Криоконсервация эмбрионов мыши на этиленгликоля основе Витрификация

Biology
 

Summary

Этиленгликоль метода, основанного на стеклования для эмбрионов мыши описано. Это выгодно с другими методами в своей простоте и низкой эмбриональной токсичности, и, следовательно, могут быть широко применимы ко многим линий мышей, в том числе инбредных и генно-модифицированных мышей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mochida, K., Hasegawa, A., Taguma, K., Yoshiki, A., Ogura, A. Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification. J. Vis. Exp. (57), e3155, doi:10.3791/3155 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Криоконсервация эмбрионов мыши является технологической основой, поддерживающей биомедицинских наук, потому что много линий мышей были произведены генетические изменения и число постоянно увеличивается из года в год. Его техническое развитие началось с медленного замораживания методы в 1970-х годов 1, затем следуют стеклования методы, разработанные в конце 1980 года 2. Как правило, последний метод является выгодным в его быстрота, простота и высокая живучесть восстановленных эмбрионов. Тем не менее, криопротекторов содержащихся обладают высокой токсичностью и может повлиять на дальнейшее развитие эмбриона. Таким образом, техника не относится к определенной линий мышей, даже если решения охлаждают до 4 ° С для смягчения токсического действия во время обработки эмбрионов. В центре RIKEN биоресурсов, более 5000 мышей штаммов с различным генетическим фоном и фенотипы сохраняются 3, и, следовательно, мы оптимизировали стеклования тэchnique с которой мы можем cryopreserve эмбрионов из разных линий мышей, с преимуществами высокую выживаемость эмбрионов после витрификации и оттаивания (или сжижения, точнее) при температуре окружающей среды 4.

Здесь мы представляем стеклования метод эмбрионов мыши, которая была успешно использована в нашем центре. Криоконсервация решение содержит этиленгликоль вместо ДМСО, чтобы минимизировать токсичности для эмбрионов 5. Он также содержит Ficoll и сахарозы для предотвращения расстеклование и осмотического регулировки, соответственно. Эмбрионы могут быть обработаны при комнатной температуре и переданы в жидком азоте в течение 5 мин. Потому что оригинальный метод был оптимизирован для пластиковой соломинки, как контейнеры, мы несколько изменили протокол для cryotubes, которые являются более доступными в лабораториях и более устойчивы к физическим повреждениям. Мы также описать процедуру оттаивания эмбрионов керамической подробно, потому что это критический стер для эффективного восстановления живых мышей. Эти методики будут полезны для исследователей и техников, которые нуждаются в сохранении мыши штаммов для дальнейшего использования в безопасных и экономически эффективным образом.

Protocol

Общая схема эксперимента приведена на рис. 1.

1. Подготовка реагентов

  1. Сделать базу среде (здесь в известный как PB1) в 100 мл стеклянную бутылку в соответствии со следующей таблице ниже:
    МВт мМ мг/100мл
    NaCl 58,4 136,98 800,0
    KCl 74,6 2,68 20,0
    KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0
    Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1
    MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0
    180,2 5,56 100,0
    Na пирувата 110 0,33 3,6
    CaCl 2 2H 2 O 147 0,9 13,2
    Пенициллин G 6.0 (приблизительно)
  2. Сделать Ficoll-сахарозы (FS) решение:
    1. Добавить следующие химические вещества до 14 мл PB1 решение в 50 мл трубки.
      Ficoll 70 6,0 г
      Сахароза 3,424 г
      BSA 42,0 мг
    2. Смешайте Ficoll 70 и сахарозы в PB1 решения и взболтать до полного растворения.
    3. После проверки полного растворения выше, добавить BSA на поверхности раствора и держать его на4 ° С до BSA полностью растворяется (> 4 часа или на ночь).
  3. Сделать уравновешивания раствора (EFS20) и стеклования решение (EFS40) в 50 мл трубки:
    • EFS20: 20% (объем / объем) этиленгликоль, 24% (вес / объем) Ficoll и 0,4 моль / л сахарозы в PB1 с BSA
    • EFS40: 40% (объем / объем) этиленгликоль, 18% (вес / объем) Ficoll и 0,3 моль / л * сахарозы в PB1 с BSA
      * Для получения эмбрионов из штамма BALB / с или ICR, повышают концентрацию сахарозы до 0,9 моль / л сахарозы, потому что они более чувствительны к криоповреждения 6.
    EFS20 решение EFS40 решение
    Этиленгликоль 1 мл 2 мл
    FS решение 4 мл 3 мл
  4. Стерилизовать раствор фильтрации с использованием 0,45 мкм filteг. Сделать аликвоты в 5 мл пробирки полистирола и хранить при 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 6 месяцев.
  5. Подготовка эмбриона оттаивания раствора, содержащего 0,75 М сахарозы (TS1)
    1. Растворите 7,7 г сахарозы в PB1 (подготовлен в шаге 1.1) и довести общий объем до 30 мл. Смешать, осторожно встряхивая, пока сахарозы полностью не растворится.
    2. Добавить 90 мг BSA на поверхность раствором и оставьте стоять до полного растворения.
    3. Стерилизовать раствор путем фильтрации.
    4. Алиготе и хранить при температуре 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 1 месяца.

