मानक प्रयोगशाला रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस प्रतिक्रियाओं में mRNA की एकल कोशिका मात्रा से सीडीएनए पैदावार बढ़ाने ध्वनिक Microstreaming का उपयोग

Bioengineering

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Summary

हम mRNA की एकल कोशिका मात्रा से अन्यथा मानक प्रयोगशाला रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं में सीडीएनए उपज बढ़ाने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन. नवीनता micromixer, जो ध्वनिक microstreaming की घटना का इस्तेमाल का उपयोग में रहता है, मिलाते हुए, vortexing या trituration से microliter पैमाने पर तरल पदार्थ और अधिक प्रभावी ढंग से मिश्रण.

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Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., Zhu, Y., Manasseh, R., Horne, M. K., Aumann, T. D. Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming. J. Vis. Exp. (53), e3144, doi:10.3791/3144 (2011).

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Abstract

Protocol

1. एक आरटी रिएक्शन Micromixing

  1. Micromixing के साथ एक आरटी प्रतिक्रिया प्रदर्शन से पहले, आरटी प्रतिक्रिया के वांछित तापमान को संतुलित micromixer.
    1. एक 37 के अंदर micromixer प्लेस डिग्री सेल्सियस (या आरटी आपूर्तिकर्ता द्वारा सिफारिश तापमान) कम से कम 1 आरटी प्रतिक्रिया की शुरुआत से पहले घंटे के लिए इनक्यूबेटर.
  2. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस आपूर्तिकर्ता के अनुसार आरटी मिश्रण सेट (जैसे MMTV - आरटी Promega, Qiagen से Omniscript से) निर्देश, उपयोग इनपुट कुल (जैसे 0.1-1pg/μl) μg एनजी के बजाय, शाही सेना के एकल कक्ष मात्रा को छोड़कर आपूर्तिकर्ताओं द्वारा की सिफारिश की मात्रा.
    1. हम मानक बाँझ, nuclease मुक्त 200μL पतली दीवारों पीसीआर ट्यूबों का उपयोग करें.
  3. स्थिति micromixer में सुरक्षित आरटी ट्यूबों जैसे ही वे मिश्रण के लिए तैयार हैं. micromixer आरटी प्रतिक्रिया की अवधि के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर अंदर रहना चाहिए.
  4. उपयुक्त आवृत्ति और micromixing के आयाम का चयन करें. इस उदाहरण में हम 150Hz का उपयोग करें.
  5. पर micromixer स्विच और यह आरटी प्रतिक्रिया (60 मिनट) की पूरी अवधि के लिए छोड़ दें.
  6. Micromixer बंद और आरटी ट्यूबों बाहर ले जाना है एक बार आरटी प्रतिक्रिया पूरा हो गया है.
  7. बर्फ पर आरटी ट्यूबों प्लेस और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR या वास्तविक समय पीसीआर) जैसे अनुप्रयोगों के साथ आगे के रूप में सामान्य आगे बढ़ना.

2. प्रतिनिधि परिणाम:

आरटी प्रतिक्रियाओं के संदर्भ में micromixing का लाभ जब अन्य मिश्रण तरीकों (जैसे मिलाते हुए, vortexing या trituration) का उपयोग किया जाता है रिश्तेदार सीडीएनए उपज में वृद्धि हुई है. सीडीएनए का उपयोग मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR या वास्तविक समय पीसीआर) के बाद के विश्लेषण पर हो, उदाहरण के लिए, देखा जा सकता है. चित्रा 2A आरटी प्रतिक्रिया के तुरंत आरटी ऊष्मायन (काला है, "trituration" से पहले trituration के साथ तुलना में पहले 5 मिनट के लिए micromixing के प्रभाव (नीले, "micromixed5") या पूरे 60 मिनट (लाल, "micromixed60") दिखाता है ). इस मामले में पूर्ववर्ती आरटी प्रतिक्रिया की मात्रा 25μL था और यह कुल शाही सेना के 2.5pg निहित. qPCR सीडीएनए का प्रतिनिधित्व Nurr-1 mRNA का पता लगाने के लिए डिज़ाइन प्राइमरों का उपयोग निशान के ऊपर दिखाया गया हैं, और ± का मतलब है यह वही प्रयोग के 3 दोहराता में 50% अधिकतम प्रतिदीप्ति तक पहुँचने के चक्र की संख्या के एसईएम नीचे प्लॉट किए जाते हैं. तारांकन एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर (Tukey कई तुलना के साथ एक तरह से एनोवा) अर्थ. ध्यान दें कि पूर्ववर्ती आरटी प्रतिक्रिया के पहले 5 मिनट के लिए micromixing trituration पर एक गैर महत्वपूर्ण सुधार का उत्पादन किया जबकि पूर्ववर्ती आरटी प्रतिक्रिया के पूरे 60 मिनट के लिए micromixing trituration पर एक महत्वपूर्ण सुधार का उत्पादन, जो परिमाण के लगभग 15 qPCR के लिए बराबर था चक्र, औसत पर.

