यह जानते हुए, अनर्गल चूहे में hyperinsulinemic euglycemic Clamps

Published 11/16/2011
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Medicine
 

Summary

क्लैंप hyperinsulinemic euglycemic, या इंसुलिन क्लैंप, इंसुलिन कार्रवाई का आकलन करने के लिए सोने के मानक

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Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

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Abstract

Protocol

1. कैथेटर और नमूनाकरण पहुँच के लिए माउस एंटीना की तैयारी (मासा tm)

  1. Silastic टयूबिंग की एक 6 सेमी टुकड़ा (0.012 इंच भीतरी व्यास) के रूप में चित्र 1A में दिखाया गया है में एक 1.3 पीई 10 के सेमी टुकड़ा (0.011 इंच भीतरी व्यास) डालने से धमनी कैथेटर तैयार. बेवेल एक स्केलपेल के साथ पीई 10 के टिप ताकि बेवल की नोक के लिए silastic के अंत से लंबाई 0.9 सेमी है.
  2. 1 silastic टयूबिंग मिमी टुकड़ा (0.020 इंच भीतरी व्यास) के रूप में चित्रा 1B में दिखाया silastic (0.012 इंच भीतरी व्यास) टयूबिंग की एक टुकड़ा 6 सेमी का beveled अंत से 1.1 सेमी फिसलने शिरापरक कैथेटर द्वारा तैयार. Silastic के 1 मिमी टुकड़ा एक मनका निरोधक के रूप में प्रयोग किया जाता है.
  3. मासा tm तैयार करने के लिए, दो 3 पीई-20 सेमी टुकड़े (0.015 इंच भीतरी व्यास) में से प्रत्येक में दो 1.3 25 गेज स्टेनलेस स्टील connectors के सेमी टुकड़े के प्रत्येक सम्मिलित.
  4. Silastic के 5 मिमी टुकड़ा फिसलने से एक दूसरे को PE-20/connectors सुरक्षितक्षेत्र है जहां स्टील ट्यूब और पीई-20 को पूरा करने पर टयूबिंग (0.040 इंच भीतरी व्यास).
  5. एक ~ 120 डिग्री कोण इस्पात ट्यूब बेंड और ~ ° 45 द्वारा प्रत्येक ट्यूब अलग.
  6. चिकित्सा सिलिकॉन चिपकने वाला का एक बड़ा टूकड़ा प्लेस में रिग पूरा ऐसी है कि पीई - 20 टयूबिंग खड़ी है और स्टेनलेस स्टील ट्यूब की छोर चिपकने वाला (चित्रा 1C) से परे का विस्तार. इस 24 घंटों के लिए सेट करने के लिए अनुमति दें.

