पार्श्व द्रव टक्कर: चूहों में अभिघातजन्य मस्तिष्क चोट के मॉडल

Neuroscience
 

Summary

पार्श्व द्रव (LFP) तालवाद्य, चूहों में अभिघातजन्य मस्तिष्क चोट की एक मॉडल की स्थापना, प्रदर्शन किया है. LFP पशु मॉडल के लिए तीन प्रमुख मापदंड को पूरा: वैधता, विश्वसनीयता, और नैदानिक ​​प्रासंगिकता. प्रक्रिया, शल्य चिकित्सा craniotomy से मिलकर हब के निर्धारण चोट के शामिल द्वारा पीछा किया, फोकल और फैलाना चोटों में जिसके परिणामस्वरूप में वर्णित है.

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Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063, doi:10.3791/3063 (2011).

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Abstract

Protocol

1. Craniectomy

  1. एक बाँझ शल्य साइट एक माउस गैस संज्ञाहरण सिर (Kopf उपकरण) धारक हे फ्लश 2 (Parkland वैज्ञानिक) के साथ एक संज्ञाहरण मशीन से जुड़ा के साथ चूहों के लिए एक stereotaxic संरेखण साधन (Kopf उपकरण) सहित तैयार करने के लिए सर्जरी के दौरान isoflurane के सतत साँस लेना के लिए अनुमति . एक वार्मिंग पैड 37 पर रखा डिग्री सेल्सियस माउस के तहत सर्जरी के दौरान तैनात है. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप और प्रकाश स्रोत की जरूरत है. experimenter एक प्रयोगशाला कोट, सर्जिकल मास्क, पैर को कवर, दस्ताने, और सिर को कवर पहनना चाहिए. सभी उपकरण और सामग्री है कि शल्य साइट से संपर्क करें निष्फल होना चाहिए.
  2. एक चोट हब, एक Luer - लोक के महिला के अंत में शामिल है, 20 1 ग्राम के अंत धातु काटने साढ़े एक धार के साथ "(Becton Dickinson) सुई हब एक मामूली पूर्वाग्रह के साथ कटौती की जानी चाहिए और के द्वारा बनाई गई है एक लगभग 3mm भीतरी व्यास खोलने है. trephine (1.10 कदम देखें) को मापने के लिए और सही व्यास की एक चोट हब बनाना इस्तेमाल किया जा सकता है एक हब जानवर प्रति की आवश्यकता है. हब खोपड़ी करने के लिए संलग्न किया जाएगा और LFP से जुड़े. युक्ति देने के लिए दबाव की नब्ज.
  3. ठोस नायलॉन की रस्सी (1.7 मिमी व्यास, जैसे घास trimmer लाइन) ~ 1 मिमी मोटी धार का उपयोग डिस्क में कटौती की है. फिर, एक डिस्क जानवर प्रति की आवश्यकता है. यह trephine स्थिर जबकि craniectomy प्रदर्शन (1.10 कदम देखें) के लिए प्रयोग किया जाता है.
  4. चूहे किसी भी तनाव और उम्र (- 9 महीने हम मुख्य रूप से C57BL / 6 1 उम्र का उपयोग करें) के किया जा सकता है. माउस तौला है और कम से कम 1 मिनट के लिए एक छोटे से प्रेरण कक्ष में (100% 2 हे में 4-5 isoflurane% के साथ पहले से भरे) anesthetized. रिक्तिपूर्व analgesia के लिए, buprenorphrine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) का एक इंजेक्शन intraperitoneally दिया जाता है और माउस वापस एक मिनट के लिए चेंबर में रखा गया है. एनाल्जेसिक आहार स्थानीय पशु का उपयोग और देखभाल समिति के साथ परामर्श से पुष्टि की जानी चाहिए.
  5. है माउस के सिर के शीर्ष पर बाल संभव के रूप में त्वचा के करीब के रूप में छंटनी की है. माउस के एक stereotaxic संरेखण काटने वाष्पशील गैस संज्ञाहरण (Kopf उपकरण) प्रशासन के लिए बनाया गया चढ़ाया के साथ फिट लिखत में तैनात है. isoflurane गैस के स्तर 2% करने के लिए या प्रभाव के लिए कम है. श्वास दर नेत्रहीन सर्जरी के दौरान नजर रखी है. रक्त गैसों के रूप में अन्य शारीरिक मापदंड (पी 2 हे, पी सीओ 2), रक्त पीएच या रक्तचाप की प्रक्रिया के दौरान उपयुक्त उपकरणों का उपयोग करके मापा जा सकता है.
  6. कृत्रिम आँसू चिकनाई आंख मरहम कपास applicator का उपयोग करने के लिए सुखाने से उन्हें रखने के माउस की आँखों पर डाल दिया है. Povidone आयोडीन एक कपास 70% शराब के बाद applicator के साथ आंखों और गर्दन के बीच की त्वचा के लिए लागू किया जाता है. povidone आयोडीन और शराब के आवेदन 3 बार के एक कुल के लिए दोहराया है.
  7. एक midline खोपड़ी चीरा आँखों से गर्दन करने के लिए किया जाता है (# 15 ब्लेड) स्केलपेल और त्वचा के एक छोटे से बुलडॉग clamps के साथ मुकर (ललित विज्ञान उपकरण 18050-28 #) का उपयोग करने के लिए खोपड़ी को बेनकाब और एक स्पष्ट शल्य चिकित्सा क्षेत्र प्रदान. बुलडॉग clamps खोपड़ी के पार्श्व किनारों से लटका.
