의 DNA 지문 Mycobacterium 레인스

Immunology and Infection
 

Summary

에 의한 나병,

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Jensen, R. W., Rivest, J., Li, W., Vissa, V. DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA). J. Vis. Exp. (53), e3104, doi:10.3791/3104 (2011).

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Abstract

나병의 전송의 연구는 원인이되는 대리인 이후, Mycobacterium leprae은, 실험실에서 배양해 수 없습니다 특히 어렵습니다. 박테리아의 유일한 소스는 나병 환자, 그리고 실험적으로 감염된 딜 및 누드 마우스입니다. 따라서 현대적인 역학에서 사용되는 방법 많은 나병 연구에 대해 사용할 수 없습니다. WHO 1 구현된 나병에 대한 광범위한 글로벌 약물 치료 프로그램에도 불구하고, 나병 약 250,000 새로운 가지 경우 매년 많은 국가에서 발병 남아 있습니다. 2 전체 M.가 leprae (마이크로 및 minisatellites라고도 함) 게놈은 3,4를 매핑되어 많은 loci는 2 개 이상의 기본 쌍 세그먼트를 반복 것으로 확인되었습니다. M. 5 임상 계통 leprae 이러한 loci의 많은에 탠덤 반복 세그먼트의 개수 (짧은 탠덤 반복, STR)에 따라 다를 수 있습니다. 5,6,7 가변 번호 탠덤 반복 (VNTR) 5 분석 나병 bacilli의 다른 변종을 구별하기 위해 사용되었습니다. loci 중 일부는 다른 사람이 같은 환자에서 때로는 더 빠르게 변경하는 것 동안 반복 숫자가 적은 변화를 보여주는, 다른 사람보다 더 안정적인 것 같습니다. 특정 VNTRs의 다양성은 스트레인 입력 7, 8, 9에 대한 그들의 적합성에 관한 질문을 가져왔습니다 반면, 신흥 데이터들의 안정성에 다양한 여러 loci을 분석, 가치 역학 도구로 사용할 수있는 것이 좋습니다. 여러 로커스 VNTR 분석 (MLVA) 10 중국 11,12, 말라위 8, 필리핀 10,13, 브라질 14 등 여러 국가에서 나병의 진화 및 전송을 연구하는 데 사용되었습니다. MLVA 여러 단계를 포함한다. 첫째, 박테리아 DNA는 임상 biopsies 또는 슬릿 피부 얼룩 (SSS)에서 호스트 조직 DNA와 함께 추출됩니다. 10 원하는 loci는 다음 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)를 통해 추출 DNA에서 증폭됩니다. 4-5 다른 loci에 대한 찬란 - 표시 primers 그 다음 10 PCR 제품을 원하는 DNA 세그먼트의 존재를 확인하기 위해 아가로 오스 겔 전기를 받게 될 수도 있습니다. 18 loci 네개가 반응의 총 증폭되는, 반응 당 사용, 그리고 모세관 전기 영동을 사용하여 형광 조각 길이 분석 (FLA)에 제출. 아르마 딜로의 DNA는 긍정적인 컨트롤로 사용되는 각 로커스에 대한 반복 복사 알려진 번호 박테리아를 passaged. FLA의 chromatograms 그러면 피크 스캐너 소프트웨어와 조각의 길이가 VNTR 사본 (allele)의 숫자로 변환을 사용하여 검사하고 있습니다. 마지막으로, VNTR의 haplotypes는 패턴 분석하고 있으며, 환자 임상 데이터와 결합하면이 변형 유형의 분포를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

이 비디오 문서의 목적은 데이터 형식 및 단지 작품의 이러한 유형 (그림 1)을 시작하는 연구자에 대한 해석과 함께 작업 흐름의 개요를 제공하는 것입니다. 그것은 이전에 출판 작품에서 설명한 기법, 단순화된 프로토콜과 실용적인 조언의 데모를 포함하고 있습니다. 5,10

일반적인 작업 흐름 및 연구소 시설 :

이런 종류의 연구를위한 적어도 3 별도의 작업 영역이 있어야합니다. 실험실은 PCR 프라이머 준비를위한 후드 (깨끗한 공기 상자 또는 격리 작업 영역) (희석, 나누어지는 준비와 혼합), 2) 처리에 대한 별도의 바이오 안전 캐비넷과 DNA의 추가 포함) 사전 PCR 영역을 1해야 PCR 혼합하고, 3) 이후의 PCR 작업 영역 젤류을 준비하고 로딩과 FLA에 대한 샘플을 준비. Primers과 DNA 샘플은 별도의 냉동고와 냉장고에 보관해야합니다. 프라이머 오염은 이러한 유형의 실험 작업에서 최고와 가장 영속 문제 중 하나입니다. primers 및 PCR 믹스에 사용되는 Pipettes은 DNA에 사용해서는 안됩니다. 사전 PCR, PCR 및 PCR 후 작업 영역에 대한 pipettes 별도의 세트가 있어야합니다. 일반적으로 한 연구는 표준 실험실 장비를 사용하여 12~24시간 기간에 12-18 샘플을 처리할 수 있습니다.