2. सर्जिकल कैथीटेराइजेशन

  1. पहले सर्जरी करने के लिए, 70% इथेनॉल के साथ कैथेटर बाँझ, उन्हें heparinized खारा के साथ भरने (200 यू हेपरिन / एमएल खारा) और स्टेनलेस स्टील प्लग डालें.
  2. माउस anesthetize, अधिमानतः एक तरीका है कि लगातार संवेदनाहारी एजेंट उद्धार (जैसे साँस isoflurane) का उपयोग कर.
  3. बाँझ तकनीक का प्रयोग, कतरनी और / या एक लोमनाशक क्रीम का उपयोग चीरा साइटों से बालों को हटाने और शराब के साथ त्वचा betadine साफ़ द्वारा बाद कीटाणुरहित. कैथेटर प्रविष्टि के लिए, पर बालों को हटानेक्षेत्र में निचले जबड़े से रिब पिंजरे के ऊपर और clavicles बीच का विस्तार. सिर के पीछे कैथेटर के बाह्यीभवन के लिए, खोपड़ी के आधार और interscapular क्षेत्र के बीच क्षेत्र में बालों को हटाने और शराब के साथ त्वचा betadine साफ़ द्वारा बाद कीटाणुरहित.
  4. एक वार्मिंग की सतह पर अपनी पीठ पर माउस और एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के क्षेत्र को देखने के तहत निर्धारित करना. पूंछ और सर्जिकल टेप के साथ extremities सुरक्षित. नाक शंकु संज्ञाहरण पहुंचाने में सिर को सुरक्षित करो.
  5. एक छोटे से खड़ी midline चीरा 5 उरोस्थि के लिए मस्तक मिमी. संदंश का प्रयोग, ऊतक टुकड़े करना करने के लिए बाईं sternomastoid मांसपेशियों बेनकाब कुंद. इस मांसपेशी को प्रतिबिंबित करने के लिए बाईं मन्या धमनी का पर्दाफाश. धीरे बंद धमनी से संयोजी ऊतक तंग. यह इस बिंदु पर महत्वपूर्ण है या तो धमनी या तंत्रिका को नुकसान पहुँचाए बिना धमनी से vagus तंत्रिका अलग.
  6. धमनी पृथक और रेशम सीवन के साथ मस्तक का अंत कटी घमनी को बांधना. शिथिल गाँठ दूसरेसिवनी के उजागर पोत के लांगुलिय अंत पर टुकड़ा.
  7. दुम का अंत पर एक माइक्रो serrefine क्लैंप के साथ पोत दबाना और सिर्फ वसंत कैंची से ligated अंत से नीचे कटौती. ध्यान से कैथेटर के रूप में सम्मिलित क्लैंप के रूप में दूर है. ध्यान क्लैंप सूक्ष्म serrefine रिहाई और silastic - पीई जंक्शन कैथेटर अग्रिम.
  8. दोनों ligatures सुरक्षित कैथेटर और टाई पुष्टि है कि एक नमूना सिरिंज से कैथेटर के मुक्त अंत जोड़ने के द्वारा कैथेटर के नमूने.
  9. एक और चीरा 5 midline के अधिकार के बारे में 2 मिमी और मिमी पहले चीरा के लिए दुम का बनाओ. संदंश का प्रयोग, कुंद को बेनकाब करने और सही गले का शिरा अलग ऊतक टुकड़े करना.
  10. ध्यान से रेशम सीवन के साथ मस्तक का अंत कटी घमनी को बांधना और शिथिल लांगुलिय अंत में सिवनी का एक टुकड़ा टाई.
  11. वसंत कैंची के साथ मस्तक का संयुक्ताक्षर नीचे बस कट और कैथेटर निरोधक मनका ऊपर सम्मिलित है. मनका के पीछे सीवन टाई और कि कैथेटर नमूनों की पुष्टि.
  12. तूआर.एन. पर माउस और कंधे ब्लेड के बीच एक छोटा सा चीरा बनाते हैं.
  13. सुरंग धमनी कैथेटर के लिए चीरा से त्वचा के नीचे एक 14 गेज सुई, माउस के मोर्चे पर पीठ पर interscapular चीरा. धागा सुई के माध्यम से धमनी कैथेटर माउस की पीठ पर अमल में लाना. गले का शिरा कैथेटर के लिए त्वचा के नीचे पीठ पर interscapular चीरा के मोर्चे पर चीरा साइट से माउस के सही पक्ष पर 14 गेज सुई सुरंग द्वारा इस दोहराएँ.
  14. कंधे ब्लेड के बीच चीरा साइट पर एक माइक्रो serrefine क्लैंप के साथ धमनी कैथेटर दबाना. इस क्लैंप ऊपर ~ 1 सेमी कट कैथेटर. स्टेनलेस स्टील माउस के सिर की ओर का सामना करना पड़ connectors के साथ मासा tm रखें. स्टेनलेस स्टील माउस के बाईं ओर की दिशा में बताया संबंधक करने के लिए धमनी कैथेटर कनेक्ट. ध्यान रखना करने के लिए सुनिश्चित करें वहाँ कोई कैथेटर में छेद या kinks. शिरापरक कैथेटर के लिए दोहराएँ,यह स्टेनलेस स्टील माउस के सही पक्ष की ओर इशारा करते कनेक्टर को जोड़ने.
  15. कंधे ब्लेड के बीच चीरा में मासा tm डालें. पीई 20 टयूबिंग गले नस कैथेटर के लिए इसी माउस के दाईं ओर और पीई 20-धमनी कैथेटर के लिए इसी टयूबिंग के बाईं ओर होना चाहिए चाहिए.
  16. नायलॉन सीवन के साथ वेंट्रल और पृष्ठीय चीरों बंद करें. पृष्ठीय समापन के लिए, सिवनी मासा tm के कठोर सिलिकॉन के माध्यम से चलाया जा सकता है यह जगह में सुरक्षित है. एक निस्तब्धता heparinized खारा और एक एंटीबायोटिक युक्त समाधान का उपयोग करने के लिए संक्रमण का खतरा कम से कम कैथेटर की प्रत्यक्षता की पुष्टि करें. तत्काल वसूली के लिए एक गर्म, साफ पिंजरे में रखें माउस चित्रा 2 समाप्त उत्पाद से पता चलता है.
  17. कम से कम 5 दिनों के लिए ठीक करने के लिए माउस को अनुमति दें. वजन और समग्र स्वास्थ्य मॉनिटर. उपयुक्त पोस्ट ऑपरेटिव एनाल्जेसिक आहार का उपयोग के रूप में संस्था पशु देखभाल द्वारा अनुमोदित औरसमिति का प्रयोग करें.