  8. सामयिक संवेदनाहारी bupivacaine (खारा में 0.025%) एक कपास applicator और प्रावरणी खोपड़ी से दंत चिकित्सा उपकरण या हड्डी खुरचनी (उदाहरण के लिए, ठीक विज्ञान उपकरण, # 10075-16) के टिप के साथ scraped है के साथ खोपड़ी के लिए लागू किया जाता है.
  9. एक स्थायी मार्कर bregma और लैम्ब्डा के बीच आधे रास्ते और बाण के समान है और दाएँ गोलार्द्ध (~ 2 midline के सही मिमी) से अधिक पार्श्व रिज सीवन के बीच खोपड़ी के निशान के लिए प्रयोग किया जाता है. लॉकटाइट cyanoacrylate गोंद (लॉकटाइट तक पाक 454) की एक बूंद एक प्लास्टिक में डाल दिया है वजन नाव और साइड लोभी संदंश (ललित विज्ञान उपकरण, Dumont # 6) में घास ठोस नायलॉन की रस्सी के एक डिस्क (1.3 ऊपर देखें) डुबकी किया गोंद और फिर खोपड़ी पर निशान पर डिस्क दबाएँ. लॉकटाइट गतिवर्धक की एक से दो बूँदें एक 1ml सिरिंज और 26 3 / 8 जी सुई का उपयोग करने के लिए गोंद का सख्त कारण डिस्क के शीर्ष पर दिया है. टेस्ट डिस्क की खोपड़ी के लिए आगे बढ़ने से पहले पालन.
  10. डिस्क पर एक 3 मिमी बाहरी व्यास trephine (रिसर्च इंस्ट्रुमेंटेशन शॉप, पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय) प्लेस और दक्षिणावर्त स्पिन जब तक आप खोपड़ी के माध्यम से काट दिया है. बहुत दूर खोपड़ी और उल्लंघन dura में ड्रिलिंग से बचने trephine प्रगति अक्सर जाँच करें. वहाँ हो जाएगा खोपड़ी और प्रालंब डिस्क की परिधि के आसपास खोपड़ी के thinning एक ढीला लगता है जब हल्के से दबाया जाएगा. दंत चिकित्सा उपकरण समानांतर / खोपड़ी की सतह क्षैतिज खोपड़ी के तहत जिज्ञासा और हड्डी प्रालंब उठा रखें. संदंश के साथ खोपड़ी से हड्डी अलग. यदि खून बह रहा का एक छोटा सा dura के समझौता किए बिना, राशि है, एक कपास applicator का उपयोग करें जब तक खून बह रहा बंद हो जाता है और dura पर हो रहा से हड्डी धूल को रोकने के लिए दबाव लागू. हालांकि, अगर वहाँ dura में एक उल्लंघन है ऐसी है कि हर्नियेशन दिखाई है, पशु मानवीय इच्छामृत्यु द्वारा प्रयोग से समाप्त किया जाना चाहिए. इस कदम पर्याप्त अभ्यास की आवश्यकता हैशल्य चिकित्सा आवश्यक कौशल प्राप्त करने के लिए.
  11. संदंश का प्रयोग, खोपड़ी में craniectomy से अधिक की स्थिति में चोट हब बनाए रखने इतना है कि हब के पूर्वाग्रह खोपड़ी (अर्थात् हब की अब बढ़त खोपड़ी के पार्श्व रिज के पास स्थित है) की वक्रता के साथ गठबंधन किया है. इस बीच, एक लकड़ी की छड़ी, एक धार के साथ एक कोण में कटौती के लिए एक तेज टिप है का उपयोग कर, हब के बाहर किनारों के आसपास विपरीत हाथ के साथ सुपर गोंद जेल और लागू हब स्थिर जब तक यह ईमानदार छेद पर चिपका है. केयर dura के शीर्ष पर गोंद नहीं मिल लिया जाना चाहिए. Dura पर गोंद की चोट के एक क्षीणन का कारण होगा.
  12. एक छोटे से कागज कप का प्रयोग, मिथाइल methacrylate दंत ऐक्रेलिक (जेट पेर्म / reline मरम्मत राल, बटलर Schein के साथ तरल एक्रिलिक) का मिश्रण करने के लिए एक चिपचिपा समाधान बनाने के लिए. कोई सुई चोट हब के आसपास सीमेंट लागू करने के लिए संलग्न के साथ एक 1 सीसी सिरिंज का प्रयोग करें. सीमेंट चोट हब के नीचे 2 मिमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आसपास के उजागर खोपड़ी को कवर किया जाना चाहिए. खोपड़ी sutures के सीमेंट के साथ सील कर रहे हैं करने के लिए सुनिश्चित करें कि चोट से तरल पदार्थ सांस में कपाल गुहा के भीतर रहता है.
  13. बाँझ 0.9% (खारा) NaCl एक सिरिंज और पा सुई का उपयोग कर के साथ हब भरें. खारा वसूली चरण के दौरान dura नम रखना होगा. इसके अलावा, अगर चोट हब भरा रहने नहीं करता है, कि खोपड़ी हब के लिए कनेक्शन में एक दरार से संकेत मिलता है और एक नया हब संलग्न किया जाना चाहिए. माउस 0.25 बाँझ खारा IP मिलीलीटर इंजेक्शन, stereotaxic संरेखण साधन से हटा दिया और एक वार्मिंग प्लेट पर कोई तार बार ढक्कन के साथ एक खाली पिंजरे में रखा दिया जाना चाहिए. पिंजरे के तल पर कुछ hydragel प्लेस और चूहों को 1-2 घंटे के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं.