작업의 각 단계를 시작하기 전에 :

  • 실험 복과 장갑을 착용한다. 장갑은 어떤 시간을 생물 학적 샘플, primers, DNA와 ethidium의 브로마이드가 처리되고 착용한다. 자주 장갑을 변경합니다.
  • PCR 캐비닛 후드, biosafety 캐비닛이나 깨끗한 작업 공간에서 작동합니다.
  • 새로운 벤치 종이 또는 패드를 사용합니다.
  • 액체 및 피펫 팁을에 적합한 폐기물 receptacles을 설정합니다.
  • PCR의 후드와 70 % 에탄올로 pipettes의 내부로 좀 닦아.
  • PCR 전에 15 분 동안 자외선에 따라 pipettes 및 작업 영역 설정. (자외선 라이트 crosslinks 표면 DNA 오염 물질.)
  • 항상 DNA, primers 및 PCR의 시약을 포함하는 재료에 대한 에어로졸 방지 피펫 팁을 사용합니다.
  • 처리에 의해 에어로졸 탈출과 교차 오염을 방지하기 위해 열기 전에 모든 튜브 / 스트립 / 액체를 포함하는 번호판을 원심 분리기.

1. M. leprae DNA 준비

M.를 포함하는 임상 샘플 leprae 피부 클리닉을 방문 나병 환자에서 얻을 수 있습니다. 정기 진단 샘플 피부 펀치 biopsies, 슬릿 피부 얼룩이나 비강 면봉 수 있습니다. 그들은 깨끗한이며 M.의 충분한 양을 포함하고 있기 때문에 일반적으로, 펀치 biopsies 또는 가늘고 길게 찢어진 피부 얼룩은 분자 역학에 대한 최고 leprae. 연구에 이러한 자료의 사용은 기관 지침에 따라 승인을 받아야합니다.

  1. 70 % 에탄올 1 ML있는 나사 캡 병에 피부 얼룩 샘플을 생검 또는 슬릿을 유지하고있다.
  2. 15 분 동안 12,000 XG에서 변속 벤치 톱 원심 분리기의 각 샘플을 원심 분리기.
  3. 뜨는을 제거하고 microcentrifuge 관에 놓으십시오. 필요하다면, 그것은 다시 원심이 샘플 유용하고 나중에 추가 조직이나 DNA를 복구할 수 있습니다.
  4. 인산염의 추가 500 μl의 조직 샘플에 호수 (PBS)를 버퍼 및 잔여 에탄올 방부제를 교환하고 예제를 rehydrate 1 시간 만끽해보세요.
  5. 20 분 동안 12,000 XG에서 벤치 톱 원심 분리기에서 샘플을 원심 분리기. 부분적으로 방역 솔루션으로 가득한 폐기물 용기에 PBS 솔루션을 폐기하십시오.
  6. Qiagen DNEasy의 혈액 및 규정된 지침에 따라 조직 키트를 사용하여 박테리아의 DNA를 추출합니다.
  7. 추출된 DNA는 4 유리병에 aliquoted해야합니다. -80에서 보관이 aliquots ° C 나중에 사용하기 위해 새로운 기술을 사용할 수있게되면 검사 결과의 재현성이 필요하거나 경우 / 때. 스토어 일 -20 ° C에서 나누어지는 4에 하나 ° 이상 즉시 사용할 수 C.
  8. 그것은 조직 샘플과 함께 '추출 공백'을 준비하는 조심스러운 것입니다. 빈은 위에서 설명한하지만 조직이없이 수행되는 모든 동일한 치료를 받게됩니다. PCR은 환자의 샘플과 함께 추출 빈은 운영자의 추출 기술이 올바른지 보장하고 시약은 DNA 오염은 무료입니다.