micromixing का लाभ भी पिघलने बाद qPCR प्राप्त उत्पादों की वक्र विश्लेषण में देखा जा सकता है. चित्रा 2B में सचित्र प्रयोग, पूर्ववर्ती आरटी प्रतिक्रिया के पूरे 60 मिनट के लिए micromixing डुप्लिकेट नमूनों में एक सुसंगत qPCR संकेत (2Ba चित्रा, 2 लाल निशान) में हुई, जबकि पहले 5 मिनट या trituration केवल असंगत qPCR उत्पादन के लिए micromixing निशान (2Ba चित्रा, 2 नीले निशान और 2 काले निशान, क्रमशः). ग्रे निशान नकारात्मक ("neg") नियंत्रण सीडीएनए जो qPCR प्रतिक्रिया के बाहर छोड़ दिया गया था. जब इस प्रयोग से qPCR उत्पादों उनके तापमान (यानी पिघलने वक्र विश्लेषण) यह स्पष्ट हो गया ramping द्वारा विकृत थे कि उपयुक्त पीसीआर उत्पादों (यानी एक amplicon कि प्राप्त जब mRNA की बहुत उच्च सांद्रता रिवर्स और लिखित qPCR द्वारा परिलक्षित है कि करने के लिए समान था, डेटा नहीं दिखाया गया है) केवल निम्नलिखित आरटी प्रतिक्रियाओं है कि 60 मिनट (2Bb चित्रा, 2 लाल निशान) के लिए micromixed किया गया था उपस्थित थे. सभी दूसरों (यानी micromixed5, trituration और नकारात्मक नियंत्रण) वैकल्पिक amplicon उत्पादों (जैसे प्राइमर dimers) उत्पन्न.

चित्रा 1
चित्रा 1 मानक प्रयोगशाला आरटी प्रतिक्रियाओं को micromixing लागू करने के लिए प्रोटोकॉल के प्रवाह आरेख. भौतिक सिद्धांत शामिल है, micromixer और कैसे एक घर में micromixer निर्माण के अधिक विस्तृत विवरण 13,14 संदर्भ में प्रदान की जाती हैं

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि qPCR micromixing आरटी अन्यथा मानक प्रयोगशाला आरटी प्रतिक्रियाओं में mRNA की एकल कोशिका मात्रा शामिल प्रतिक्रियाओं पिछले करने के लिए लागू लाभ illustrating डेटा एक उदाहरण qPCR सीडीएनए का प्रतिनिधित्व mRNA एन्कोडिंग Nurr - एक जीन का पता लगाने के निशान. पूर्ववर्ती आरटी प्रतिक्रियाओं 25μL की एक मात्रा में कुल शाही सेना के 2.5pg रखी जाती है और 37 पर एक इनक्यूबेटर में ° 60 मिनट के लिए सी प्रदर्शन. आरटी प्रतिक्रियाओं आर के trituration द्वारा मिलाया गयाटी से पहले (काले निशान, "trituration") ऊष्मायन, आरटी प्रतिक्रिया (नीले निशान, "micromixed5") के पहले 5 मिनट के दौरान micromixed या आरटी प्रतिक्रिया के पूरे 60 मिनट के लिए micromixed (लाल निशान, "micromixed60" मिश्रण करने के लिए ). ± मतलब qPCR चक्र के लिए 50% अधिकतम प्रतिदीप्ति तक पहुँचने के लिए आवश्यक की संख्या के एसईएम n के लिए नीचे प्लॉट किए जाते हैं = इस प्रयोग के तीन दोहराता है. Asterisk एक महत्वपूर्ण अंतर है (Tukey कई तुलना के साथ एक तरह से एनोवा) इंगित करता है बी एक अन्य qPCR प्रयोग Nurr-1 सीडीएनए उत्पाद की जांच, आरटी 25μL की एक मात्रा में कुल शाही सेना के 25pg युक्त प्रतिक्रियाओं के बाद इस बार. qPCR (क) के निशान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से qPCR प्राप्त उत्पादों की वक्र विश्लेषण पिघलने (ख) विभिन्न मिश्रण स्थितियों के लिए दिखाए जाते हैं. नकारात्मक नियंत्रण है जिसमें कोई सीडीएनए पूर्ववर्ती आरटी प्रतिक्रिया में शामिल किया गया था भी (भूरे रंग के निशान, "neg.") शामिल हैं. आरटी प्रतिक्रियाओं mRNA की बहुत उच्च सांद्रता के साथ भी प्रदर्शन किया गया पिघलने वक्र (नहीं दिखाया डेटा) चोटियों उत्पादन micromixed60 के लिए (ख) नमूने (लाल निशान) में उन लोगों के लिए समान है.

