueotides, primers och intern kontroll DNA. Tillsätt 25 ìl Jumpstart Taq DNA-polymeras / Rehydrering buffert mix, som utarbetats i föregående steg, till reaktionsrören och etiketten. Blanda innehållet genom att ställa rören. Innehållet bör inte vortexed. Inkubera den negativa kontrollen, positiv kontroll och provrör vid rumstemperatur i 5 minuter.
  6. För PCR ske proverna måste placeras i en thermocykelapparat. När du använder JumpStart Taq en aktivering steg inte behövs. Placera reaktionsrören i apparaten. Cyklerna bör fastställas som följer: 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder och 72 ° C i 40 sekunder. Dessa cykler kommer att köras 40 gånger.
  7. När PCR-cykler har avslutat prov bör kylas till 4-8 ° C genom att ta bort dem från apparaten och placera dem i is. När prover har svalnat de ska lastas på agarosgel för elektrofores. Laddar gel och färgämnet är inte nödvändigt eftersom de redan finns i reaktionsrören. Direkt belastning 8 l för varje PCR i ett separat körfält. Stoppa elektrofores efter migreringen på 2,5 - 3,0 cm.

2. Representativa resultat

Den negativa kontrollen bör visa ett band vid ca 481 bp. Detta kan ses i den negativa kontrollen kolumnen på elektrofores gel som visas i början av videon. Frånvaron av den negativa kontrollen bandet på 481 bp är en bra indikator på att verksamheten i polymeras inte sufficienttaq användes inte var tillräckligt känslig.

Mycoplasma positiva prover kommer att visa banden i intervallet 270 ± 8 BP. Bandet kommer att vara tung för mycket förorenade prover och svag för lätt förorenade prover. De variationer i intensitet kan ses i den positiva prov kolumnerna på elektrofores gel som visas i början av videon. Alla prover innehåller en intern negativ kontroll för att visa att PCR inträffade som förväntat. Det är normalt att se avsaknaden av den interna kontrollen på starkt förorenade prover.

Om det inte finns ett band i den positiva område eller ett band i det negativa området på ditt prov här är en bra indikator på att dina prover är hämmade. Om provet är hämmade PCR-hämmare kan avlägsnas genom att utföra en DNA-extraktion.

Figur 1
. Figur 1 Relevanta Amplicon band: Resultat av att upptäcka mykoplasma med PCR visas. Körfält 2 är den negativa kontrollen, som bör visa ett band vid ca 481 bp. Frånvaron av den negativa kontrollen bandet på 481 bp är en bra indikator på att det Taq användes inte var tillräckligt känslig. Mycoplasma-positiva prov kommer att visa banden i intervallet 270 + 8 räntepunkter som visas i körfält 3 till 6. Bandet kommer att heaVY för mycket förorenade prover (Lane 6) och svag för lätt förorenade prover (Lane 4). Alla prover innehåller en intern negativ kontroll (481 BP) för att visa att PCR inträffade som förväntat. Det är normalt att se avsaknaden av den interna kontrollen på starkt förorenade prover.

Discussion

På grund av den extrema känslighet kit, när det utförs korrekt kitet ska ge exakta resultat som visar om ditt prov har mykoplasma kontamination. Satsen har optimerats för användning med JumpStart Taq DNA-polymeras. Andra taqs kan användas vid upprättandet av prover, men den interna kontrollen bandet på 481 bp bör vara närvarande och anger korrekt känslighet alternativa Taq. Det är möjligt för den positiva banden att ställa ut olika densiteter beroende på graden av förorening. Det är möjligt att observera avsaknaden av den interna kontrollen bandet på kraftigt förorenade prover. Använda försiktighet och god teknik vid beredning av de prover för att förhindra kontaminering är avgörande för korrekt. upptäckt när man använder LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

Disclosures

Författarna är anställda av Sigma-Aldrich som producerade reagenser och verktyg som används i denna artikel.

Acknowledgements

Finansieras av Sigma-Aldrich

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics