Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

Bioengineering

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Summary

Dieses Video gibt einen detaillierten Protokoll für die Untersuchung der pharmakologischen Profil des menschlichen TRPA1 Kanäle mit FlexStation 3. Das Protokoll umfasst Einzelheiten Zellpräparation, Farbstoff Laden und Betrieb der Mikroplatten-Reader, FlexStation 3.

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Luo, J., Zhu, Y., Zhu, M. X., Hu, H. Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3. J. Vis. Exp. (54), e3149, doi:10.3791/3149 (2011).

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Abstract

Die Molecular Devices "FlexStation 3 ist ein Tischgerät Multi-Mode Mikroplatten-Reader mit einer automatisierten Fluoreszenz-Messung in Multi-Well-Platten. Es ist ideal für mittel-bis High-Throughput-Screens in einem akademischen Umfeld. Es verfügt über einen integrierten Fluid-Transfer-Modul mit einer Multi-Channel-Pipette und die Maschine liest eine Spalte in einer Zeit, zur Fluoreszenz Veränderungen einer Vielzahl von fluoreszierenden Reagenzien-Monitor ausgestattet. Zum Beispiel hat FlexStation 3 wurde verwendet, um die Funktion der Ca 2 +-permeable Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren durch die Messung der Veränderungen der intrazellulären freien Ca 2 +-Spiegel zu studieren. Transient receptor potential (TRP)-Kanäle sind eine große Familie von nicht selektiven Kationen-Kanäle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen und pathophysiologischen Funktionen. Die meisten der TRP-Kanäle sind Kalzium durchlässig und induzieren Calcium-Einstrom bei Aktivierung. In diesem Video zeigen wir die Anwendung der FlexStation 3, um die pharmakologische Profil der TRPA1 Kanal, einen molekularen Sensor für zahlreiche schädliche Reize zu studieren. HEK293-Zellen transient oder stabil exprimieren menschliches TRPA1 Kanäle, in 96-well-Platten kultiviert, sind mit einem Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4, und Echtzeit-Fluoreszenz-Veränderungen in diesen Zellen geladen werden, vor und während der Anwendung gemessen ein TRPA1 Agonist mit dem FLEX-Modus des FlexStation 3. Die Wirkung eines mutmaßlichen TRPA1 Antagonisten wurde ebenfalls untersucht. Die Daten stammen aus der SoftMax Pro-Software übertragen, um Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen von TRPA1 Aktivatoren und Inhibitoren konstruieren.

Protocol

1. Zellpräparationen in 96-Well-Platten

Für HEK293-Zellen transient mit menschlichen TRPA1 cDNA trasfected

  1. HEK293-Zellen sind für 1-2 Tage in Minimal Essential Dulbecco Medium (DMEM) mit 4,5 mg / ml Glucose (Thermo Scientific, SH3002201), mit 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Kälberserum (Invitrogen, 16000-044) ergänzt, 50 Einheiten angewachsen / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin (Invitrogen, 15140-163). Am Tag der Transfektion sollten die Zelldichte zu erreichen 70-90%.
  2. Coat 96-Well-Platten mit einer Pipette 50 pl Poly-L-Ornithin (Sigma P3655, 20 pg / ml in sterilem destilliertem Wasser) in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für mindestens 15 min. Spülen Sie jede Vertiefung einmal mit Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) ohne Mg 2 + und Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). Die Platte kann in der Zellkultur Motorhaube für ein paar Stunden verlassen werden.
  3. Für jede Vertiefung einer 96-Well-Platte in ein 1,5-ml Eppendorf-Röhrchen 0,2 ug cDNA in 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070) zu verdünnen. Scale up anteilig nach der Anzahl von Brunnen, die von der gleichen cDNA transfiziert werden. Auch in einem separaten 1,5-ml Eppendorf-Röhrchen 0,4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) in 25 ul OPTI-MEM für jeden gut transfizieren zu verdünnen. Scale-up dieser nach der Gesamtzahl der Brunnen transfiziert werden.
  4. Kurz Wirbel der verdünnten cDNA und Lipofectamine 2000 und lassen Sie sie bei Zimmertemperatur sitzen für ca. 5 min.
  5. Übertragen eines gleichen Volumens der verdünnten Lipofectamine 2000 an die Röhre, die verdünnte cDNA, Wirbel enthält, und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur stehen lassen für 15 min bis 2 Stunden. Während dieser Zeit, übertragen Sie die cDNA / Lipofectamine 2000 Mischung bei 49 ul / well auf die poly-L-Ornithin beschichteten Platte.
  6. Trypsinize der HEK293-Zellen (Schritt 1,1), count Zelldichte mit einer Zählkammer oder Gräfin automatisierte Zellzahl (Invitrogen, C10227), und übertragen die gewünschte Menge an Zellen (in der Regel etwa ~ 125,000-150,000 Zellen / well) zu einem 15-ml sterile konisch-bottom Zentrifugenröhrchen. Bei 1000 x RPM für 5 min. Die Zellen bei ~ 1,250,00-1,500,000 Zellen / ml in DMEM Kulturmedium mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum, aber ohne Antibiotika.
  7. Dispense 98 ul Zellsuspension in jede Vertiefung, dass die cDNA-Lipofectamine 2000 Mischung mit einem Mehrkanal-Pipette oder die MICROFILL Microplate Dispenser (Bio-Tek) enthält. Lassen Sie die Platte in der Haube sitzen für mindestens 30 min, bevor es auf die befeuchtete Zellkulturbrutschrank. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 20-44 Stunden.

Für HEK293-Zellen stabil exprimiert TRPA1

  1. Folgen Sie Schritt 1.2 zu beschichten 96-Well-Platten.
  2. Die induzierbaren HEK293-hTRPA1 Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) zur Verfügung gestellt und gepflegt in dem gleichen Medium wie die Wildtyp-HEK293-Zellen (Schritt 1,1), aber ergänzt mit 5 pg / ml Blasticidin (Invitrogen, A1113902) und 50 pg / ml Hygromycin B (Invitrogen, 10687010). Wenn die Zelldichte etwa 90% erreicht, trypsinize Zellen zählen Zelldichte und zentrifugieren Sie die gewünschte Menge an Zellen bei 1000 x RPM für 5 min. Die Zellen in einer Dichte von ~ 1.000.000 Zellen / ml in der gleichen Kulturmedium mit Doxycyclin (Fisher, BP26535, 0,25 pg / ml) ergänzt.
  3. Dispense die Zellsuspension auf Poly-L-Ornithin beschichteten Platten bei 100 ul / well mit einem Mehrkanal-Pipette oder die MICROFILL (Bio-Tek). Lassen Sie die Platte in der Haube sitzen für mindestens 30 min, bevor es auf die befeuchtete Zellkulturbrutschrank. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 16 bis 24 Stunden.

2. Lösungen

  1. Hanks Salzlösung (HBSS) ist als die extrazelluläre Lösung verwendet. Es enthält (in mM): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44
    KH 2 PO 4, 1,3 CaCl 2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 Glucose, 10 HEPES mit pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit 1 N NaOH).
  2. Fluo-4-Assay-Puffer enthält 2 mM in HBSS Probenecid. Machen Sie 250 mM Lager Probenecid (Sigma, P8761) in 0,5 N NaOH. Verdünnen, um HBSS bei einem Verhältnis von 1:125. Nachstellen pH auf 7,4 mit 1 N HCl.

3. Zell-Beladung mit Fluo-4 AM

  1. 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) in 912 ul wasserfreiem DMSO zu einer Stammlösung von 1 mM zu machen. Die Fluo-4 AM Stammlösung bei -20 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden.
  2. Mix 10 ul 1 mM Fluo-4 AM mit 10 ul Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) Lösung in DMSO) und dann den gesamten Inhalt auf 5 ml Fluo-4-Assay-Puffer (Schritt 2,2) ergänzt mit 0,1% Rinderserumalbumin (Sigma, A9418).
  3. Wash-Zellen in 96-well-Platten kultiviert (Schritt 1,7 oder 1,10) mit HBSS auf 80 ul / well 2 mal mit einem Mikrotiterplatten-Scheibe (wie ELx405TM von Bio-Tek).
  4. Fügen Sie die Fluo-4 AM loading-Lösung (Schritt 3,2) bei 50 ul / Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette oder die MICROFILL (Bio-Tek) und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 1 Stunde.
  5. Wash-Zellen 3 mal mit dem Fluo-4-Assay-Puffer (Schritt 2.2.) Mit dem ELx405TM Mikroplatten Washer. Nach der letzten Waschung, verlassen 80 ul der Fluo-4-Assay-Puffer in jede Vertiefung.

4. Herstellung der Verbindung Platte

  1. Während der 1 Std. Zelle Belastungsdauer, bereiten eine Reihe von 3x Verdünnungen von Agonisten (oder Antagonisten) 3x des gewünschten Endkonzentrationen in der Fluo-4-Assay-Puffer.
  2. Pipette 250-300 ul der verdünnten Verbindung Lösungen für eine 96-Well-Platte Verbindung. Ordnen Sie die serielle Verdünnungen einer Verbindung und die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen in der gleichen Spalte der Verbindung Platte haben, wann immer es möglich ist, weil FlexStation 3 lautet einer einzigen Spalte zu einer Zeit.

5. Mikrotiterplatten in FlexStation 3

  1. Schalten Sie das System (FlexStation 3, Computer, und die SoftMax Pro 5.2-Software)
  2. Sparen Sie das Experiment mit einem neuen Dateinamen. Auf der Set-up, wählen FLEX-Modus und geben Sie die folgenden Werte:

Protokoll Nr. 1, agonistische Wirkung
Tabelle 1

Protokoll Nr. 2, Antagonist Wirkung
Tabelle 2

  1. Legen Sie einen neuen Tipp-Box, Verbindung Platte und das Lesen Platte auf die entsprechenden Fächer in FlexStation 3 und klicken Sie auf "read"-Taste. Die FlexStation 3 wird eine Spalte in einer Zeit gelesen, und fügen Sie Verbindungen zu den vorprogrammierten Zeitpunkten ohne Unterbrechung der Lektüre. Es dauert ca. 3 min (5 min zu Protokoll Nr. 2) zu Ende lesen eine Spalte und die Maschine wird weiter in die nächste Spalte mit der Verbindung Ergänzungen durchgeführt, wie durch den Benutzer in Schritt 5.2 programmiert, bis alle Spalten gelesen werden gelesen.

6. Datenanalyse

  1. Experimentelle Daten können verarbeitet werden direkt über die SoftMax Pro 5.2 Software oder kopiert und in einem beliebigen Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft Excel werden. Konzentrations-Wirkungs-Kurve eines TRPA1 Agonist Flufenaminsäure (FFA) wird unter Verwendung der folgenden kleinsten Quadrate Routine. Gleichung 1 , Wobei Y der beobachteten Reaktion ist, Y max die normierte maximale Reaktion ist, C die entsprechenden Wirkstoffkonzentration ist, EC 50 die Konzentration, die eine halbmaximale Reaktion hervorgerufen, und n H ist die scheinbare Hill-Koeffizient. Konzentrations-Hemmung Kurve für einen vermeintlichen TRPA1 Antagonist Verbindung A wird durch die Verwendung einer festen Konzentration von FFA (100 uM), und die schrittweise Erhöhung der Konzentration der Verbindung A IC 50-Wert der Verbindung A wird von der kleinsten Quadrate, die wie folgt berechnet erhalten Gleichung. Gleichung 2 , Wobei Y der beobachteten Reaktion und Y max ist Peak-Ansprechen normalisiert [Ant] ist die entsprechende Verbindung A die Konzentration, ist IC 50 der Antagonist-Konzentration, die eine halbmaximale Hemmung der FFA-evozierte produziert und n H ist die scheinbare Hill Koeffizient.

7. Repräsentative Ergebnisse:

TRPA1 ist ein Ca 2 +-permeable Kationen-Kanal, Aktivierung, die Calcium-Einstrom, die von der Ca 2 +-sensitiven Farbstoffs, Fluo-4 (1-2) nachgewiesen werden kann führt. Ein HEK293-hTRPA1 stabile Zelllinie wurde verwendet, um die Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen von TRPA1 Agonisten und Antagonisten zu studieren. Die Zellen wurden mit Fluo-4 AM geladen, platziert in 80 ul des Assay-Puffer und liest mit FlexStation 3. Nach der Aufnahme der Grundlinie Fluoreszenz für 30 s wurden 40 ul einer Verdünnungsreihe des TRPA1 Agonist, FFA, jeweils 3x von der gewünschten Endkonzentration, um die Zellen durch ein Multi-Channel-Pipette hinzugefügt enthalten, da ein Teil der Fluidik-Modul von FlexStation 3. Die Fluoreszenz-Änderungen wurden für weitere 180 s. überwacht (- F 0 F), wo F und F 0 sind Fluoreszenz-Werte zum Zeitpunkt der Zins-und dem Beginn der Lektüre, bzw. die relative Fluo-4 Fluoreszenz-Änderungen für jedes Well wurden als AF = ausgedrückt. Vertreter Spuren der Zeit Kurse zur Fluoreszenz Veränderungen als Reaktion auf eine Reihe von FFA-Konzentrationen sind in Abb.. 1. Hinweis für die letzten vier FFA-Konzentrationen, wobei die maximale Reaktion Ebenen ähnlich sind, die Aktivierung Kinetik deutlich schneller an der höher ist als an der unteren FFA-Konzentrationen ist. Daher unterscheiden diese Unterschiede, die Konzentration - Wirkungs-Beziehung wurde durch Messung der Anfangsgeschwindigkeiten (Steigung) der Fluoreszenz, der bei Zugabe verschiedener Konzentrationen von FFA (Abb. 2) konstruiert. Die Hälfte der maximalen Wirkungive Konzentration (EC 50) der FFA war entschlossen auf 55,4 uM (n = 3). Um zu testen, die vermeintliche TRPA1 Antagonist, Verbindung A, führten wir ein ähnliches Experiment mit dem Protokoll Nr. 2 (Schritt 2). In diesem Fall wurden eine Reihe von Verdünnungen des Antagonisten bei 30 s (40 ul von 3x gewünschten Endkonzentrationen) zugegeben und die FFA wurde 180 s später (60 l bei 300 uM für eine endgültige Konzentration von 100 pM) aufgenommen. Compound A dosisabhängig reduziert die Reaktion der Zellen auf TRPA1 FFA mit einer Hälfte der maximalen Hemmkonzentration (IC 50) von 4,3 uM (n = 3) (Abb. 2).

Abbildung 1
Abbildung 1. Konzentrations-abhängige Aktivierung des menschlichen TRPA1 durch FFA. Die Spuren sind FFA-evozierte Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Zeit (nur Reaktionen in den ersten 60 s gezeigt werden zur besseren Veranschaulichung der schnellen Kinetik der FFA-evozierte Potentiale). Bitte beachten Sie, dass bei höheren Konzentrationen FFA Fluoreszenzerhöhung evoziert mit einer viel schnelleren kinetischen als bei niedrigeren Konzentrationen, obwohl der Peak-Fluoreszenz ähnlich sind.

Abbildung 2
Abbildung 2 Konzentration -. Wirkungs-Beziehungen für FFA-induzierte Fluoreszenz verändern und Verbindung A-induzierten Hemmung der FFA Reaktion in menschlichen TRPA1 stabil in HEK293 Zellen exprimiert. Δ, die Konzentration - Wirkungs-Beziehung der FFA wurde durch Messung der Anfangsgeschwindigkeiten (Steigung) der normierten Fluoreszenz-Anstieg bei Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von FFA bestimmt. O, Konzentrations-Wirkungs-Beziehung der Inhibition der FFA-evozierte Kalzium Antwort von einem vermeintlichen TRPA1 Antagonist Verbindung A.

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Discussion

Intrazelluläre Ca 2 + spielt eine wichtige Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, wie die Freisetzung von Neurotransmittern (3), kardiale Aktionspotential (4), Muskelzelle Kontraktion (5), Zell-Signaltransduktion (6-7), und excitotoxic Zelltod ( 8). Die Messung der intrazellulären Ca 2 +-Spiegel hilft, funktionelle Veränderungen der Ca 2 +-permeable Kanäle in der Plasmamembran oder intrazellulären Organellen und der Beitrag der Aufklärung
Ca 2 + auf die oben genannten Prozesse (9-13). Der Test kann auch verwendet werden, um die Funktion der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu untersuchen, von denen viele, bei Aktivierung, führen zu einer erhöhten intrazellulären freien Ca 2 +-Konzentrationen durch die Freigabe Ca 2 + aus intrazellulären Ca 2 + speichert oder die Aktivierung anderer Ca 2 + permeable Ionenkanäle (14-16). FlexStation 3 nutzt Ca 2 + Farbstoffe, die Anlass zu einer erhöhten Fluoreszenzintensität oder ratiometrisch Veränderungen, wobei der Anstieg der intrazellulären Ca 2 +-Konzentration. Dieses Video Artikel veranschaulicht die Anwendung der FlexStation 3 in das Studium der Ca 2 +-permeable Kanäle TRPA1 heterolog in HEK293 Zellen exprimiert. Obwohl wir nur 96-Well-Platten zur Demonstration verwendet haben, können Benutzer auf einfache Weise von 96 zu wählen - oder 384-Well-Platte formatieren, indem Sie den Verzicht pipetters (8 - oder 16-Kanal). Dieser Test ermöglicht eine schnelle mittel-bis Hochdurchsatz-Screening-Fähigkeit von Agonisten und / oder Antagonisten und gilt für viele andere Ca 2 +-permeable Ionenkanäle. Allerdings ist anzumerken, dass intrazellulären Calcium-Assay eine indirekte Messung der Ionenkanal-Aktivitäten ist. Detaillierte Follow-up-Studien mit Patch Clamp Messungen direkt zu messen ionische Strom in der Zellmembran sind noch erforderlich, um geeignete Schlussfolgerungen zu ziehen.

Um zuverlässige Datenqualität, sollten die folgenden Vorkehrungen getroffen werden:

  1. Für lose anhaftenden Zellen, wie HEK293-Zellen, die Beschichtung der Platten ist von wesentlicher Bedeutung. Doch bei stark anhaftenden Zellen, wie z. B. Chinesischen Hamsters (CHO)-Zellen oder HeLa-Zellen, ist die Beschichtung nicht nötig.
  2. Es ist wichtig, dass gleiche Anzahl von Zellen in jeder Vertiefung der Multi-Well-Platte und die Zelldichte in jedes Well ausgesät werden sollte zwischen 90-100% Konfluenz zum Zeitpunkt des Tests sein.
  3. Gently Flüssigkeit abgeben, um die Zellen und stören die Zellen beim Laden und Waschen der Zellen.
  4. Probenecid wird hinzugefügt, um Farbstoff Auslaufen zu verhindern. Da jedoch Probenecid hat auch Auswirkungen auf einige Ionenkanäle, ist Vorsicht geboten bei der Interpretation von Daten aus Experimenten, die in der Assay-Puffer Probenecid gehören eingeholt werden.
  5. Zur Bestimmung der Verbindung Konzentrationen in der Verbindung Platte, sollten Sie die Verdünnungsfaktor für jede Vertiefung nach dem Puffervolumen in den entsprechenden Schacht der Probenplatte vor und nach der Verbindung hinaus.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris und Olga Tschumakowa für ihre Unterstützung. Die FlexStation 3-System ist Teil des UTHSC Cytodynamic Imaging Facility. Wir danken auch Drs. Ardem Patapoutian und Michael Bandell vom Scripps Research Institute und Genomics Institute der Novartis Research Foundation (GNF) für die Bereitstellung der HEK293-hTRPA1 stabile Zelllinie. Die Forschung wird zum Teil durch Zuschüsse aus NIH (GM081658 zu MXZ) und Texas Medical Center Digestive Diseases Center (HH) und Mission Connect / TIRR Foundation (HH) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FlexStation 3 Molecular Devices FLEX3
96-Well, FlexStation Pipet Tips Molecular Devices 9000-0912
96-Well Plates Greiner Bio-One 655090
96-Well Clear Flat Bottom plates Costar 3595
DMEM Invitrogen 12430-104
Opti-MEM Invitrogen 31985-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Fluo-4 AM Invitrogen F14202
PluronicF-127 Invitrogen P3000MP
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P36551
probenecid Sigma-Aldrich P8761
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418

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References

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