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Discussion

मानक प्रयोगशाला आरटी प्रतिक्रियाओं micromixing के आवेदन की विधि यहाँ वर्णित है, ज़ाहिर है, को शामिल कर सकते हैं किसी भी विधि (जैसे सेल lysis, लेजर कब्जा microdissection) के माध्यम से काटा mRNA. यह भी किसी भी ब्रांड या आरटी अभिकर्मकों के प्रकार, किसी भी तापमान (micromixer की सामग्री की सहिष्णुता के भीतर), और समय के किसी भी अवधि शामिल कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, हम आरटी यादृच्छिक hexamer या oligo-dT प्राइमरों की प्रतिक्रियाओं से सुधार सीडीएनए पैदावार मनाया गया है. यह भी अन्य जैव रासायनिक परिवर्तनों (जैसे डीएनए संकरण 15) निम्नलिखित की कमी के अनुरूप लागू किया जा सकता है . मौजूदा तकनीक के मुख्य बाधा है प्रतिक्रिया समाधान के एक छोटे ड्रॉप है कि एक घुमावदार इंटरफ़ेस तरल हवा (जैसे एक meniscus) रूपों (microliter) के भीतर होने चाहिए. हम नियमित रूप से 200μL पतली दीवारों पीसीआर नलियों में 10 या 25μL की मात्रा का उपयोग करने के लिए 4.7 या 6.9mm, वक्रता के radii के साथ menisci क्रमशः उत्पादन. यह एक भंवर ड्रॉप, जो अलग अलग समाधान के बीच अंतरफलक elongates में सेट किया जा प्रवाह के लिए एक सामान्य आवश्यकता है और प्रसार कम timescales पर जगह लेने के लिए अनुमति देता है. यह बाधा इसलिए सभी स्थितियों में जो micromixing इस्तेमाल किया जा सकता है पर लागू होता है है. दरअसल छोटे संस्करणों का उपयोग एक लाभ हो सकता है क्योंकि अक्सर इनपुट सामग्री (जैसे शाही सेना डीएनए) की राशि सीमित है, कर सकते हैं अधिक महत्वपूर्ण बचत अन्य अभिकर्मकों पर बनाया जा सकता है है. आरटी प्रतिक्रिया पैदावार में सुधार के विशिष्ट संदर्भ में प्रतिक्रिया mRNA की एक सीमित राशि भी शामिल करना चाहिए. हम पता चला है कि micromixing मानक प्रयोगशाला आरटी इनपुट शाही सेना के एकल कक्ष मात्रा शामिल प्रतिक्रियाओं (मिलाते हुए, vortexing या trituration) मिश्रण, Nurr-1 सचित्र की तुलना में अन्य जीनों के लिए शामिल करने के मानक तरीकों पर लगभग 10 100 गुना द्वारा अपने सीडीएनए उपज बढ़ जाती है यहाँ 14. हम यह भी पता चला है इस सुधार के रूप में इनपुट शाही सेना की एकाग्रता में बढ़ जाती है 14 में घट जाती है. मुमकिन है इस है क्योंकि उच्च शाही सेना सांद्रता में, micromixing के अभाव में प्रसार की वृद्धि दर सुनिश्चित करता है अधिक mRNA सीडीएनए में बदल जाती है पहले यह degrades.