3. Hyperinsulinemic euglycemic - क्लैंप

  1. फास्ट 5-6 के लिए माउस. एक संदर्भ के रूप में, समय टी = 0 मिनट तेजी से और इंसुलिन और ग्लूकोज जलसेक (यानी क्लैंप अवधि) की शुरुआत के अंत करने के लिए संदर्भित करता है.
  2. एक विशिष्ट प्रयोग के लिए सेटअप और समय रेखा 3 चित्र में दिखाया जाता है. जलसेक और नमूना लाइनों के लिए माइक्रो Renathane या समकक्ष टयूबिंग का उपयोग करें. माउस के ऊपर एक दोहरे चैनल कुंडा निलंबित. यह माउस और जलसेक / नमूना सीरिंज के बीच एक हब के रूप में कार्य करता है. प्रयोग के दौरान, माउस एक घर पिंजरे या इसी तरह के कंटेनर में रहता है और कुंडा के लिए tethered.
  3. माउस को जोड़ने से पहले, heparinized खारा साथ धमनी नमूने लाइन भरने (10 यू हेपरिन / एमएल खारा) और रेखा के नीचे अंत में एक स्टेनलेस स्टील संबंधक जगह. Heparinized (समाशोधन सिरिंज) खारा नमूना लाइन के ऊपर से जुड़ा के साथ एक सिरिंज छोड़ो. यह रक्त samp आकर्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगालेस.
  4. गैर heparinized खारा साथ शिरापरक जलसेक लाइन कुंडा के अर्क बंदरगाह (खंड चित्रा 3A में एक) रेखा के नीचे सभी तरह से शुरू भरें. रेखा के ऊपर छोर प्लग और एक स्टेनलेस स्टील संबंधक जगह लाइन के नीचे अंत में (या एक वाई संबंधक अगर एक सांस के लिए प्रशासित किया जाना है). यदि एक समस्थानिक ग्लूकोज ट्रेसर (जैसे [3 - 3 एच] ग्लूकोज) संचार किया जा रहा है, एक 1 मिलीलीटर एक जलसेक सिरिंज सिरिंज युक्त ट्रेसर सुरक्षित. खारा के बजाय ट्रेसर (3B चित्रा) के साथ शिरापरक जलसेक लाइन भरें .
  5. तेजी में तीन घंटे, माउस वजन और गले का शिरा और जलसेक और नमूना लाइनों के लिए धमनी कैथेटर के लिए पीई-20 कनेक्ट, क्रमशः.
  6. यदि [3 - एच 3] ग्लूकोज प्रशासन अनुरेखक, एक primed निरंतर टी में ट्रेसर जलसेक शुरू -90 = मिनट (चित्रा 3C). एक ठेठ भड़काना खुराक 1 μCi है. Solutio ग्लूकोज - 0.05 μCi / μl [3 एच 3] तैयारगैर - heparinized खारा में n है. 1 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान लोड है और एक जलसेक पंप में सिरिंज सुरक्षित. 20 μl / 1 मिनट के लिए मिनट infusing द्वारा भड़काना खुराक प्रशासन. ΜCi 0.05 / मिनट (1 μl / मिनट) के एक 90 मिनट संतुलन अवधि के लिए एक निरंतर प्रेरणा के साथ पालन करें.
  7. इंसुलिन और ग्लूकोज के infusates तैयार करें. इंसुलिन गैर heparinized वाहक (BSA के एक उपयुक्त एकाग्रता भी इस्तेमाल किया जा सकता है) के रूप में 3% की प्लाज्मा युक्त खारा में तैयार है. ग्लूकोज infusates वाणिज्यिक सांद्रता (5, 20 और 50%) की एक किस्म में उपलब्ध हैं.
  8. एक दाता माउस से पूरे रक्त प्राप्त करने, अधिमानतः प्रयोगात्मक माउस के रूप में एक ही तनाव पृष्ठभूमि द्वारा खारा धोया erythorocyte infusate तैयार करें. आमतौर पर पूरे रक्त का एक मिलीलीटर प्रति अध्ययन माउस की जरूरत है. अलग एरिथ्रोसाइट्स के लिए रक्त अपकेंद्रित्र. 10 यू / मिलीलीटर heparinized खारा के साथ एरिथ्रोसाइट्स धो और खारा त्यागें अपकेंद्रित्र. एरिथ्रोसाइट्स की मात्रा का निर्धारण और 10 यू / एमएल hepari के एक बराबर मात्रा में resuspendखारा nized.
  9. 1 मिलीलीटर सिरिंज में प्रत्येक infusate ड्रा और एक व्यक्ति जलसेक पंप के लिए प्रत्येक सिरिंज सुरक्षित. एक 4 रास्ता संबंधक (चित्रा 3) प्रत्येक सिरिंज कनेक्ट.
  10. टी = -15 मिनट में धीरे धीरे समाशोधन सिरिंज में खून की 50-100 μl ड्राइंग द्वारा एक खून का नमूना ले. धमनी नमूने लाइन दबाना और समाशोधन सिरिंज निकालने. हाथ से आयोजित एक ग्लूकोज मीटर का प्रयोग, धमनी नमूने लाइन पर क्लैंप हटाने और रक्त ग्लूकोज मीटर पट्टी में प्रवाह करने की अनुमति एक रक्त ग्लूकोज पढ़ने ले.
  11. एक बार ग्लूकोज माप लिया जाता है, धमनी नमूने लाइन दबाना और धमनी नमूना लाइन में कुंद सुई सिरिंज (नमूने सिरिंज) सम्मिलित हैं. क्लैंप निकालें और नमूना सिरिंज में रक्त की मात्रा (नोट देखें) आकर्षित. धमनी नमूने लाइन दबाना और नमूने सिरिंज निकालने. समाशोधन सिरिंज वापस धमनी नमूने लाइन में सम्मिलित करें. सवार पर आकर्षित करने के लिए किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने और फिर से पानी में डालनाखून की 50-100 μl है कि मूल रूप से तैयार की गई थी.

नोट: नमूना रक्त की मात्रा प्रदर्शन किया जा रहा विश्लेषण पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, [3 - एच 3] के विश्लेषण ग्लूकोज एकाग्रता प्लाज्मा के 10 μl की आवश्यकता है, तो रक्त की 50 μl तैयार कर रहे हैं. यह प्लाज्मा, जो विश्लेषण प्लस अतिरिक्त प्लाज्मा अगर जरूरत के लिए पर्याप्त है के 20-30 μl पैदावार . हार्मोन और अन्य चयापचयों (जैसे इंसुलिन, मुक्त फैटी एसिड) के माप अतिरिक्त रक्त के नमूने की आवश्यकता है.

  1. EDTA लेपित microtube में नमूना सिरिंज में रक्त बग़ैर. अपकेंद्रित्र और प्लाज्मा इकट्ठा. बर्फ पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत दुकान अध्ययन के अंत तक प्लाज्मा रखें
  2. दोहराएँ 3.12 माध्यम चरण टी = -5 मिनट पर 3.10. आधारभूत प्लाज्मा इंसुलिन के स्तर की माप के लिए अतिरिक्त रक्त (50 μl) प्राप्त करते हैं. उपाय एक हेपरिन या EDTA का इलाज केशिका ट्यूब में रक्त ड्राइंग द्वारा आधारभूत हेमाटोक्रिट. माप fr प्राप्तटी = -15 और -5 मिनट में ओम प्लाज्मा नमूनों आधारभूत (यानी उपवास) मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं.
  3. टी = -5 मिनट में नमूना के बाद, ग्लूकोज, इंसुलिन और खारा धोया एरिथ्रोसाइट्स के लिए जलसेक लाइनों 4 रास्ता संबंधक को भरने के लिए. के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है - 4 तरह टयूबिंग कुंडा जलसेक (ग्लूकोज या टयूबिंग वाई संबंधक से जुड़ा अगर [3 एच 3] infusing) बंदरगाह करने के लिए संलग्न करने के लिए संबंधक कनेक्ट.
  4. खारा - धोया एरिथ्रोसाइट्स पहली बार infusing शुरू करो. जलसेक की दर सेट करने के लिए अध्ययन की अवधि से अधिक नमूना जा रहा है (जैसे अगर रक्त की 500 μl की कुल अध्ययन के 120 मिनट से अधिक नमूना हैं, जलसेक दर 4.2 μl / मिनट) सेट रक्त की कुल मात्रा की जगह के लिए. अन्य infusates के विपरीत, एरिथ्रोसाइट समाधान लाल है. इस समाधान infusing पहले किसी भी संभावित जलसेक पहचान की जाए और सही लाइनों में प्रतिरोध या अवरोधों के लिए अनुमति देता है.
  5. एक बार एरिथ्रोसाइट infusate माउस पहुँचता है, इंसुलिन शुरू औरग्लूकोज सुई लेनी. यह अब टी = 0 मिनट है. इंसुलिन एक निरंतर, पूर्व निर्धारित दर पर संचार होता है. 4 म्यू के एक इंसुलिन अर्क दर किलो • • मिनट -1 -1 आमतौर पर 80-100% से अंतर्जात ग्लूकोज उत्पादन को दबाने होगा और 2-3 गुना द्वारा ग्लूकोज के लापता होने को प्रोत्साहित. प्रारंभिक ग्लूकोज जलसेक दर (जीआईआर) आधारभूत रक्त शर्करा का स्तर और पिछले अनुभव के आधार पर अनुमान है.
  6. यदि [3 - एच 3] infusing ग्लूकोज, एक ट्रेसर जलसेक दर में वृद्धि करने के लिए ग्लूकोज कारोबार में अनुमानित वृद्धि (आमतौर पर 2-3 गुना वृद्धि) मैच का चुनाव कर सकते हैं.
  7. माउस में ग्लूकोज कारोबार के उच्च दर को ध्यान में रखते हुए, रक्त के नमूनों धमनी कोई प्रयोग की अवधि से अधिक ग्लूकोज एकाग्रता की माप के लिए हर 10 मिनट कम से कम लाइन से प्राप्त की जानी चाहिए. जीआईआर को प्राप्त करने और लक्ष्य euglycemia (चित्रा 3C) को बनाए रखने के लिए समायोजित करें. इस लक्ष्य मॉडल या अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकती हैं. एक अच्छा लक्ष्य जीएलucose एकाग्रता 150 मिलीग्राम • डेली-1 के बाद से यह एक ठेठ 6 चाउ खिलाया C57Bl/6J माउस के लिए उपवास ग्लूकोज का स्तर है.
  8. लक्ष्य euglycemia जल्दी प्राप्त करने के लिए, पहले 40-50 मिनट के भीतर आदर्श और स्थिर राज्य अवधि (टी = 80 मिनट) की शुरुआत से ग्लूकोज और जीआईआर स्थिर है है.
  9. यदि [3 - एच 3] ग्लूकोज infusing, t = 80, 90, 100, 110 और प्लाज्मा की माप के लिए 120 मिनट में अतिरिक्त रक्त प्राप्त [एच 3 - 3] ग्लूकोज विशिष्ट गतिविधि.
  10. टी = 100 पर अतिरिक्त रक्त और प्लाज्मा इन्सुलिन की माप और किसी भी अन्य हार्मोन (ओं) या metabolite (ओं) के लिए 120 मिनट लीजिए. टी = 110 मिनट, एक हेपरिन या EDTA का इलाज दबाना हेमाटोक्रिट की माप के लिए केशिका ट्यूब में रक्त आकर्षित.
  11. टी में नमूना = 120 मिनट के बाद लिया है, 2 [14 सी] deoxyglucose ऊतक विशेष ग्लूकोज तेज की माप के लिए प्रशासित किया जा सकता है है. सांस कंठ नमूने लाइन से जुड़ा लाइन में एक 12 μCi सांस प्रशासन 3B चित्रा (
  12. T = 2, 15, 25 और प्लाज्मा 2 [14] deoxyglucose सी स्तर की माप के लिए सांस के प्रशासन के बाद 35 मिनट में धमनी नमूना लाइन से रक्त के नमूने (50 μl) प्राप्त करते हैं .
  13. पिछले नमूना के बाद, धमनी लाइन में सीधे दिया pentobarbital की एक जलसेक के साथ माउस anesthetize. जल्दी से किसी भी ग्लूकोज तेज का मूल्यांकन (जैसे विभिन्न प्रकार, वसा ऊतकों, दिल, मस्तिष्क के कंकाल की मांसपेशियों) और किसी भी अन्य ऊतकों (जैसे यकृत, प्लीहा, गुर्दे,) के लिए आवश्यक ऊतकों टुकड़े करना. -80 में तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्रीज ऊतकों स्नैप डिग्री सेल्सियस जब तक विश्लेषण. ऊतक ग्लूकोज 2 phosphorylated के संचय को मापने के द्वारा विश्लेषण किया है [14 सी] जमे हुए ऊतकों में deoxyglucose और 2 [14 सी] प्लाज्मा से deoxyglucose के लापता होने के.

4. प्रतिनिधि परिणाम

एक इंसुलिन क्लैंप प्रयोग से प्राप्त परिणामों का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है.इस उदाहरण वेग चूहों में इंसुलिन प्रतिरोध के लिए एक उच्च वसा वाले आहार की क्षमता से पता चलता है. : रक्त शर्करा के स्तर की एक समय बेशक, जीआईआर और प्लाज्मा इंसुलिन का स्तर (आधारभूत और क्लैंप) के एक समय के पाठ्यक्रम इंसुलिन क्लैंप के परिणाम के सभी प्रस्तुतियों व्याख्या हो निम्नलिखित को शामिल करना चाहिए. जैसा कि यहाँ दिखाया गया है, उपवास (4A चित्रा) ग्लूकोज और इंसुलिन का स्तर (चित्रा 4C) एक उच्च वसा वाले आहार, इंसुलिन प्रतिरोध का संकेत खिलाया चूहों में उच्च रहे हैं. क्लैंप अध्ययन भर में ग्लूकोज का स्तर (चित्रा -4 ए) के एक समय के पाठ्यक्रम पेश पाठक का आकलन करने के लिए कितनी अच्छी तरह euglycemia बनाए रखा गया था, जो क्लैंप की गुणवत्ता का संकेत है की अनुमति देता है. इसी तरह, जीआईआर (4B चित्रा) के एक समय के पाठ्यक्रम के पाठक को निर्धारित करने के लिए कि कैसे जल्दी से एक स्थिर राज्य हासिल की थी अनुमति देता है. इन आंकड़ों दिखा रहा है समय के रूप में पाठ्यक्रम एक 2 घंटे प्रयोग पेश करने का माउस इंसुलिन क्लैंप साहित्य में पारंपरिक प्रथा से काफी अधिक जानकारीपूर्ण हैएक एकल गृहीत एक अपरिभाषित "क्लैंप" अवधि (4-13) से औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व बिंदु के रूप में . वर्तमान उदाहरण में, ग्लूकोज का स्तर नियंत्रण और उच्च वसा खिलाया समूहों के बीच बराबर थे, लेकिन जीआईआर उच्च वसा खिलाया समूह (4B चित्रा) में काफी कम था. यह पूरे शरीर इंसुलिन कार्रवाई में एक हानि का संकेत है. क्लैंप इंसुलिन का स्तर उच्च वसा खिलाया समूह (चित्रा 4C) में भी अधिक थे, और इन चूहों में एक इंसुलिन प्रतिरोधी phenotype की उपस्थिति का समर्थन . समस्थानिक ट्रेसर सुई लेनी के प्रयोग के विशिष्ट ऊतकों में इंसुलिन कार्रवाई का आकलन के लिए अनुमति देता है. [3 - 3 एच] ग्लूकोज अंतर्जात ग्लूकोज (endoRa) उपस्थिति, जो यकृत ग्लूकोज (HGP) उत्पादन और पूरे शरीर ग्लूकोज लापता होने (Rd) की दर के एक सूचकांक है की दर का अनुमान किया जाता है. जबकि इंसुलिन पूरी तरह से नियंत्रण चूहों में HGP दबा है, यह एक उच्च वसा वाले आहार (चित्रा 4D) खिलाया चूहों में बिगड़ा हुआ है . इसी तरह, में से क्षमतानियंत्रण चूहों में Rd उत्तेजित sulin एक उच्च वसा वाले आहार (चित्रा 4E) खिलाया चूहों में समझौता किया है. 2 [14] deoxyglucose सी ग्लूकोज चयापचय (आरजी) सूचकांक, ऊतक विशेष ग्लूकोज तेज का एक उपाय का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जैसा कि इस उदाहरण में देखा, एक उच्च वसा वाले आहार (चित्रा 4F) खिलाया चूहों में इंसुलिन कंकाल की मांसपेशी में ग्लूकोज तेज उत्तेजित बिगड़ा हुआ है .

चित्रा 1
चित्रा 1: धमनी (ए) और (बी) शिरापरक कैथेटर और (सी) मासा tm की तैयारी. धमनी कैथेटर .012 "आईडी silastic का एक टुकड़ा में 6 सेमी पीई 10 के 3 मिमी के बारे में एक 1.3 सेमी टुकड़ा डालने से तैयार हैं टिप पीई 10 ऐसी है कि silastic के लिए बेवल से लंबाई 0.9 सेमी है beveled है. शिरापरक कैथेटर 0.020 आईडी silastic ".012 की एक 6 सेमी टुकड़ा beveled अंत से आईडी silastic 1.1 सेमी" का एक छोटा सा टुकड़ा फिसलने के द्वारा बनाई गई हैं .020 से एक निरोधक मनका के रूप में "आईडी silastic टुकड़ा कृत्यों. गले का शिरा कैथेटर इलाज. मासा tm, दो 1.3 सेमी की प्रत्येक विधानसभा के लिए 25 गेज connectors के दो 3 पीई-20 सेमी के टुकड़ों में से प्रत्येक में डाला जाता है. ये एक साथ .040 "आईडी silastic का एक छोटा सा टुकड़ा के द्वारा आयोजित की जाती हैं connectors के एक 120 डिग्री कोण के लिए तत्पर हैं और एक 45 डिग्री कोण पर अलग. पूरे विधानसभा चिकित्सा सिलिकॉन चिपकने वाला में डूब जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2: Catheterized माउस. कैथेटर्स शल्य चिकित्सा बाईं मन्या धमनी और सही गले का शिरा में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. कैथेटर से मुक्त समाप्त होता है सिर के पीछे externalized कर रहे हैं और एक मासा tm से जुड़ा है. मासा tm subcutaneously कंधे ब्लेड के बीच में डाला जाता है. इस को नियंत्रित करना, संभाल या माउस anesthetize की जरूरत के बिना इंसुलिन क्लैंप प्रयोगों के दौरान संवहनी पहुँच के लिए अनुमति देता है.

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चित्रा 3: एक इंसुलिन क्लैंप प्रयोग के लिए सेटअप और समय रेखा के चित्रण. माउस जलसेक और नमूना सीरिंज के लिए एक हब के रूप में कार्य करता है एक दोहरी चैनल कुंडा के लिए tethered है. प्रयोगों के लिए विशिष्ट setups का उपयोग कर (एक) नहीं ट्रेसर सुई लेनी है और दोनों का उपयोग कर [3 - एच 3] ग्लूकोज और 2 [14 सी] deoxyglucose (बी) दिखाए जाते हैं. इंसुलिन क्लैंप (सी) की स्थापना और प्रदर्शन के लिए प्रक्रियाओं का एक समय रेखा भी दिखाया गया है. क्लैंप, के दौरान रक्त के नमूनों ( रक्त ) हर 10 मिनट रक्त ग्लूकोज उपाय लिया जाता है. जीआईआर तदनुसार समायोजित है euglycemia बनाए रखने. आधारभूत रक्त ग्लूकोज, प्लाज्मा इंसुलिन, और प्लाज्मा [3 - एच 3] के लिए नमूने ग्लूकोज टी = -15 और -5 मिनट में ले रहे हैं . T = 80, 90, 100, 110 और 120 पर और t = 100 और 120 मिनट पर क्लैंप इंसुलिन के लिए ग्लूकोज दबाना [3 - एच 3] प्लाज्मा के लिए नमूने ले रहे हैं. 2 [14] deoxyglucose सी टी = 120 मिनट और ख में नमूना के बाद प्रशासित किया जाता हैlood टी = 2, 15, 25 और 35 मिनट के बाद एकत्र की है. ऊतकों के बाद टी = 35 मिनट नमूना लिया जाता है.

चित्रा 4
चित्रा 4: एक इंसुलिन क्लैंप चूहों एक उच्च वसा वाले आहार (HFD) पर एक नियंत्रण आहार पर चूहों (चाउ) की तुलना प्रयोग से परिणाम . धमनी (ए) ग्लूकोज और जीआईआर आधारभूत (बी), और क्लैंप (सी) इंसुलिन, EndoRa (डी), और Rd (ई) और कंकाल की मांसपेशी (gastrocnemius और vastus lateralis) (एफ) आरजी के समय पाठ्यक्रम दिखाए जाते हैं. सभी परिणाम उच्च वसा खिलाने के प्रभाव के लिए इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित संकेत मिलता है.

Discussion

क्लैंप hyperinsulinemic euglycemic, या इंसुलिन क्लैंप, व्यापक रूप से vivo में इंसुलिन कार्रवाई का आकलन करने के लिए "सोने के मानक 'विधि माना जाता है. मनुष्य, कुत्तों, चूहों और चूहों सहित कई प्रजातियों के लिए इस तकनीक को लागू किया गया है. चयापचय विकारों के लिए ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की बढ़ती संख्या को देखते हुए, माउस में प्रयोग के लिए तकनीक के miniaturization चयापचय अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण प्रगति प्रदान की है.

जबकि इंसुलिन क्लैंप के पीछे अवधारणाओं को सीधा कर रहे हैं, व्यवहार में इंसुलिन क्लैंप प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए अलग अलग दृष्टिकोण हैं. यह एक तुच्छ बात नहीं है, क्योंकि जिस तरह में प्रयोग किया जाता है 1 प्राप्त परिणामों को प्रभावित करता है. यहाँ हम Vanderbilt MMPC द्वारा इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. - हमारे और दूसरों के प्रोटोकॉल है कि के बीच मुख्य अंतर यह है कि हम रक्त के नमूनों को प्राप्त करने के लिए एक धमनी कैथेटर का उपयोग करें. यह OBT के अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण के विपरीत हैपूंछ 4, 7, 11, 12, 14-17 की नोक विच्छेद द्वारा रक्त के नमूनों aining. एक धमनी कैथेटर से नमूने का लाभ यह है कि एक सचेत और अनर्गल माउस प्रयोग में आयोजित किया जाता है है. पूंछ से नमूनाकरण अक्सर संयम की आवश्यकता होती है और तनाव का सूचकांक बढ़ जाती है जब बड़े रक्त के नमूनों 1 अर्जित कर रहे हैं है . तनाव हार्मोन अंतर्जात ग्लूकोज उत्पादन को प्रोत्साहित और ग्लूकोज निपटान 18, 19 को ख़राब करने के लिए, संभवतः एक इंसुलिन प्रतिरोधी phenotype के दिखाई दे रही है. कटे पूंछ से नमूनाकरण विशेष संस्थागत पशु की देखभाल और अपने तनावपूर्ण प्रकृति की वजह से से उपयोग समिति अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है. धमनी कैथीटेराइजेशन प्रक्रिया पूंछ विच्छेद के माउस के तनाव से बचने के लिए विकसित किया गया था.

इंसुलिन clamps के प्रदर्शन का एक महत्वपूर्ण पहलू को euglycemia बनाए रखने की क्षमता है. वहाँ कोई एल्गोरिदम कि सही भविष्यवाणी कैसे जीआईआर रक्त ग्लूकोज रीडिंग पर आधारित समायोजित किया जाना चाहिए कर सकते हैं. सर्जरी की तरह,इंसुलिन क्लैंप प्रयोगों का आयोजन कर्मियों को केवल अनुभव के माध्यम से उचित euglycemia बनाए रखने में कुशल हो जाएगा. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि उनके उच्च चयापचय दर की वजह से माउस अध्ययन से प्राप्त आंकड़ों के स्वाभाविक शोर हो जाएगा है. यह ग्लूकोज और जीआईआर के समय पाठ्यक्रम और प्लाज्मा इंसुलिन, endoRa, Rd और किसी भी पाठक के परिणामों की व्याख्या करने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण आरजी के लिए निरपेक्ष मूल्यों सहित, डेटा की पूरी प्रस्तुति बनाता है. माउस (लगभग 5 गुना अधिक से अधिक मानव में दर) में उच्च ग्लूकोज प्रवाह दरों ग्लूकोज नमूने के एक उच्च आवृत्ति वारंट. जबकि माउस के रक्त की मात्रा सीमित है, एक बार हर 10 मिनट की एक न्यूनतम आवृत्ति नमूना कुछ है कि एक पर्याप्त क्लैंप हासिल किया गया है होना आवश्यक है.