    Примечание: TS1 также могут быть получены из имеющихся в продаже М2.
    1. Растворите 7,7 г сахарозы в М2 и довести общий объем до 30 мл.
    2. Смешать, осторожно встряхивая, пока сахарозы полностью не растворится.
    3. Стерилизовать раствор путем фильтрации.
    4. Алиготе и хранить при температуре 4 °. Они могут быть использованы в течение 1 месяца.
  6. TS2 (оттаивания решениесодержащем 0,25 М сахароза):
    1. Развести 10 мл TS1 с 20 мл объема PB1 или M2, по мере необходимости.
    2. Алиготе и хранить при температуре 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 1 месяца.

2. Остекловывание 2-клетки эмбрионов мыши

  1. Подготовка 2-клетка эмбриона мыши, естественного спаривания или обычный в технике искусственного оплодотворения.
  2. Алиготе 50 мкл EFS40 в криоскопической пробирки. Здесь и далее выполнять остальные стеклования процедуру при комнатной температуре.
  3. Алиготе 50 мкл EFS20 в нижней части 35 мм или 60 мм пластиковые чашки Петри.
  4. Трансфер до 30 эмбрионов EFS20 использованием стеклянный капилляр только с минимальным количеством питательной среды. Начало таймер на 2 мин.
    Примечание: Место эмбрионов в нижней части капли. Это делает эффективным обезвоживание эмбрионов. Проверьте морфология эмбрионов путем стереомикроскопа. Обезвоженная эмбрионов показать сморщенные морфологии, как показано на рис. 2А.Если они не будут достаточно обезвоженная, ждать больше 1 или 2 мин.
  5. Примерно в 1,5 мин, забрать эмбрионов из EFS20 падение только с минимальным количеством раствора. Передача их в EFS40 криоскопической пробирки подготовлен в шаге 2.1. Примечание: Для достижения наилучших результатов, корректировать сроки подбирая эмбрионы так, что все эмбрионы могут быть перенесены в EFS40 около 2 мин.
  6. Подождите 1 мин.
  7. Положите криоскопической пробирки непосредственно в жидкий азот (LN 2).