micromixing विधि उच्च विश्वस्तता प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया समाधान के लिए जहाज के माध्यम से ध्वनिक संकेत के संचरण से लाभ होगा. हम एक्रिलिक थाली में मिश्रण छेद (चित्रा 1) ऐसी थी कि वे ठीक 200μL पतली दीवारों पीसीआर इस्तेमाल ट्यूब फिट पतला थे overlying वक्ताओं सावधान मशीनिंग द्वारा इस लक्ष्य को हासिल करने में मदद की. इस ट्यूब और एक्रिलिक थाली और ध्वनिक संकेत इसलिए अधिकतम संचरण के बीच संपर्क maximized. एक भी करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया ट्यूबों सुरक्षित मिश्रण छेद के भीतर आयोजित की जाती हैं क्योंकि वे बाहर यांत्रिक कंपन का एक परिणाम के के रूप में मिश्रण के दौरान आ सकता है की जरूरत है.

ध्वनिक microstreaming की हमारी परिभाषा संभवतः कुछ phenomenologically आधारित परिभाषाओं से व्यापक है. हालांकि, वहाँ 16 रिले द्वारा एक अच्छी समीक्षा है कि इन प्रवाह मौलिक phenomenologically बजाय वर्गीकृत है . Navier - स्टोक्स समीकरण nonlinear अवधि के लिए पर्याप्त इतनी बड़ी है कि दूसरा आदेश पर एक मतलब प्रवाह है हो गया है. चूंकि उस शब्द एक वेग वेग ढाल बार, हम लंबाई पैमाने है जिस पर वेग पर्याप्त छोटा बदलता है (यानी पर्याप्त रूप से बड़े वेग ढाल बनाने) एक microstreaming प्रवाह करने के लिए जन्म दे सकता है कुछ है. हमारे ध्वनिक डिवाइस microstreaming आधारित micromixer ("") ऑडियो आवृत्तियों (यानी कम शक्ति) को सुनिश्चित करना है प्रणाली 13 वक्रता एक छोटे त्रिज्या के साथ एक तरल हवा अंतरफलक है द्वारा ध्वनिक microstreaming सक्षम बनाता है. इसके विपरीत, "ध्वनिक स्ट्रीमिंग" अक्सर एक nonlinear शब्द बना है कि एक बड़े वेग (यानी उच्च शक्ति) द्वारा बड़े द्वारा परिभाषित किया गया है. हमारे मामले में, एक अच्छी तरह से में एक छोटे से ड्रॉप करने के लिए दोलन किया जाता है, ड्रॉप की सतह तनाव, इसकी चिपचिपाहट के साथ, एक मतलब 13 मिश्रण करने के लिए उपयोगी प्रवाह पैदा करने में एक भूमिका निभा सकते हैं. प्रयोगों भी पता चला है कि बड़े कण (10 100μm) बड़े हिल बूंदों की तुलना में हम प्रयोग के भीतर ले जाया जा सकता है, लेकिन यह शायद एक अलग तंत्र द्वारा 17 कणों को विशिष्ट है.

अंत में, मानक प्रयोगशाला आरटी शाही सेना के एकल कोशिका मात्रा शामिल प्रतिक्रियाओं micromixing का आवेदन नाटकीय रूप से अपने सीडीएनए उपज में वृद्धि के लिए एक प्रभावी तरीका है. इस सुधार पर और क्या मिश्रण microliter संस्करणों वर्तमान में उपलब्ध तरीकों (मिलाते हुए, vortexing या trituration अर्थात्) का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है ऊपर है. हालांकि वहाँ कई परिस्थितियों हैं जिसमें microfluidics आधारित प्रदर्शन आरटी एक महान अग्रिम, अन्य परिस्थितियों में, हमारे अपने सहित, अकेले micromixing उपकरणों और विशेष उपकरणों और तरीकों के लिए आवश्यकता के बिना महत्वपूर्ण और पर्याप्त लाभ प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (परियोजना को कोई अनुदान 6,288,480) और Scobie और क्लेयर MacKinnon ट्रस्ट द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit Arcturus Bioscience KIT0204 The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents Ambion AM1906M
Random hexamer primers Promega Corp. C1181
AMV-RT Promega Corp. M5101
dNTP set Promega Corp. U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega Corp. N2111
Nuclease-Free Water Promega Corp. P1193
SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer. Thermo Fisher Scientific, Inc.
Corbett Rotor Gene RG-6000 Corbett Life Science Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008

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References

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