2. चोट की प्रेरण

  1. (Tektronix टीडीएस 1001B, दो चैनल Digi संग्रहण आस्टसीलस्कप 40 मेगाहर्ट्ज, 500Ms.s) आस्टसीलस्कप और प्रवर्धक (ट्रामा inducer दबाव ट्रांन्सड्यूसर प्रवर्धक) LFP डिवाइस से जुड़ा है पर मुड़ें. पुष्टि करें कि LFP (कस्टम डिजाइन और निर्माण कार्य, वर्जीनिया कॉमनवेल्थ विश्वविद्यालय) डिवाइस और उच्च दबाव (41cm लंबाई, 2ml मात्रा, बैक्सटर 2C5643 #) टयूबिंग इससे जुड़े बाँझ पानी से भर रहे हैं और हवा के बुलबुले के मुक्त. टयूबिंग के अंत में एक पुरुष Luer लोक टुकड़ा है. Luer लोक टयूबिंग के अंत के साथ बंद, पेंडुलम को रिहा द्वारा परीक्षण दालों उद्धार. डिवाइस लगभग 10 परीक्षण दालों पहुंचाने द्वारा primed किया जाना चाहिए. पुष्टि करें कि पेंडुलम आस्टसीलस्कप और प्रवर्धक पर चिकनी संकेत देता है. एक शोर संकेत है कि चोट पल्स पहुंचाने के लिए पहले से हटाया जाना चाहिए प्रणाली में हवा को इंगित करता है. नाड़ी की अवधि के बारे में 20 मिसे होना चाहिए. transducer LFP डिवाइस के साथ आपूर्ति प्रवर्धक calibrated है जैसे कि 10 mV = 1.0 वर्ग इंच प्रति पाउंड (साई). एक वातावरण (एटीएम) = 14.7 साई. 2.1 वायुमंडल पलटा बार और एक बढ़ती हुई फुफ्फुसीय edema के साथ जुड़े मृत्यु दर को ठीक करने की एक श्रृंखला का उत्पादन - चोट दिया दबाव 0.9 की रेंज में आम तौर पर कर रहे हैं. 4 मिनट और एक 0 - 5% मृत्यु दर हल्के चोट 2 के एक ठीक पलटा समय माना जाता है. 10 मिनट और एक 10 - 20% मृत्यु दर मॉडरेट चोट 6 की एक ठीक पलटा समय माना जाता है. यदि आवश्यक हो, को बढ़ाने या नाड़ी की तीव्रता कम पेंडुलम के कोण समायोजित करें. पेंडुलम की शुरू की स्थिति के कोण लगभग 10 डिग्री है. LFP डिवाइस का समायोजन करने के बाद, Luer लोक टयूबिंग की अंत खोलने के लिए सुनिश्चित हो.
  2. माउस संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान तक पहुँच जाता है जब तक 4-5% isoflurane संज्ञाहरण कक्ष (पूर्व चार्ज) में रखा गया है. माउस LFP डिवाइस के लिए अगले मंच पर रखा है और हब बाँझ खारा से भरा है. LFP डिवाइस के एक पुरुष Luer - लोक के साथ टयूबिंग हब के महिला Luer लोक फिटिंग से जुड़ी है. जानवर अपने पक्ष और एक बार एक सामान्य श्वास पैटर्न शुरू पर रखा है, लेकिन पहले पूरा चेतना (~ 2 मिनट) फिर पशु LFP डिवाइस के पेंडुलम चोट की एक नाड़ी के कारण जारी है. यह महत्वपूर्ण है को चोट प्रेरित नहीं है, जबकि जानवर भी anesthetized है के रूप में यह श्वसन विफलता और मौत का कारण बन सकता है. नाड़ी की सटीक दबाव दर्ज किया जाना चाहिए. रिहाई का, नकली पशुओं वास्तविक तरल पदार्थ को चोट प्रेरित नाड़ी के अपवाद के साथ एक ही प्रक्रियाओं के सभी से गुजरना.
  3. जानवर LFP डिवाइस से तुरंत हटाया जाना चाहिए और ठीक पलटा समय की निगरानी के लिए अपनी पीठ पर रखा. बाद माउस ही righted है, यह तो संक्षेप anesthetized है और फिर सीमेंट हब और खोपड़ी से एक साथ हाथ से हटा दिया. खोपड़ी तो Vetbond ऊतक चिपकने वाला (3M), सीवन या स्टेपल के साथ बंद कर दिया है. Dura या हब के रोड़ा कोई हर्नियेशन उल्लेख किया है. एक occluded हब अज्ञात परिमाण के एक तनु चोट का उत्पादन होगा. पशु वापस एक वार्मिंग पैड पर पिंजरे में रखा जाता है जब तक चल और फिर लौटे अपने घर पिंजरे.