2. 프라이머 준비

  1. 가장 광범위한 변형 형식 데이터가있는 loci에 대한 Primers은 표 1에 나열되어 있습니다. 4 5 primers는 멀티 플렉스 PCR을 위해 결합됩니다. 각 로​​커스에 대한 하나의 입문서는 모세관 전기 영동의 조각 길이 분석 (FLA) 중에 감지됩니다 5 '형광 화학 태그를 수행합니다.
  2. 각 멀티 플렉스 PCR 조합은 각 로커스에 대한 태그 뇌관 및 해당 역방향 프라이머는 별도의 Eppendorf 튜브에 결합 : 한 튜브에 앞으로 primers, 다른에서 역방향. 증권 primers는 100μM 솔루션 (그림 2A)로 준비하는 부분 중TE를 사용하여 10 μm의의 농도로 희석합니다 10X (1X 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0). 100 μm의 프라이머 솔루션의 남은 aliquots는 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다.
  3. 각 10 μm의 프라이머 동등한 수량은 각 프라이머의 2μM 최종 농도의 결과로 혼합하고 있습니다. 프라이머 조합은 PCR 혼합물 (표 3)에 추가하면 각 프라이머의 최종 농도는 0.2 μm의에 방울.

통합 primers는 PCR 혼합물 (표 3)에 추가되면, 최종 농도 0.2μM 각각 놓습니다.

3. 멀티 플렉스 PCR을 사용하여 확장 세균 DNA

  1. PCR 설정
    • 사용됩니다 샘플의 수를 기록하고 필요한 플라스틱 및 기타 자료를 수집하기 전에 필요한 시약과 볼륨 워크시트를 준비합니다.
    • 멸균 튜브 / 스트립 / 샘플 번호 PCR에 사용될 번호판을 레이블. 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함하는 것을 잊지 말아주세요.
  2. 청소 솔루션 (예 : Decon ELIMINase 등) 및 프로그램은 표 2에 따라 함께 thermocycler을 닦아주십시오. 클리닝 후 primers 및 기타 시약을 취급하기 전에 장갑을 변경합니다.
  3. 표 3 및 레이블을 사용할 뇌관 조합 및 샘플 번호 튜브 / 스트립 PCR / 판에 따라 PCR Mastermix를 준비합니다.
  4. 각 표시 PCR 샘플 튜브 또는 잘하는 Mastermix의 나누어지는의 18μl. 장갑을 변경합니다.
  5. 어떤 DNA의 오염 물질을 상호 연결하는 15 분 동안 자외선에 작업 영역 및 pipettes 적용 후, 작업 영역 및 도구를 청소하고 소독 수 있도록 70 %의 에탄올과 별도 바이오 안전 캐비넷 및 pipettes을 닦아주십시오. 장갑을 변경합니다.
  6. 깨끗한 바이오 안전 캐비넷에서 각 PCR은 튜브 / 20μl의 총 부피 (그림 2B)를 취득 잘 판. 모든 액체 물질에 대한 에어로졸 방지 피펫 팁을 사용의 Mastermix에 DNA 템플릿의 2μl를 추가합니다.
  7. 내용을 섞어 간단히 PCR 튜브 / 스트립 / 번호판을 원심 분리기.
  8. thermocycler에있는 샘플 튜브 / 스트립 / 플레이트를 삽입하여 PCR 프로그램을 시작합니다.
  9. 프로그램이 완료되면 4 thermocycler과 상점에서 제품을 제거 ° C를 전기 영동까지.

4. PCR 제품의 젤 전기 영동

*이 프로토콜은 수년 동안 표준되고 PCR 제품의 확인이 FLA 그들을 보내기 전에 원하는 경우 고용 수있는 단계는 선택 사항입니다했다.

  1. 별도의 포스트 PCR 작업 영역에서 2 % 아가로 오스 겔을 준비합니다. 1X TBE의 2.0g 아가로 오스 powder/100ml (트리스 / Borate / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 플라스크에 버퍼 용액을 사용하십시오. 전자렌지에 약 1.5-2 분 동안 가열하여 혼합합니다. 소용돌이 내용, 아가로 오스를 분해하기 위해 필요한 경우 다시 가열. 약간 쿨 및 샘플에 대한 충분한 우물과 빗을 사용하는 형태로 젤을 따라줘.
  2. 4 PCR 제품을 제거 ° C와 30 초 동안 원심 분리기.
  3. 5 배 또는 배의 겔 로딩 버퍼 (중 버퍼가 여러 회사에서 사용할 수 있습니다, 또는 실험실에 섞여있을 수 있습니다. 조리법 온라인 사용할 수 있습니다.) 0.5 - 1μl와 혼합 PCR 제품의 2 5μl
  4. 6μl 샘플 / 로딩 버퍼 믹스로 젤의 우물을로드합니다. 일 잘 (선호 20 BP 사다리)에 분자 사다리를 추가합니다.
  5. 약 90 분간 100V에서 젤을 실행합니다.
  6. 시간의 동일한 금액 ultrapure 증류수에 다음 15-30분에 대한 ethidium의 브로마이드 용액에 겔를 적시게.
  7. 이미지 젤 자외선이 적용되는 동안. 조합에 4-5 DNA 세그먼트의 각 (그림 3)에 대한 밴드가 있어야합니다.
  8. 기관의 유해 물질 정책에 따라 젤 처분. Ethidium의 브로마이드 솔루션은 적절한 처리하기 전에 여러 번 사용할 수 있습니다.