के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, क्लैंप इंसुलिन का स्तर समूहों के बीच अलग किया जा सकता है. आहार हस्तक्षेप, ट्रांसजेनिक जोड़तोड़ या पृष्ठभूमि उपभेदों में मतभेद जैसे कारक fas को प्रभावित कर सकते हैंting इंसुलिन का स्तर है, जो बाद में क्लैंप इंसुलिन के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं. परिणाम की व्याख्या है जब क्लैंप इंसुलिन का स्तर अलग हैं समस्याग्रस्त किया जा सकता है. यह प्रयोगात्मक पायलट प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इंसुलिन अर्क दर है कि समूहों के बीच बराबर क्लैंप इंसुलिन के स्तर को प्राप्त करने का चयन के द्वारा संबोधित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, सोमेटोस्टेटिन अग्नाशय हार्मोन स्राव को बाधित किया जा सकता है, और इंसुलिन और ग्लूकागन प्रयोगात्मक नियंत्रित दरों पर प्रतिस्थापित किया जा सकता है है. यह बाद दृष्टिकोण और अधिक सामान्य चूहों की तुलना में चूहों पर इंसुलिन clamps में किया है. यदि इन प्रयोगात्मक दृष्टिकोण नहीं ले रहे हैं, स्थिर राज्य जीआईआर क्लैंप इंसुलिन स्तर के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, या एक इंसुलिन संवेदनशीलता सूचकांक (एस) एस मैं = / जीआईआर (जी ΔI •), जहां के रूप में क्लैंप डेटा से प्राप्त किया जा सकता है जी स्थिर राज्य ग्लूकोज एकाग्रता है और ΔI उपवास और क्लैंप इंसुलिन सांद्रता के बीच का अंतर है. या तो दृष्टिकोण के साथ एक धारणा यह है कि क्लैंप इंसुलिन स्तर हासिल हैरेंज जहां इंसुलिन संवेदनशीलता रैखिक अध्ययन किया जा रहा समूह के अनुसार इंसुलिन स्तर से संबंधित है के भीतर. यह बाद धारणा जब इंसुलिन प्रतिरोधी और इंसुलिन संवेदनशील समूहों की तुलना लागू नहीं हो सकता. आदर्श रूप में, एक इंसुलिन खुराक प्रतिक्रिया वक्र के लिए उपयुक्त इंसुलिन अर्क का चयन करने के लिए उत्पन्न होना चाहिए. हालांकि, अतिरिक्त प्रयोगों के लिए आवश्यकता के कारण, यह बहुत ही कम किया जाता है.

धमनी कैथीटेराइजेशन द्वारा प्रदान की बहुमुखी प्रतिभा euglycemic clamps परे प्रयोगात्मक दृष्टिकोण फैली हुई है. उदाहरण के लिए, hyperglycemic clamps, जिसमें ग्लूकोज उपवास ग्लूकोज के सापेक्ष hyperglycemia बनाए रखने के लिए एक चर दर पर संचार होता है vivo 2, 20, 21 में अंतर्जात अग्नाशय के समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परीक्षण के दौरान पहले चरण इंसुलिन स्राव की माप रक्त के नमूनों के लगातार अधिग्रहण (हर 2-5 मिनट अर्थात्) है, जो संभव नहीं है जब पूंछ की नोक से नमूने प्राप्त की आवश्यकता है. इसके अलावा,बुलंद पूंछ नमूने में से जिसके परिणामस्वरूप catecholamines इंसुलिन स्राव ख़राब और ग्लूकागन 22 स्राव में वृद्धि कर सकते हैं . इंसुलिन क्लैंप प्रोटोकॉल का प्रयोग भी करने के लिए अनुमति देने के लिए ग्लूकोज का स्तर रिश्तेदार हाइपोग्लाइसीमिया के लिए गिर करने के लिए काउंटर नियामक 2 प्रतिक्रिया, 23, 24 का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. धमनी कैथीटेराइजेशन भी 25-30 अभ्यास के दौरान ग्लूकोज चयापचय की गतिशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह एक बार बिंदुओं पर आयोजित पारंपरिक दृष्टिकोण पर काफी फायदेमंद है पूर्व और पृथक मांसपेशियों पूर्व vivo में पोस्ट या व्यायाम. यहाँ प्रस्तुत तकनीकों को भी ग्लूकोज, नहीं बस, लेकिन यह भी फैटी एसिड चयापचय 31 का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

इस काम अनुदान 5-U24 - DK059637-10 Vanderbilt माउस मेटाबोलिक phenotyping केंद्र द्वारा समर्थित किया गया.

References

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Comments

21 Comments

  1. Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 8:09 AM
  2. Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala

    Reply
    Posted by: Julio A.
    November 29, 2012 - 8:46 AM
  3. Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 9:39 AM
  4. Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 26, 2014 - 1:17 PM
  5. Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 26, 2014 - 2:06 PM
  6. Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 28, 2014 - 12:20 PM
  7. Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 28, 2014 - 3:42 PM
  8. Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.

    Reply
    Posted by: Joseph C.
    April 8, 2014 - 5:11 PM
  9. Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 11, 2014 - 4:15 PM
  10. Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    April 15, 2014 - 11:17 AM
  11. Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 16, 2014 - 10:32 AM
  12. Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 12:32 PM
  13. Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.

    Reply
    Posted by: Carlo M.
    October 2, 2014 - 1:29 PM
  14. Thanks. I will try it!

    Kai

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 4:11 PM
  15. Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:05 PM
  16. Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:25 PM
  17. Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:38 PM
  18. We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:31 PM
  19. Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 2:56 PM
  20. Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:47 PM
  21. Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    November 4, 2014 - 1:04 PM

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