3. मोटर, संज्ञानात्मक और histological परिणामों का आकलन

  1. मोटो LFP की वजह से घाटा rotarod परीक्षण, एकीकृत vestibulomotor और ज्ञानेन्द्रिय समारोह में 21 के एक सूचक का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है . सभी जानवरों की चोट के पहले परीक्षण किया जाना चाहिए करने के लिए एक आधारभूत पढ़ने का निर्धारण और प्रतिमान के लिए चूहों acclimate. चूहे rotarod डिवाइस पर प्रशिक्षित कर रहे हैं चोट करने के लिए पहले दो दिनों के लिए 1 घंटे intertrial अंतराल के साथ प्रति दिन तीन बार. एक 36 मिमी बाहरी व्यास, rotating रॉड, जो एक रबर की सतह पर संतुलन विलंबता मापा जाता है. वेग 180 सेकंड अंतराल पर 4 से 40 rpm से बढ़ जाती है. प्रत्येक परीक्षण समाप्त होता है जब पशु बंद rotarod गिरता.
  2. चोट (आमतौर पर 1, 7 और 21 दिन) के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर, चूहों फिर rotarod डिवाइस पर परीक्षण कर रहे हैं. चोट के बाद rotarod परीक्षण का मूल्यांकन उनके आधारभूत 22 latencies के सापेक्ष व्यक्तिगत स्कोर पर आधारित है. औसत विलंबता घायल चूहों के गिर नकली चूहों की तुलना में है.
  3. संज्ञानात्मक समारोह निम्नलिखित LFP मॉरिस जल (MWM) भूलभुलैया, posttraumatic 23 कृन्तकों में स्थानिक सीखने और काम स्मृति के एक संवेदनशील उपाय का प्रयोग चूहों का एक अलग सेट पर परीक्षण किया जा सकता है. चूहे प्रतिमान को आदत कर रहे हैं और आधारभूत चोट करने के लिए 4 दिन पहले एक दृश्य मंच परीक्षण का उपयोग कर प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण किया गया. एक सफेद परिपत्र पूल (1 मीटर व्यास) पानी और गैर विषैले सफेद रंग से भरा है. मंच दिखाई दिया है एक झंडा या मार्कर और कोई दृश्य cues का उपयोग कर दीवारों पर हैं. 4 परीक्षण में, माउस दिखाई मंच के विपरीत वृत्त का चतुर्थ भाग में रखा जाता है, और विलंबता करने के लिए मंच मिल मापा जाता है. अधिकतम परीक्षण समय 60 सेकंड है और माउस रहता है या 15 सेकंड के लिए प्रत्येक परीक्षण के अंत में मंच पर रखा. intertrial अंतराल 5 मिनट के दौरान जो माउस एक हीटिंग पैड पर गरम है. मंच प्रत्येक परीक्षण के लिए एक अलग वृत्त का चतुर्थ भाग के लिए ले जाया जाता है और चार परीक्षण प्रदर्शन कर रहे हैं.
  4. सीखने का आकलन करने के लिए, चूहों MWM एक छिपा चोट (आमतौर पर 1, 7 और 21 दिन) के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर 4 quadrants में तय मंच का उपयोग कर प्रशिक्षित किया जाता है. काले और सफेद cues दीवारों पर रखा जाता है. वृत्त का चतुर्थ भाग है जो में माउस रखा गया है pseudorandomly प्रशिक्षण और समय का पता लगाने के मंच दर्ज की गई है भर में विविध है. अधिकतम परीक्षण समय 60 सेकंड है और माउस रहता है या 15 सेकंड के लिए मंच पर रखा है और परीक्षण के बीच 5 मिनट के लिए गरम. चूहे लगातार 3 दिन के लिए दिन / 8 परीक्षणों के अधीन हैं. स्मृति बनाए रखने का आकलन करने के लिए, एक 60 सेकंड जांच परीक्षण के लिए जानवरों दिन अधीन हैं पिछले प्रशिक्षण के बाद. जांच परीक्षण के दौरान मंच के लिए समय बिताया है और जहां मंच करने के लिए इस्तेमाल किया जा वृत्त का चतुर्थ भाग में दूरी swum निर्धारित करने के लिए निकाल दिया जाता है. अंत में, एक दृश्य मंच परीक्षण संभव मोटर और दृश्य घाटे है कि चोट के बाद विकसित शासन किया है.
  5. LFP चोट के histological परिणाम का निर्धारण करने के लिए, ऊतक 0.9% में intracardial छिड़काव द्वारा तय हो गई है NaCl चोट के बाद वांछित समय बिंदुओं पर 4% paraformaldehyde द्वारा पीछा किया. ऊतक रातोंरात 4 पर postfixed · सी और फिर 10% में cryoprotected और 30% sucrose और एम्बेडिंग समाधान. जमे हुए धारावाहिक वर्गों cryostat पर काट रहे हैं और विभिन्न immuohistochemical और histological तकनीक का उपयोग संसाधित.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

LFP डिवाइस के द्वारा प्रेरित चोट पर्याप्त शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण के साथ विशेष रूप से, जानवर से जानवर के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. चोट की निरंतरता को बनाए रखने के लिए, डिवाइस के द्वारा dura दिया दबाव की राशि पर नजर रखी है. पेंडुलम एक पानी से भरे उच्च दबाव टयूबिंग और Luer - लोक फिटिंग जो चोट जानवर पर craniectomy साइट (चित्रा 1 ए) के लिए चिपका हब से जुड़ा है के साथ ऐक्रेलिक सिलेंडर हमलों . 2.1 एटीएम और एक आस्टसीलस्कप के लिए एक एम्पलीफायर से जुड़ा दबाव पल्स (चित्रा 1 बी) कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है - करने के लिए एक उदारवादी हल्के चोट के लिए, पेंडुलम के कोण के लिए एक 0.9 से लेकर दबाव उत्पन्न सेट कर दिया जाता है. चोट पलटा बार और एक बढ़ती हुई फुफ्फुसीय edema के साथ जुड़े मृत्यु दर को ठीक की एक श्रृंखला का उत्पादन. 4 मिनट और एक 0 - 5% मृत्यु दर हल्के चोट 2 के एक ठीक पलटा समय माना जाता है. 10 मिनट और एक 10 - 20% मृत्यु दर मॉडरेट चोट 6 की एक ठीक पलटा समय माना जाता है. इसके अलावा, LFP के अधीन चूहों टॉनिक तेवर कि जब्ती का संकेत हो सकता है प्रदर्शन कर सकते हैं. जब्ती अक्सर एक समझौता dura के साथ जुड़ा हुआ है. साथ में, इन निष्कर्षों को सुझाव है कि चोट स्नायविक नुकसान के कारण है. शाम जानवरों LFP डिवाइस से जुड़े हैं लेकिन पेंडुलम जारी नहीं किया है.

LFP द्वारा प्रेरित क्षति कल्पना करने के लिए, हम immunocytochemistry प्रदर्शन किया है एंटीबॉडी जो astrocytes और मैक्रोफेज जो दोनों के सेल प्रकार के होते हैं चोट करने के लिए एक प्रतिक्रिया के साथ जुड़े पहचान का उपयोग. Glial Fibrillary अम्लीय प्रोटीन धुंधला (GFAP) क चोट के क्षेत्र में प्रांतस्था भर में वृद्धि हुई gliosis से पता चलता हैereas नकली चूहों craniectomy नीचे बराबर साइट (चित्र 2A, बी) में वृद्धि हुई astrocytosis प्रदर्शित नहीं करते हैं. इसी तरह, MAC1 धुंधला अधिक नकली सर्जरी के अधीन चूहों की तुलना में चोट के स्थल के आसपास मैक्रोफेज को दर्शाता है. इसके अलावा, वहाँ अक्सर शारीरिक cortical नहीं बल्कि नकली चूहों (चित्रा -2 सी, डी) में LFP के अधीन चूहों में दिखाई ऊतक को नुकसान है.

हल्के LFP निम्नलिखित व्यवहार परीक्षण दोनों संज्ञानात्मक और मोटर परिणामों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. MWM करने के लिए सीखने और स्मृति पर प्रभाव को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. परीक्षण कमरे में दृश्य cues का उपयोग करना, नकली चूहों तेजी से पानी की भूलभुलैया में प्रशिक्षण के प्रत्येक बाद के दिन के साथ मंच का पता लगाने में अधिक कुशल हो गया. हल्के LFP के अधीन चूहे अब लेने के लिए नकली चूहों के सापेक्ष परीक्षण के पहले दो दिनों पर छिपा मंच का पता लगाने, लेकिन फिर तीसरे दिन (चित्रा 3A) के द्वारा कार्य जानने दिखाई. ये निष्कर्ष बताते हैं कि चोट दर जिस पर चूहों स्थानिक सीखने प्राप्त कर सकते हैं कम कर देता है. 1 दिन स्मृति प्रतिधारण पर चोट के प्रभाव को निर्धारित करने, एक जांच परीक्षण अंतिम प्रशिक्षण सत्र के बाद किया जाता है. शाम चूहों हल्के LFP सुझाव है कि चोट चूहों की क्षमता प्रभावित है जहां मंच करने के लिए रहते हैं (चित्रा 3B) का प्रयोग का स्थान याद करने के लिए अधीन चूहों की तुलना में लक्ष्य चक्र में अधिक समय खर्च करते हैं. हरकत समारोह का आकलन करने के लिए, चूहों rotarod डिवाइस पर परीक्षण कर रहे हैं. हल्के LFP के अधीन चूहे कम औसत विलंबता 1, 7 और 21 दिनों के बाद चोट (डीपीआई) (चित्रा 3C) में नकली चूहों की तुलना में गिरावट है . ये आंकड़े बताते हैं कि घायल चूहों एकीकृत vestibulomotor और ज्ञानेन्द्रिय समारोह बिगड़ा है.

चित्रा 1
चित्रा 1. LFP डिवाइस और चोट के दौरान प्राप्त आस्टसीलस्कप से एक प्रतिनिधि ट्रेस. ए) LFP डिवाइस के घटक हैं: पेंडुलम एक वांछित बल, एक उच्च दबाव टयूबिंग और एक पुरुष Luer लोक संलग्न फिटिंग, एक एम्पलीफायर के साथ ऐक्रेलिक सिलेंडर भरा पानी देने के लिए पूर्व निर्धारित कोण पर एक स्टैंड और सेट करने के लिए तय, और एक आस्टसीलस्कप. बी) के दबाव नाड़ी की आस्टसीलस्कप से प्रतिनिधि ट्रेस. चोटी पीक मूल्य 2.16 वोल्ट 1.47 एटीएम का एक दबाव का संकेत है.

चित्रा 2
चित्रा 2. बढ़ी gliosis और निम्नलिखित LFP एक भड़काऊ प्रतिक्रिया चोट की हद तक को दर्शाता है. एक नकली (ए, सी) सर्जरी या LFP (बी डी) चोट 7 दिनों पोस्ट चोट (डीपीआई) के अधीन माउस के मस्तिष्क के माध्यम से जमे हुए अनुप्रस्थ वर्गों (20μm). Cortical छवियों craniectomy के उपरिकेंद्र पर लिया जाता है. (ए, बी) ऊतक astrocytes पहचान एंटीबॉडी के साथ दाग है. Glial Fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) एंटीबॉडी (MAB360, Chemicon, 1:400) LFP नकली सर्जरी की तुलना में चोट (तीर) के अधीन माउस के प्रांतस्था भर astrocytes के एक उच्च संख्या से पता चलता है. माध्यमिक एंटीबॉडी 594 विरोधी माउस (1:1000) बकरी है. (सी. डी) ऊतक मैक्रोफेज पहचान एंटीबॉडी के साथ दाग है. MAC1 एंटीबॉडी (श्रृंखला MAC1 अल्फा CD11b, बी.डी. बायोसाइंसेज, 01:50) प्रांतस्था (तीर) में चोट के स्थल के आसपास और अधिक macrophges और / या सक्रिय microglia नकली सर्जरी की तुलना में पता चलता है. माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी CY3 चूहा (01:50) है. स्केल बार = सी और डी में ए और बी 100μm, में 200μm

चित्रा 3
चित्रा 3 हल्के LFP निम्नलिखित व्यवहार परीक्षण घायल घाटे नकली चूहों की तुलना दर्शाता है . ए) हल्के LFP के अधीन चूहे अब लेने के लिए नकली चूहों की तुलना में MWM में मंच ढूँढने के लिए कार्य सीख. शाम बनाम LFP (एवेन्यू सेकंड ± SEM) 1 दिन 34.21 ± 3.02 बनाम 38.64 ± 2.63, 2 दिन 24.52 ± 2.84 बनाम 27.21 ± 2.11, 3 दिन 22.47 ± 2.00 बनाम 22.08 ± 2.52 (1 डीपीआई, n = 9 नकली, 10 LFP) . बी) MWM सापेक्ष में पिछले नकली चूहों (21 डीपीआई n = 10) के लिए प्रशिक्षण के बाद हल्के LFP के अधीन चूहे लक्ष्य चक्र में जांच परीक्षण 24 घंटे के दौरान कम समय खर्च करते हैं. सी) हल्के LFP के अधीन चूहे rotarod डिवाइस बंद जल्दी गिर नकली चूहों की तुलना में (1, 7, और 21 dpi है, n = 5 नकली, 8 LFP). त्रुटि सलाखों एसई का प्रतिनिधित्व करते हैं.

Discussion

LFP विधि यहाँ प्रस्तुत neuropathalogical और व्यवहार परिणामों के कई मॉडल के लिए अभिघातजन्य मस्तिष्क चोट है जिसका कारण है कि यह एक व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता TBI के पशु मॉडल बन गया है उदारवादी हल्के वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम करने के क्रम में इस तकनीक की वैधता और विश्वसनीयता में वृद्धि पर विचार कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि केवल जानवरों जिसमें craniectomy दौरान dura की अखंडता से समझौता नहीं किया है LFP के अधीन हो सकता है और अध्ययन में प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, अगर craniectomy किसी भी गोंद या सीमेंट द्वारा occluded है craniectomy नीचे ऐसे dura के उस भाग तरल दबाव के बल को उजागर नहीं है, पशु अध्ययन से समाप्त किया जाना चाहिए. अंत में, अगर ठीक पलटा समय या मृत्यु दर वांछित सीमा के भीतर नहीं है, पशु अध्ययन में शामिल नहीं करना चाहिए. दबाव नाड़ी की तीव्रता और अधिक गंभीर चोटों उत्पन्न करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, LFP डिवाइस के विन्यास अपेक्षाकृत सरल है और चोट की डिग्री के reproducibility आस्टसीलस्कप पर दबाव की निगरानी वायुमंडल द्वारा बनाए रखा है. आस्टसीलस्कप का पता लगाने पर वक्र चिकनी आकार इंगित करता है कि तरल पदार्थ है कि LFP चोट की प्रेरण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है में कोई हवाई बुलबुले हैं. चोट उत्प्रेरण के लिए एक परीक्षण पल्स पहले वितरित करना चाहिए और अगर आस्टसीलस्कप ट्रेस एक चिकनी वक्र प्रदर्शन नहीं करता है, हवा बुलबुले हटाया जाना चाहिए. नाड़ी की अवधि लगभग 20 मिसे जो प्रेरण क्रैश टेस्ट सिमुलेशन में मापा समय का प्रतिनिधित्व करता है. कम दालों के चोट लगने की घटनाएं अधिक फोकल चोटों के उत्पादन की संभावना है. इसलिए, नाड़ी मॉडल की इस अवधि के TBI के मानव.

LFP निम्नलिखित morphological और सेलुलर परिवर्तन के रूप में अच्छी तरह के रूप में astrocytes और मैक्रोफेज के रूप में चित्रा 2 में प्रदर्शन की संख्या में वृद्धि के ऊतकों को शारीरिक क्षति शामिल हैं. यह अच्छी तरह से स्थापित है कि चोट की बानगी के संकेत astrocytes के hyperplasia और एक glial निशान के गठन है. glial निशान दोनों लाभकारी और हानिकारक 24 प्रभाव है दिखाया गया है. इसी तरह, मैक्रोफेज चरण चोट के बाद के दौरान विभिन्न ऊतकों में जमा है जब चिकित्सा की प्रक्रिया 25 शुरू होता है के लिए जाना जाता है. इस प्रकार LFP नकली नियंत्रण के लिए रिश्तेदार नमूने में GFAP और MAC1 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि चोट की प्रेरण का संकेत है. नकली नियंत्रण में उन सेल विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति की कमी को इंगित करता है कि शल्य चिकित्सा अकेले जोड़तोड़ मस्तिष्क के ऊतकों के स्वास्थ्य पर नकारात्मक परिणाम और प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन चोट प्रतिमान के लिए विशिष्ट हैं नहीं है.

हल्के चित्रा 3 में सचित्र LFP के व्यवहार परिणामों संज्ञानात्मक और मोटर घाटे में शामिल हैं. MWM नतीजों से संकेत मिलता है कि LFP चूहों अंततः कार्य लेकिन नकली चूहों की तुलना में धीमी दर में और जानने के लिए वे प्रशिक्षण के बाद एक दिन के रूप में अच्छी तरह से काम याद नहीं. इस प्रकार, भी हल्का घायल चूहों बाहरी cues का उपयोग प्रक्रिया, मजबूत, और स्थानिक जानकारी है, जो बाद में परीक्षण के दौरान पुनः प्राप्त किया जाना चाहिए की दुकान पर नकली चूहों की तुलना में कम कुशल हैं. वातानुकूलित डर प्रतिक्रिया के रूप में अन्य hippocampal निर्भर संज्ञानात्मक कार्य के लिए 26 LFP के अधीन चूहों में प्रभावित हो दिखाया गया है . अंत में, कम विलंबता LFP नकली चूहों के सापेक्ष चूहों द्वारा rotarod प्रतिमान में गिर करने के लिए हल्के चोट के बाद 3 सप्ताह के लिए एकीकृत vestibulomotor और ज्ञानेन्द्रिय समारोह में घाटे का एक संकेतक है. एक और अधिक उदार चोट संज्ञानात्मक और मोटर समारोह में अधिक हड़ताली परिवर्तन प्रकट रूप में 27-30 अन्य समूहों द्वारा दिखाया गया है .

संक्षेप में, LFP मानव TBI के लिए एक वैध मॉडल है क्योंकि यह अपेक्षित मानदंडों के कई पूरा है. LFP निर्माण वैधता प्रदान करता है कि यह etiological प्रक्रियाओं है कि मानव में TBI प्रेरित recreates. विशेष रूप से, बल और मृत्यु दर के परिमाण जो हल्के और मध्यम और खेल चेतावनी है कि पूर्व चोट शल्य हस्तक्षेपों पशु मॉडल के लिए अद्वितीय हैं के साथ कार से संबंधित चोटों में होता है के लिए इसी तरह की है. LFP भी कि LFP शारीरिक, जैव रासायनिक, neuropathological और व्यवहार में मनाया मानव TBI के प्रभाव के कई recapitulates में चेहरा वैधता दर्शाती है. वहाँ दोनों फोकल और फैलाना LFP के बाद पता चला परिवर्तन और प्रभाव के lateralization हैं एक कि contralateral तरफ चोट के ipsilateral पक्ष पर morphological क्षति की तुलना करने की अनुमति देता है. एक चेतावनी है कि संज्ञानात्मक और मोटर प्रभाव केवल एक गोलार्द्ध घायल का एक परिणाम के के रूप में और अधिक सूक्ष्म हो सकता है. अंत में, LFP भविष्य कहनेवाला वैधता दर्शाती है और LFP तकनीक की विश्वसनीयता 20 चोट के अधिष्ठापन के पहले या बाद में विभिन्न औषधीय और आनुवंशिक जोड़तोड़ के मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है. रक्तचाप, रक्त पीएच और रक्त जैसे शारीरिक चरgasses के लिए और परीक्षण करने के लिए एक चिकित्सीय एजेंट की कार्रवाई के तंत्र का निर्धारण दवा की उपस्थिति या अनुपस्थिति में मापा जा आवश्यकता होगी. हालांकि, TBI के प्राथमिक और माध्यमिक परिणामों के जटिल प्रकृति के कारण, यह एक एकल हस्तक्षेप है कि लक्षणों के सभी कम कर सकते हैं की पहचान करने के लिए एक मुश्किल कार्य है.