5. 조각 길이 분석을위한 준비 샘플 (FLA)

  1. 깨끗한 Eppendorf 튜브에서 테스트할 각 샘플에 대한 GeneScan -500 리즈 사이징 표준 (응용 BioSystems에서 모두)의 신선한 나누어지는과 0.3μl에서 하이 디 포름 아미드 용액 12μl를 포함하는 마스터 혼합물을 준비합니다. (안녕하세요 - 디 포름 아미드는 화학적 난방의 필요성을 제거, 전기를 모세관하기 전에 DNA의 가닥을 denatures.)를 사용하여 96도 - 잘 광학 품질 반응 판, 각 포름 아미드 - 리즈 믹스의 나누어지는의 12.3μl 잘 샘플 및 설정을 위해 사용되는 옆으로 판.
  2. DNA 샘플은 (그림 4A) 각 우물에있는있다는 것을 나타내는 기록을위한 플레이트지도를합니다.
  3. 튜브 / 스트립 또는 96 - 웰 플레이트를 사용하여 PCR 제품의 1:60 희석을 만드는 PCR 품질 물 59μl에 PCR 제품의 1μl을 (파트 3) 추가합니다. Dilutions는 겔 밴드의 FLA 데이터 또는 밝기에서 신호의 강도에 따라 조정될 수 있습니다. DNA 5도 낮은 농도(1:120 또는 1:180) 충분합니다.
  4. 포름 아미드 - 리즈의 혼합물을 포함하는 접시에 잘 해결하기 위해 희석 PCR 제품의 1μl를 추가합니다.
  5. PCR은 또한 96 - 웰 플레이트에 이루어졌다면 속도와 효율성이 크게 향상 될 수 있습니다. 하나는 단순히 순서 3과 같은 접시를 줄 수 있습니다 PCR 제품, PCR 제품의 희석에 대한 멸균 물 플레이트 2, 포름 아미드 및 조각의 길이 분석을위한 사이징 사다리와 플레이트 3 플레이트 1. 멀티채널 피펫은 FLA 준비의 신속한 처리를 허용합니다.

유전자 분석기를 통해 샘플 분석

  1. 제조 업체의 지시 당 적용 flurophores를 감지하기 위해 유전자 분석을 보정합니다. 리즈를 포함하는 염료 세트를 사용해야합니다.
  2. 물이 컨테이너를 씻어 회의소를 버퍼에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1X) (응용 BioSystems) 새로운 실행 버퍼를 추가 보충.
  3. 접시에 미리 슬릿 실리콘 심장을 추가하고 디자인 지주 트레이에 접시를 놓습니다. autosampler 앞으로 가져 유전자 분석기에있는 '트레이'버튼을 누르십시오. 플레이스 autosampler에 트레이 및 유전자 분석에 문을 닫습니다.
  4. 분석을 위해 스프레드 시트를 만들거나 가져올 수 있습니다. 수입할 수있는 파일은. 플랜타티온 오브 확장자를 가지고 탭으로 구분된 형식으로되어 있습니다. 파일은 엑셀 (마이크로 소프트) 또는 이와 유사한 프로그램을 수정할 수 있습니다.
  5. 샘플 15 S.위한 1.6 KV의 주입 전압을 적용하여 모세관 (50 cm의 길이, POP - 7 고분자)에 주사 모세관 전기 영동 1800 초 동안 60 ° C 15 KV의 전압에서 실행됩니다. 전체 프로세스는 약 45 분 정도 소요됩니다.
  6. 실행이 완료되면 분석 각 샘플에 대한 데이터는. FSA의 확장자를 가진 파일에 변환되고 접시 파일 폴더 (그림 4B)에 배치됩니다. 각 데이터 파일의 크기는 약 100 KB입니다 플래시 드라이브에 저장하거나 압축하고 이메일로 전송하실 수 있습니다. 데이터 파일은 같은 ABI의 GeneMapper 또는 피크 스캐너와 같은, 적합한 소프트웨어를 사용하여 볼 수 있습니다.

6. 조각의 길이 결과의 분석

  1. 형광 모세관 전기 영동에서 데이터의 분석은 특별한 소프트웨어가 필요합니다. 이러한 소프트웨어를 사용할 수없는 경우, 응용 BioSystems 웹사이트를 가서 피크 스캐너를 다운로드하십시오. 이 소프트웨어는 무료이며 꽤 잘 작동합니다. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
  2. 오픈 피크 스캐너 및 '파일 추가'다음 '새 프로젝트를 시작합니다. 긍정적이고 부정적인 제어를 포함하여 선택했습니다. FSA 데이터 파일 프로그램에을로드합니다.
  3. 선택 (강조 표시) 및 모든 로드된 파일을 "분석". GS500 (-250) 및 분석 방법 : 각 샘플은 "크기 기준으로 설정되어 있는지 확인하십시오. 사이징 기본값 - PP 보도 자료 '분석'.
  4. 샘플의 DNA 조각에 의해 만들어진 각각의 색깔 피크 기본 쌍의 크기를 검사합니다.
  5. 기본 쌍의 각 피크의 크기 값을 기록하고 긍정적인 제어 절정에 비교합니다.
  6. 긍정적인 컨트롤 샘플의 봉우리는 기본 쌍과 4-7 표에 나와있는 탠덤 반복의 해당 숫자의 번호와 호의를 비교해야합니다.
  7. 긍정적인 컨트롤과 비교하여 각 샘플 allele의 존재가 얼마나 짧은 탠덤 반복 세그먼트를 확인합니다. 우리는 검사되는 각 로커스에서 VNTR의 매수에 대한 합성되어 NHDP63를 사용 4.
  8. 비교 및 / 또는 수학 분석을위한 스프레드 시트에 기록된 데이터를 입력합니다. VNTR '지문'또는 haplotypes는 M.의 특성 정의 loci에서 대립 유전자의 문자열입니다 leprae 변형.

7. 대표 결과

PCR 제품의 젤 전기 영동은 잘하면 뇌관 조합의 각 로커스 (그림 3) 밴드를 생산합니다. 그림 3에서 젤 2 섹션이 있습니다 : 상단 1 PCR 샘플과 낮은 부분의 조합이 샘플을 조합했다. 각 섹션은 8 환자의 샘플에서 얻은 PCR 제품 다음 20 기본 쌍 분자 사다리가 포함되어 있습니다. 조합 1도 부정적인 컨트롤과 마지막으로 긍정적인 컨트롤 (NHDP63 변형)이 있습니다. (조합 2 컨트롤은 다른 젤있었습니다.) 대부분의 샘플이 명확하게 조합의 각 로커스 5 밴드, 1을 표시합니다. 어떤 경우에는, 밴드도 겨우 4 밴드의 모양으로 인해 별도의 loci로 표시 가깝게있을 수 있습니다.

예상 amplicon의 크기는 표 1에 나열되어 있습니다. 저희 연구실은 M.의 NHDP63 변형을 사용하여 leprae 긍정적인 제어로. 반복 세그먼트의 두 종류가 연구되었다 : microsatellite loci (1-5 기본 반복)와 minisatellite loci를 (5 기본 쌍가 여러 번 반복보다 큰 세그먼트와 함께).

모세관 전기 영동에서 데이터 파일의 해석 2 표준에 의존 : 내부의 DNA 조각 사이징 표준 GeneScan - 500LIZ (ABI)과 증폭 세균성 DNA의 외부 긍정적인 컨트롤 샘플했다.

FLA chromatograms은 피크 스캐너 소프트웨어를 사용하여 볼, 인물 5A, 5B, 6에서 볼 수 있습니다.

피크 스캐너 amplicon의 크기에 데이터 (기본 쌍의 X - 축) 및 신호 강도 (Y 축)를 제공합니다. 크기와 피크 높이 값이 가장 중요하지만 (그림 5B) 피크 면적 등에 대한 추가 데이터도 사용할 수 있습니다. 높이 100 단위 이하 봉우리는 일반적으로 신뢰할 수있는 너무 약한 신호로 간주됩니다.

그림 6 로커스 (GTA) 9 탠덤 반복의 숫자에 변화를 보여주는 긍정적인 컨트롤 (NHDP63) 두 환자의 샘플을 비교합니다. 긍정적인 컨트롤에서 시퀀스 (GTA) 10 번 반복됩니다. NHDP63의 VNTR 및 amplicon의 크기는 유전자 배열을 통해 확인되었습니다. 환자 4의 PCR amplicon은 환자 6 11 반복 (GTA)를 공개 NHDP63 3보다 혈압이 큰 amplicon을 가지고있는 동안에만 9 반복 단위가있다 나타내는 긍정적인 컨트롤 3보다 혈압이 작습니다. 환자는 2 따라서 거의 또는 전혀 DNA PCR 복제, 아니 FLA 신호와 낮은 세균 지수 (BI)를했다.

FLA 데이터 해석에 어려움이 때로는 '망가'의 결과로 발생합니다. PCR 반응 동안의 DNA 중합 효소가 이상하거나 소스 allele보다 짧은 1 인 이상 반복 아르 조각을 생산 수 있습니다. 이들은 대개 주봉을 둘러싼 낮은 높이의 봉우리로 인정받고 있습니다. 그들은 교장 정상보다 크거나 작게 반복 세그먼트의 기본 쌍의 정확한 숫자입니다 '사다리'것입니다. 결과는 같은 색깔의 봉우리의 가족입니다. 그림 7 로커스 (TA) 10이를 보여줍니다.

때로는 FLA로 발생한 또 다른 어려움은 '+'또는 'A - 붙었다'의 DNA 중합 효소는 [(A) 일반적으로 아데닌] 복사 DNA 세그먼트의 3 '끝에 하나의 기지를 추가하는.을 포함 이것은 그림 8과 같이 인접 정상보다 1 기본 쌍 큰 주요이나 말을 더듬 피크의 오른쪽에 최고로 FLA에 나타납니다. 그것은 주 또는 말을 더듬 정상과 혼동해서는 안됩니다. 주요 피크와 A - 꼬리는 단일 수종으로 간주됩니다. A - 꼬리 VNTR 반복의 수를 변경하지 않습니다. (일부의 DNA 중합 효소 키트는 특히이 혼란함을 주죠 효과를 줄이기 위해 A - 미행을 촉진하기 위해 고안되었습니다. A - 미행 완료 추진 하나의 피크보다는 봉우리 한 켤레를 생산하는 경향이있다.)

DNA 추출 및 PCR 제품 M. 모두 포함 leprae과 인간의 DNA 그러나 (TA) 18를 제외하고, primers들은 단지 박테리아 DNA를 증폭되는만큼 구체적이며, 거의 또는 전혀 인간의 DNA 증폭이 있습니다. (TA) 18은 종종 인간의 DNA에서이며, 아르마 딜로 passaged DNA 샘플 (그림 9)에서 볼 수 없습니다 242 기본 쌍에서 피크를 생성합니다.

primers의 수명은 제공된들은 -20 ° C에만 즉시 사용할 제거에서 유지하고있다 일반적으로 좋은, 그리고 소비 ° C까지 4 저장됩니다. Primers 4 ° C 1-2 주가 안정되어야합니다. PCR을위한 프라이머 조합을 만드는 것은 다소 시간이 소요됩니다하더라도, 그것은 즉시 사용에 대해서만 충분히 프라이머 조합을 준비하는 것이 좋습니다. 프라이머 조합은 장시간 기간 동안 저장할 때 다소 저하될 것 같습니다.

TE는 큰 주식 aliquoted해야하고, aliquots이 중 냉동 또는 상온에서 저장할 수 있습니다. 200 - 400μl의 큰 aliquots가 건조하거나 집중 뇌관 주식 (그림 2A)을 diluting에 도움이된다. 10-50 μl 작은 aliquots는 프라이머 조합 3과 4의 볼륨을 보충하는 데 유용합니다. TE는 저렴하고 aliquots는 사용 후 폐기되어야합니다.

다중 효소 키트는 매우 고가이며, 사용까지 (-20 ° C) 냉동 보관해야합니다. PCR의 준비에 따라, 사용되지 않는 멀티 플렉스 솔루션은 4 즉시 반환해야 ° C. 작은 Qiagen 멀티 플렉스 PCR 키트는 멀티 플렉스 믹스, 솔루션의 각 포함된 0.85ml (850μl) 3 튜브와 함께 제공, 충분한 약 65-70 PCRs하십시오.

일반적으로, 그것은 DNA 샘플, primers 및 다중 키트 솔루션을 포함하여 실험실 작업 이런 종류의에 사용되는 재료에 대한 반복, 주요 온도 변화를 방지하는 것이 좋습니다. 모든 자료는 필요한 때까지 -20 ° C에 보관하고 소비 ° C까지 4 보관해야합니다. DNA의 장기 보관은 -80에서해야 ° C.

지출 조직, primers 및 / 또는 DNA를 포함한 모든 자료는 autoclaved 및 처분해야 할 때 사용하는 더 이상. 모든 샘플 처리ethidium의 브로마이드이나 포름 아미드는 유해 폐기물로 취급 기관의 유해 물질 정책에 따라 처리되어야 함께.

표 1
표 1 : 변형 NHDP63에 대한 Amplicon 크기

표 2
표 2 : VNTR PCR에 대한 매개 변수를 사이클링

표 3
표 3 : PCR의 작성

표 4
표 4 : 조합 1 Allele 호출

표 5
표 5 : 조합 2 Allele 호출

표 6
표 6 : 콤비네이션 3 Allele 호출

표 7
표 7 : 조합 4 Allele 호출

그림 1
그림 1 : VNTR - FLA 프로세스 흐름 다이어그램

그림 2
그림 2. 조합 1 어퍼 Primers의 (A) 준비 (의 Eppendorf 튜브 사진 의례 www.clker.com ). (B) PCR 설치 (8 PCRs을위한) (www.clker.com의 Eppendorf 튜브 사진 예의)

그림 3
그림 3. 조합 1and이 VNTR PCR 제품 DNA의 아가로 오스 겔

그림 4A
그림 4B
그림 4. . () FLA 플레이트지도 (B) FLA 데이터 파일 : *. FSA

그림 5A
그림 5B
그림 5. 조합 1 VNTR loci의 양성 반응 제어 (A) FLA의 크로마토 그램 (NHDP63). (B)의 amplicon의 크기와 풍부한위한 피크 스캐너 데이터 (GTA) 9

그림 6
그림 6. 로커스 (GTA) 9 PC (NHDP63)에 PCR 샘플 비교

그림 7
그림 7. (TA) 10 주 및 못들었 피크스

그림 8
그림 8 : + 메인하거나 말을 더듬 봉우리에 인접 (A - 꼬리) 봉우리.

그림 9
그림 9 : (TA) 18 주봉, 말을 더듬의 봉우리와 인간의 DNA 피크

그림 10A
그림 10B
그림 10 :. M. leprae의 VNTR 데이터를 기반으로 M.의 (A) 스트레인 차별화 (B) 스트레인 차별화 leprae MLVA DNA 지문을 바탕으로

Discussion

나병 환자의 피부 샘플 컬렉션 피부 진료소에서 일하는 숙련된 임상 또는 기술자가 필요합니다. 이 샘플을 처리 실험실 종사자 실험실 외투, 장갑 및 보호 눈 착용을 착용하고 인간이나 아르마 딜로 조직의 감염 샘플을 처리하는 바이오 안전 캐비넷에서 작업에 큰주의를해야합니다. 표면 및 도구의 소독도 중요합니다. 깨끗하고 살균 바이오 안전 캐비넷에서 작업하는 것은 DNA 샘플의 오염을 피하는 것이 중요합니다.

DNA 추출은 Qiagen 같은 회사에서 추출 키트의 발전에 상대적으로 쉽게 덕분되고 있습니다. 약도는 신중하게 따라야합니다. 사용하지 않을 때는 모든 샘플은 추운 보관해야합니다. 샘플에 대한 반복, 극단적인 온도 변화를 피하십시오.

이 작품에 사용되는 DNA의 primers는이 문서의 끝부분에 문학 참조 목록에서 인용되었습니다 여러 업체에서 주문하실 수 있습니다. 케어는 오염을 방지하기 위해 DNA 무료 환경에서 primers 작업로 이동해야합니다. Primers가 건조 분말로 와서 TE와 혼합 및 100μM 농도로 희석해야 다음 작은 양이 (그림 2A)로 구분됩니다. primers의 작업 솔루션은 더욱 10μM 농도로 희석하고 있습니다. 다시 말하지만, 영역 / primers를 사용하고 준비 후즈에서 DNA 샘플을 사용하지 마십시오.

PCR 제품도 사용하지 않을 때 감기에 보관해야합니다.

3 % 아가로 오스 겔 준비 더 DNA 밴드 분리를 제공하지만, 실행하는 데 오래 걸립니다. 순수하게 정성을 위해, 2 %는 일반적으로 충분합니다. 아가로 오스 젤에서 DNA를 얼룩에 사용 Ethidium의 브로마이드 솔루션은 피부를 통해 흡수되어 매우 활성화 genotoxin입니다. 이 솔루션과 아주 잘 사용하고 항상 장갑을 착용해야되는 스테인드 젤을 처리합니다. 모든 DNA 샘플이나 ethidium 브로마이드 자료를 처리 후에는 깨끗이 손을 씻으십시오. ethidium의 브로마이드 얼룩 솔루션의 폐기, 기관 지침에 따라 세척 및 젤류. 젤이 정기적으로 필요하지 않습니다, FLA 방법이 설립되면이 단계는 제거하실 수 있습니다. 그것은 시간과 시약이 소요됩니다.

FLA에 대한 샘플을 준비에 사용되는 포름 아미드 솔루션은 또한 매우 유독 신경을 써서 처리한다. 의 사용 후 손을 씻으십시오. 기관 지침에 따라 그것의 처분.

피크 스캐너 소프트웨어를 사용하여 FLA의 결과를 읽는 것은 도전하실 수 있습니다. allele 전화 (탠덤 반복의 수)의 기본적인 세트 CSU (표 4-7)에서 개발되었습니다. (M. 다른 변종이 leprae 연구 있으므로 그것은 4-7 테이블 모두 포함되지 않을 수 있다고 지적한다. 나열된 범위 밖 복사 번호 대립 유전자를 찾을 수 있습니다.) 하나 특정 과제는 '말을 더듬'봉우리를 포함합니다. 이들은 특히 그러한 10 (TA)로 2-3 기본 쌍 반복을 포함 STRs의 봉우리의 가족입니다. 때때로 읽고 올바른 최고를 선택하는 것은 어렵습니다 (그림 7). 이 그림에서, 190 BP의 긍정적인 통제 정상가 주봉이다. 2아르 높이 낮은 봉우리, 4, 또는 6 기본 쌍 큰 또는 주봉보다 작은 '못들었의 봉우리.라고합니다 A - 미행도 혼란을 일으킬 수 있습니다. A - 미행은 텍스트와 그림 8의 앞부분에서 설명한 것입니다. 마지막으로, PCR 제품 샘플에 매우 풍부하는 경우, 봉우리는 이중 스파이크와 함께 나타날 수 있습니다. 이 경우, 정상 형태의 센터를 참조하십시오. (그림 6, 환자 6 참조).

데이터 관리 작업이 유형에 대한 강력한 작업이 될 수 있습니다. 작업 또는 절차의 날짜, 운영자, 스트립 / 플레이트지도, FLA 주문, PCR 조건과 요리법, 젤류 및 사진의 날짜, 저장 온도, DNA 템플릿 dilutions, FLA 모든 관련 등의 모든 실험에 대한 정보를 기록하는 것이 중요하다 전자 파일의 저장 위치 등 좋은 조직 및 데이터 관리는 미래의 정보의 특정 부분을 찾는 동안 시간의 시간을 절약할 수 있습니다.

여기에 설명된 실험실 작업은 콜로라도 주립 대학에서 그리고 전세계 다른 지역에서 몇 년 동안 계속되어왔다. 수집된 데이터의 모든 수단과 방법은 나중에 사용할 수있을 어떤의 대형 사진이 등장하기 시작합니다. 수치 10A와 10B는 이러한 DNA 지문이 다른 M.을 구분하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다 국가 (10A) 또는도 간의 가족 (10B) 사이 leprae 변종. 가족 및 지역 사회 연계 케이스 M. 휴대 표시되었습니다 leprae 유사하거나 동일한 VNTR 스트레인 종류의. 희망은 전송 네트워크의 조기 발견 시스템이 사람 MOS 위해 개발된 수 있도록 나병 전송 모드 (S)에 대한 통찰력을 얻을 수있을 수있다영구적인 신경 손상과 피부과이 완료되기 전에 위험하고 치료 약물 치료에 t가 시작할 수 있습니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

기금은 NIH / NIAID 부여 RO1 - AI - 63457와 아라 부여 보완 RO1 - AI - 63457 S1에 의해 제공되었다. 우리는 실험실 그룹과 공동 작업의 모든 현재 및 과거 회원의 기여를 인정합니다.

References

  1. World Health Organization. Chemotherapy of leprosy for control programmes. Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).
  2. Cole, S. T. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature. 409, 1007-1011 (2001).
  3. Leproma Web Server. Leproma Web Server [Internet]. Available from: http://genolist.pasteur.fr/Leproma/ (2004).
  4. Groathouse, N. A. Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae. J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).
  5. Young, S. K. Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India. Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).
  6. Monot, M. Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae. J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).
  7. Kimura, M. Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens. J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).
  8. Weng, X. iaoman Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study. J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).
  9. Weng, X. Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation. Infection, Genetics and Evolution. (2010).
  10. Sakamuri, R. M. Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines. J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).
  11. Fontes, A. N. B. Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients. Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).

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