优化的基于PCR的检测支原体

Biology
 

Summary

在LookOut支原体PCR检测试剂盒采用聚合酶链反应(PCR),这是建立在培养的细胞和其他细胞培养派生生物制品的支原体,Acholeplasma,溶脲脲污染检测的灵敏度最高的首选方法。

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Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

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Abstract

维护无污染的细胞株的细胞为基础的研究是必不可少的。其中最大的污染物的关注是支原体污染。虽然支原体通常不杀死受污染的细胞,它们是难以察觉,并可能导致多种对体外培养的细胞,包括改变代谢的影响,减缓扩散和染色体畸变。总之,支原体污染损害这些细胞株的价值,为生命科学研究提供准确的数据。

在实验室中的支原体污染的来源是非常具有挑战性的完全控制。由于某些支原体种人的皮肤上发现,他们可以推出通过无菌操作技术差。此外,他们还可以来自污染的补充,如胎牛血清,最重要的是从其他污染的细胞培养。一旦支原体污染的文化,它可以迅速蔓延到其他地区的实验室污染。严格遵守良好实验室规范,如良好的无菌技术是关键,和常规支原体检测是非常成功的支原体污染的控制建议。

基于PCR检测支原体已成为一个非常流行的方法为例行的细胞株维护。基于PCR的检测方法是高度敏感,并能提供快速的结果,这使研究人员能够迅速做出反应,隔离和消除污染,一旦检测时间比较需要使用微生物技术。望风支原体PCR检测试剂盒是高度敏感的,用μL的基因组只有2%的检出限。非常具体的JumpStart的Taq DNA聚合酶和专有的引物设计的优势,大大降低了误报。方便的8管格式,带钢预涂与dNTPs,以及相关的引物有助于提高吞吐量,以满足客户的需求与细胞系的更大的集合。

鉴于该工具包的极端敏感性,必须采取非常谨慎,以防止不慎污染样品和试剂。一步一步的协议,我们将演示突出了可靠的支原体检测所需的预防措施和做法。我们还展示和讨论的典型成果和他们的解释。我们的目标是确保使用望风支原体PCR检测试剂盒的研究人员成功。

Protocol

1。支原体检测

  1. 细胞培养上清液可直接或测试样品可以准备在以后的日子使用。为了准备以后使用95℃,5分钟取上清液100μL在无菌的放大管和孵化一旦这是完整的样品可在2-8 ° C储存长达一个星期。之前运行样本简要地沉淀离心机(5秒)的任何​​细胞碎片。
  2. 要准备的样品进行PCR,确定总量的Jumpstart Taq DNA聚合酶/补液反应所需的缓冲区。我们将准备5总反应。五反应将需要的Taq2.5μl114.5μl补液缓冲区。这将包含最小的一个单位每补液每个样本反应为阳性对照和阴性对照加补液缓冲区24.5μl缓冲区的反应和22.5μl的Taq。应增加1个单位的每个反应的DNA聚合酶的补液缓冲区适当的音量。这会随所使用的Taq酶。
  3. 放入一个干净的离心管的Taq DNA聚合酶的计算量,并按照与补液缓冲区的计算量。 DNA聚合酶/补液缓冲区应轻轻弹管混合。这种混合物不应振荡。
  4. 为了准备阴性对照和样品,使用套件中提供透明的反应管。套件中提供的反应管中已经包含nuclueotides,引物和内部控制DNA。 23μL的Jumpstart的Taq DNA聚合酶/补液缓冲组合在前面的步骤准备,应放置在每一个阴性对照和样品管。加入2μLDNA自由水阴性对照和添加2μL的样品,每个样品管和标签。混合弹管的内容。内容不应该振荡。
  5. 为了准备阳性对照使用套件中提供的粉红色的反应管。套件中提供的反应管中已经包含nuclueotides,引物和内部控制DNA。添加25μLJumpstart的Taq DNA聚合酶/补液缓冲混合,准备在前面的步骤,反应管和标签。混合弹管的内容。内容不应该振荡。孵育阴性对照,阳性对照和样品管在室温下5分钟。
  6. 用于PCR检测中发生的样本被放置在一个热循环仪。当使用的JumpStart Taq酶的激活步骤不是必需的。将反应管,在热循环。周期应设置如下:94℃30秒,55 ° C时30秒和40秒72℃。这些周期都将被运行了40倍。
  7. PCR循环完成后的样品应冷却至4-8 ° C,从热循环中删除,并把他们在冰。样品冷却时,他们应该被加载到琼脂糖凝胶电泳。载入凝胶和染料是没有必要的,因为他们已经在反应管中。每个PCR直接加载到一个单独的车道8μL。停止电泳迁移后的2.5 - 3.0厘米。

2。代表性的成果

阴性对照应显示在约481 bp的一支乐队。这可以看作是在录像的开头显示的电泳阴性对照列。阴性对照带在481 bp的情况下,是一个很好的指标,没有sufficienttaq使用不够敏感的聚合酶的活性。

支原体阳性标本将显示在频带范围的270 ± 8 BP。乐队将是沉重的高度污染的样品,并为轻度污染样品的微弱。强度的变化可以看出,在电泳阳性标本是在录像的开头显示的列。所有样品中含有一个内部的阴性对照表明,PCR扩增发生如预期。高度污染的样本的内部控制的情况下是正常的。

如果没有在正数范围,或在你的样品上的负面范围带带,这是一个很好的指标,您的样品都有明显的抑制作用。如果样品是抑制PCR抑制剂进行DNA提取,可去除。

图1
相关扩增带图1:通过PCR检测支原体结果显示。 2巷是阴性对照,它应该显示在约481 bp的带。阴性对照带在481 bp的情况下,是一个很好的指标,TAQ使用不够敏感。支原体阳性标本将显示在270范围内的频段+ 8车道3 - 6所示的BP。乐队将被加热VY为高度污染样品(6车道)和轻污染样品(4车道)淡淡。所有样品中含有一个内部的阴性对照组(481 bp)的证明,如预期的PCR发生。高度污染的样本的内部控制的情况下是正常的。

Discussion

由于试剂盒的极端敏感性,当正确执行的套件应该会产生精确的结果,说明你的样品是否有支原体污染。该试剂盒已使用的JumpStart Taq DNA聚合酶的优化。其他taqs可能在准备样品时使用,但在481 bp的内部控制带应表明替代TAQ适当的灵敏度。为阳性条带很可能受污染的程度上表现出不同密度。它可以观察内部控制带的缺乏严重污染的样本。使用时的谨慎和适当的技术准备的样品,以防止污染是正确的关键。望风支原体PCR检测试剂盒检测时使用。

Disclosures

作者是Sigma - Aldrich公司的员工,生产的试剂和本文中使用的工具。

Acknowledgements

由Sigma - Aldrich公司

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

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References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

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