LFP तकनीक के लिए एक भविष्य पर विचार सूक्ष्म द्रव परकशन का उपयोग हो सकता है जो 15 द्रव में एक माइक्रोप्रोसेसर नियंत्रित, pneumatically संचालित साधन पेंडुलम द्वारा दिया बल calibrating के लिए समाप्त करने की जरूरत है और हवा बुलबुले के रूप में परिचालन चर से बचने के लिए रोजगार . हालांकि, मानक LFP दृष्टिकोण कई शोधकर्ताओं द्वारा सिद्ध किया गया है आणविक क्षति और वसूली TBI जो बेहतर उपायों और चिकित्सा के लिए नेतृत्व करेंगे अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय और सरल तकनीक.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

दिमागी चोट अनुसंधान पर इस काम के न्यू जर्सी आयोग द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

  • Stereotaxic alignment instrument for mice (Kopf Instruments)
  • Mouse gas anesthesia head holder (Kopf Instruments)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Buprenorphrine (Webster Animal Supply)
  • Refresh Lacri Lube eye ointment (Fisher)
  • Bupivacaine/Marcaine (Webster Animal Supply)
  • Povidone-iodine solution (Fisher)
  • 20 g 1 ½” needles (Becton Dickinson)
  • Scalpel blade (#15) and holder (Becton Dickinson)
  • Bulldog clamps (Fine Science Tools)
  • Dental tool or bone scraper (Fine Science Tools)
  • Side grasping forceps Dumont #6 (Fine Science Tools)
  • 3mm outer diameter trephine (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania)
  • Solid nylon cord (1.7 mm diameter, e.g. weed trimmer line)
  • Super glue gel
  • Loctite cyanoacrylate glue (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation)
  • Jet Acrylic Liquid (Butler Schein)
  • Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein)
  • Storage Oscilloscope TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix)
  • Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • LFP device (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • High-pressure tubing, length 41cm, volume 2ml (Baxter)
  • 3M Vetbond Tissue Adhesive (Fisher)

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References

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Comments

12 Comments

  1. Hi,
    I do this same procedure but am frustrated with the glue I use. DŒs the Loctite keep the trephine guide in place and dŒs it help keep the hub from wobbling and scooting around when you apply the dental acrylic?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:18 PM
  2. The loctite glue dŒs work well to keep the weed whacker circle afixed and the trephine from slipping around. We do not use the loctite glue to keep the hub in place. For that we use super glue gel and you do have to have a steady hand to prevent the hub from moving while applying the glue. Wait a minute for the glue gel to dry before applying the dental cement.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:17 PM
  3. Hi again,
    I'd also like to ask if the IV line that you use to connect the animal to the FPI device has any affect on the level of injury, the wave form, or if you have to make any adjustments to compensate for the additional length of the line?
    Thanks again for your time.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:23 PM
  4. The tubing we purchase is a fixed length. We assume that different lengths may affect the waveform which could be adjusted empirically with test pulses.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:29 PM
  5. Hi,
    I would like to ask you where did you purchase the trephine you used for the craniotomy?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 6:37 AM
  6. We got ours from the Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:17 AM
  7. Hi, thank you very much for the quick response;
    However, when I read Research Instrumentation Shop, I tried to google it, but I see that they are a very specific shop for your university.
    I am trying to perform some craniotomies in my mice using a dental drill, however it seems that your way is more efficient and less risky. Is there another way to obtain such trephine? It's a very delicate instrument that is very difficult to find. Do you have perhaps other alternatives?

    Thank you very much and sorry for the trouble

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:31 AM
  8. I am sorry, but i know of now other source than U of P. They are custom made and are made to order. I have found then to make a very clean window without any danger of heat-induced damage. I have also used trephines attached to microdrills with much less success. I am have also made window using these trephines for ²-photon imaging of live mice.



    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:31 AM
  9. I used to get mine from U. of Penn also, but I was told they no longer wanted to make them. I switched to using a pin vise from a hardware store, coupled with a trephine from FST, item # 18004-²7. I feel this works better than the ones from U. Penn, the pin vise is slightly larger so I have more to hold on to and therefore more control. Pin vises are inexpensive but you will need to replace them frequently because they eventually rust; they are not made to be autoclaved. Alternately, you could get one or two of them plated in nickel, which would eliminate the need to replace them. We have a shop here that dŒs that kind of work, I discussed this with them when I was switching from the U.Penn trephine to the Fine Science Tools type.
    Custom Design & Fabrication South, LLC
    ²²90 Spain Drive
    Petersburg, VA ²3805-8403
    (804) ²01-5471
    Hope this is helpful to you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:32 AM
  10. Thank you very much for the info and the concern

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:43 AM
  11. Terry,

    That is a very useful idea--I have a FST trephine that I have not used yet. I will give it a try.

    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:45 AM
  12. Very nice demo! Just a minor comment about anesthesia. Mouse respiration rate should be around 60 times/minute even under 100% O² during the surgery in order to minimize artifact on animals. This video showed that the mouse receiving surgery exhibited a very slow respiration, 5 to 6 seconds a time, namely about 1² times/minute, which indicated that anesthesia in this demo was too deep. If the conc of isoflurane is maintained between 1.1 to 1.4%, during the surgery, you should not have that problem.

    Reply
    Posted by: YeQing P.
    February 17, 2013 - 10:11 AM

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