3. Размораживание керамические 2-клетки эмбрионов мыши

  1. Перед оттаиванием, готовить блюда по 10 мкл капли эмбриона питательной среды для восстановленных эмбрионов (см. шаг 3.13). Обложка блюдо с маслом и поставить в CO 2 инкубаторе до использования. Примечание: Несмотря на любых носителях для рутинных культуры эмбриона могут быть использованы в этом опыте, мы рекомендуем средства массовой информации с более высокой осмолярности, такие как средний М16.
  2. Теплый TS1 до 37 ° C.
  3. Наденьте маску и cryogloves. Открытое Л. Н. 2 тАНК и извлекать криоскопической пробирки содержащие эмбрионов.
  4. Быстро открывает верхней части трубки и отбросить LN 2. Подождите 30 секунд, чтобы предотвратить TS1 от замерзания на следующий шаг.
  5. Используйте 1000ul пипетки добавить 850 мкл TS1 (37 ° С) в трубку и перемешать раствор, осторожно pipettings (примерно в десять раз в 25 секунд), пока раствор равномерно растворились.
  6. Передача весь объем трубки 60 мм пластиковые чашки Петри (или часовое стекло) (рис. 3А). Примечание: Эмбрионы должны обрабатываться при комнатной температуре (22-25 ° С), пока они не помещаются в CO 2 инкубаторе на шаге 3.14.
  7. Начало таймер на 3 мин.
  8. Около 2 мин в TS1, встряхните блюдо, пока среда, содержащая эмбрионы распространяется на поверхности чашки (рис. 3В). Примечание: Это поможет эмбрионов спуститься на дно, потому что они плавают у поверхности при передаче на TS1.
  9. Положите три 50 мкл капли TS2 на гоэлектронной блюдо (рис. 3в).
  10. Через 3 минуты в TS1, проверьте морфология эмбрионов путем стереомикроскопа, они должны быть слегка сморщенным. Смотрите морфология эмбрионов в предыдущих (рис. 2В) и выше (рис. 2) в TS1. Примечание: Если эмбрионов до сих пор опухший, держать их в TS1 более 1 до 3 мин.
  11. Возьмите эмбрионов и передавать их в первую каплю TS2 (рис. 3D). Начало таймер на 3 мин
  12. Через 3 минуты, передачи эмбрионов второго падения, а затем в третьем раскрывающемся (рис. 3Е).
  13. Трансфер эмбрионов к культуральной среде подготовлена ​​на шаге 3.1. Эмбрионы в форму, показанную на рис. 2D.
  14. Место блюдо в CO 2 инкубаторе. Около 10 минут спустя, передача эмбрионов на следующий капли культуральной среде, чтобы смыть сахарозы, которая была перенесена из TS2.
  15. Продолжить культуры в CO2-инкубаторе до переноса эмбрионов.
    Примечание: Передача ЭмбриОС яйцеводы получателя самок на день оттаивания. Длинные культуры в пробирке может уменьшиться жизнеспособность эмбрионов в некоторых линий мышей.

4. Представитель Результаты:

В пробирке - и в естественных условиях развития эмбрионов после оттаивания представлены в таблицах 1 и 2. Преимущества этого протокола высокой живучести эмбрионов после оттаивания и его широкое применение в различных штаммов мышей.

Напряжение Общее количество труб Количество эмбрионов керамической Восстановленные (№ (%)) Морфологически нормальные (№ (%)) Развитию бластоцист (№ (%))
C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87)
BALB / сА 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84)
ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90)

Таблица 1. Экстракорпоральное развития керамических-размороженные эмбрионы в общих линий мышей

Состояние эмбрионов Количество получателей женщин Количество эмбрионов Имплантация сайтов (№ (%)) Живая потомства (№ (%))
Свежий 12 180 141 (78.3) 110 (61.1)
Керамические 16 242 202 (83.5) 125 (51.7)

Таблица 2. В естественных условиях развития керамических-размороженные эмбрионы мышей C57BL/6J.

Рисунок 1
Рисунок 1. Общая схема эксперимента в том числе равновесия, стеклование, и оттаивания эмбрионов.

Рисунок 2
Рисунок 2. Морфологии эмбрионов на каждом этапе размораживания.

Рисунок 3
Рисунок 3. Размораживание процедуры эмбрионы. Все процедуры проводятся при комнатной температуре. (А), добавить 850 мкл TS1 (37 ° С) в криоскопической пробирки и передача всего объема раствора в криоскопической пробирки на пластиковую тарелку. В это время эмбрионы выглядят опухшими, как показано на рис. 2B. (B), Spread решение по поверхности блюдо, осторожно встряхивая. (C), место три 50 мкл капли TS2 на пластиковые тарелки. (D), трансфер эмбрионов первой капли TS2. Через 3 минуты, эмбрионы выглядят shurunken, как показано на рис. 2C. (E), передачи их серийногоLy в оставшиеся TS2 капель, а затем в культуральной среде.

Discussion

С первым докладом мыши витрификации эмбриона Ралль и Fahy в 1985 году 2, ряд технических улучшений было сделано увеличить выживаемость эмбрионов после размораживания. Один из самых успешных модификаций было достигнуто за счет использования ЭГ, как криопротектора из-за его низкой токсичностью и высокой мембранной проницаемости. Такие преимущества позволяют нам справиться замораживания эмбрионов при комнатной температуре 4; другими методами витрификации эмбриона требует передачи при более низких температурах и не всегда применим к некоторым линий мышей в том числе BALB / с 6. Первый этиленгликоля основе стеклования был разработан Касаи и соавт. в 1990 году 5,7. Потому что оригинальный метод был оптимизирован для пластиковой соломинки, как контейнеры, мы несколько изменили протокол для cryotubes, которые являются более доступными в лабораториях и более устойчивы к физическим повреждениям. Таким образом, стеклование метод, описанный здесь, может быть приложениеlicable для многих лабораториях на мышах, как научные исследования моделей. Тот же метод может также использоваться для эмбрионов мыши на морулы и бластоцисты этапы 8 и 9 крысиных эмбрионов. Тем не менее, мы недавно обнаружили, что качество cryotubes может повлиять на выживаемость эмбрионов после замораживания-оттаивания. Таким образом, крайне важно для изучения внутренней поверхности cryotubes для ее гладкости перед витрификации эмбрионов (например, см. в таблице конкретных реагентов и оборудования).

Витрификация методы имеют много преимуществ по сравнению с обычными методами медленного замораживания, но они по своей сути имеют невыгодное положение в отношении транспортировки цели. Как керамической эмбрионы должны храниться при температуре ниже -120 ° С для поддержания их жизнеспособности, сухой грузоотправителей, как правило, используются для их безопасной транспортировки. Сухой грузоотправителей тяжелы и громоздки, и их туда-обратно стоит дорого, особенно для международных перевозок. Сейчас мы находимся в настоящее время разрабатывает новый метод остекловывания покоторые керамической эмбрионы могут храниться при сухого льда температура (около -80 ° С) в течение не менее 7 дней 10. Этот метод должен быть остекловывания следующего поколения.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Данное исследование было проведено в сотрудничестве с Национальным проектом биоресурсов, Министерство образования, культуры, спорта, науки и технологий, Япония.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin Merck & Co., Inc. 12657
Ethylene glycol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 058-00986
Ficoll 70 GE Healthcare 17-0310-10
Glucose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 041-00595
NaCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 191-01665
KCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 163-03545
KH2PO4 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 169-04245
Na2HPO4·12H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 500-04195
MgCl2 ·6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 135-00165
CaCl2 ·2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 031-00435
Penicillin G Sigma-Aldrich P-4687
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P-8574
Sucrose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 196-00015
M16 medium Sigma-Aldrich M7292
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Cryotube Sumitomo Bakelite Co., Ltd. MS-4501 “Cryogenic Vial”

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
  2. Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
  3. Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
  4. Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
  5. Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
  6. Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
  7. Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
  8. Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
  9. Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
  10. Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).

Comments

14 Comments

  1. Please, one question about the medium EFS²0 and EFS40:
    Are they prepared simply using the proportions described in the table EG/FS 1:4 and EGFS ²:5 (table), or is it the another formula described in the text (EFS²0: ²0% (v/v) etthylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA. Thanks in advance .Cleide from Brazil.

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 17, 2012 - 2:23 PM
  2. Thank you for your interesting.
    The first, we prepare FS solution consist of 30% (w/v) Ficoll and 0.5 mol/L sucrose in PB1 with BSA. And mix with ethylene glycol 1:4 or ²:3 for preparation of EFS²0 and EFS40, respectively. Finally, EFS²0 consists with ²0% (v/v) ethylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA.
    Keiji from Japan

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 18, 2012 - 12:44 AM
  3. Thanks Keiji for your response.
    I have another question: what embryo culture medium did you use until cryopreservation?
    You have very good results.
    congratulations
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 18, 2012 - 3:28 PM
  4. I have always used CZB medium (Chatot CL, et al. 1989, J. Reprod. Fertil. 86:679-688) containing 5.6 mM glucose, 0.1 mg/ml PVA, and 3.0 mg/ml bovine serum albumin after IVF for around ²0 hrs and after cryopreservation until embryo transfer.
    The data in table 1 were obtained with CZB medium.
    I also recommend you to use KSOM medium instead of CZB medium.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 20, 2012 - 9:53 PM
  5. Ok Keiji.
    Thank you very much.
    best regards
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 21, 2012 - 9:56 AM
  6. Keiji,
    I'm very interested in your protocol. I've just a question about the preparation of the PB1 solution. Do you just dissolve all the components in the order of your list in 100mL distilled H²0 or do you readjust the pH?
    Thanks in advance.
    Maryline from Belgium

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 6, 2012 - 4:49 AM
  7. Thank you for your interesting.

    About PB1 preparation , you can also find the protocol in the book, "Manipulating the Mouse Embryo" as modified D-PBS.
    We can prepare this solution to dissolve all components in the order of our list.

    However, usually we prepare PBS (-) solution first, which consists of NaCl, KCl, Na²HPO4 and KH²PO4.
    Then, after preparation of x100 concentrated MgCl² and CaCl² solutions, respectively, each 0.1 ml solution are slowly added in 98 ml of PBS(-) solution with gently mixing.
    Because this PBS(+) solution can be stored in refrigerator for several months.
    Before using, we dissolve other reagents, glucose, Na pyruvate and penicillin G.
    This PB1 solution can be used for at least a few weeks by storing in refrigerator.
    In the other hand, we can buy the powder or tablet of PBS(-) from some companies.

    And we do not adjust the pH.

    I hope this coment will be a help for you.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    July 8, 2012 - 11:05 PM
  8. Thank you very much! Your coment is really helpful.
    Maryline

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 9, 2012 - 2:36 AM
  9. Hello,
    I wanted to try this method using 8-cell embryo. I noticed that the freezing media the PB1 is with BSA. How much BSA do you add?

    Thanks,
    Agnes
    Thanks,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2016 - 5:30 PM
  10. Thank you for your interesting.

    PB1 contains 3 mg/ml of BSA. Finally, vitrification solution (EFS40) contains 1.26 mg/ml of BSA.

    And this method is effective for the embryos at each stage from 1-cell to early blastocyst include 8-cell stage.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    April 6, 2016 - 8:30 PM
  11. Hello,
    I tried the procedure but I found out that it is very hard to see the embryos after transferring them in EFS20. They floated and changed shape. I lost half the number of the embryos that I collected. Is there any practical tip that you can tell me to avoid this problem?
    Also, could I harvest the embryos in M2 and freeze them using you freezing media?

    Thanks again.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2016 - 1:22 PM
  12. Thank you for your interesting.

    If you can release embryos with small volume of medium near the bottom of EFS20 solution, you can find all embryos in small area. And we also recommend that it becomes easy to discover embryos at the surface of EFS20 solution by control of the light with the adjustment lever.

    The developmental ability of embryos will decrease at outside of incubator. However, the embryos must be left outside of incubator more than 10 min., the medium contains HEPES (ex. M2, HEPES-KSOM) or PB1 solution should be used.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:13 AM
  13. Hi,

    I think there is a mistake in the step 1.2.1: Add the following chemicals to 14 ml of PB1 solution in a 50 ml tube.
    Shouldn't it be 20ml?

    Thanks,
    Tony

    Reply
    Posted by: Tony N.
    April 28, 2016 - 4:16 AM
  14. Hi, Tony

    You are right.
    Total volume will be 20 ml.
    The conical tube of 50 ml is useful for preparation of this solution.

    Thank you.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:20 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics