意識、無拘束マウスにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

Published 11/16/2011
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高インスリン血症 - 正常血糖クランプ、またはインスリンクランプは、インスリンの作用を評価するためのゴールドスタンダードです。

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Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

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Abstract

2型糖尿病はインスリン作用の欠損によって特徴付けられる。高インスリン血症-正常血糖クランプ、またはインスリンクランプは、広く生体内でインスリンの作用を評価するための"ゴールドスタンダード"の方法と考えられている。インスリンクランプ時には、高インスリン血症は、一定のインスリン注入することによって達成される。正常血糖値は、可変レートで併用グルコース注入を介して維持されます。この変数はグルコース注入率(GIR)は、実験を通して短い間隔で血糖値を測定し、それに応じてGIRを調整することによって決定されます。強化インスリン作用を有するマウスは、より大きなGIRを必要とGIRは、全身インスリン作用の指標である。インスリンクランプは同位体2の管理を組み込むことができます[14 C]デオキシグルコースは、組織特異的グルコース取り込みを評価すると[3 - 3 H]グルコースは、内因性のグルコースの外観(endoRa)の速度を抑制するインスリンの能力、のマーカーを評価する肝臓でのグルコース産生、および刺激する全身グルコースの消失(路)の割合。

代謝性疾患の遺伝的マウスモデルで使用するためにインスリンクランプの小型化は、糖尿病の研究に大きな進歩をもたらした。インスリンクランプを実行するためのメソッドは、研究室によって異なります。インスリンクランプが行われる方法が大幅に得られた結果に影響を与えることができることに注意することは重要です。私たちは、意識的なマウス1と同様に様々なクランプ技法2を使用して、4つの一般的に使用される近交系マウスの代謝反応の評価にインスリンクランプを行うためにさまざまなアプローチの包括的な評価を発表している。ここでは、ヴァンダービルトマウス代謝表現型センター(;:www.mc.vanderbilt.edu / MMPC URL MMPC)により開発された意識、無拘束マウスにインスリンクランプを行うためのプロトコルを示す。これは、インスリンクランプ時に使用されるカテーテルを注入するための方法の説明が含まれています。で採用されているプロトコルバンダービルトMMPCは、ユニークな2カテーテルシステム3を利用しています。 Oneカテーテルは、注入のための頸静脈に挿入されます。第二カテーテルは、マウスを抑制または処理することなく、血液サンプリングを可能に頸動脈に挿入されます。このテクニックは、尾の切断端からのサンプリングです。インスリンクランプ時の血液サンプルを得るために最も一般的な方法に重要な利点を提供します。この後者のメソッドとは異なり、動脈カテーテルからサ ​​ンプリングすると、マウス1〜ストレスではありません。我々はまた、組織特異的なインスリン作用を評価するために同位体トレーサーの注入を使用するための方法を説明します。我々はまた、インスリンの留め金から得られた結果の適切なプレゼンテーションのためのガイドラインを提供しています。

Protocol

1。サンプリングのアクセスのためのカテーテルとマウスアンテナの準備(MASA TM)

  1. 図1Aに示すように、シラスティックチューブ6 cmの部分(0.012インチ内径)にPE - 10の1.3 cmの部分(0.011インチ内径)を挿入することにより、動脈カテーテルを準備します。ベベルメスのPE - 10の先端シラスティックの端からベベルの先端までの長さが0.9 cmですので。
  2. シラスティックチューブ(0.020インチ内径)は、 図1Bに示すように、シラスティックチューブ6 cmの部分(0.012インチ内径)の斜めの端から1.1 cmの1 mmの部分をスライドさせて静脈カテーテルを準備します。シラスティックの1 mmの部分は抑制ビーズとして使用されます。
  3. MASA TMを準備するには、PE - 20の2つの3cmのピース(0.015インチ内径)のそれぞれに25ゲージのステンレス製のコネクタの2つの1.3センチの部分のそれぞれを挿入します。
  4. シラスティックの5mmのピースをスライドさせてお互いにPE-20/connectorsを確保する鋼管とPE - 20が交わるエリアオーバーチューブ(0.040インチ内径)。
  5. 〜120 °の角度に鋼管を曲げたりして〜45 °でそれぞれのチューブを区切ります。
  6. 場所は、医療用シリコーン接着剤をほんの少し加えたのリグを完成などのPE - 20チューブが垂直であるとステンレス鋼管の端部が接着剤( 図1C)を超えて拡張すること。この24時間に設定することができます。

2。外科的カテーテル

  1. 手術前に、、70%エタノールでカテーテルを滅菌するヘパリン化生理食塩水(200 Uヘパリン/ mlの生理食塩水)でそれらを記入し、ステンレス製のプラグを挿入します。
  2. 好ましくは連続的(例えば、吸入イソフルラン)麻酔薬を提供する方法を使用して、マウスを麻酔。
  3. 無菌テクニックを使用して、はさみを使用して切開部位からの毛および/または脱毛クリームを削除し、betadineスクラブに続いてアルコールで皮膚を消毒する。カテーテルの挿入の場合は、上毛を取り除く下顎から胸郭の上部へと鎖骨の間までの領域。頭の後ろカテーテルの外部化については、頭蓋底の間の領域で髪と肩甲骨間の領域を削除し、betadineスクラブに続いてアルコールで皮膚を消毒する。
  4. 温暖化の面で、その背中にと手術用顕微鏡の表示領域の下にマウスを置きます。サージカルテープで尾と四肢を固定します。麻酔を提供するノーズコーンに頭を固定します。
  5. 胸骨への頭部の小さな垂直正中切開5mmを行う。鉗子を使用して、左胸鎖乳突筋を公開するために組織を解剖鈍らせる。左頸動脈を公開するには、この筋肉を反映している。静かに動脈から結合組織を薄くそぐ。それは、動脈や神経のいずれかを傷つけることなく動脈から迷走神経を分離するためにこの時点では重要です。
  6. 動脈を分離し、絹縫合糸で頭端を結紮。緩く結び目別露出した血管の尾の端の縫合糸の一部。
  7. 尾方端のマイクロ止血小鉗子クランプで血管をクランプし、単に春のはさみと連結された端の下にカット。慎重に限りクランプとしてカテーテルを挿入する。慎重にマイクロ止血小鉗子クランプを開放し、シラスティック- PEの接合部にカテーテルを進める。
  8. カテーテルにしっかりと両方の合字を結ぶと、サンプリングシリンジ、カテーテルの自由端を接続することにより、そのカテーテルのサンプルを確認してください。
  9. 別の切開正中線の右側〜5㎜とし、最初の切開に尾約2mmを行います。鉗子を使用して、右頸静脈を露出し、分離する組織を解剖鈍らせる。
  10. 慎重に絹縫合糸で頭端を結紮し、緩く尾方端に縫合糸の別の部分を結ぶ。
  11. ちょうど春のはさみと橈側字の下にカットし、抑制ビーズにカテーテルを挿入する。ビーズの後ろに縫合糸を結ぶと、カテーテルのサンプルがいることを確認します。
  12. TURNマウスと肩甲骨の間の小さな切開を加える。
  13. 背面の肩甲骨間の切開にマウスの前面にある動脈カテーテルのための切開から皮膚の下のトンネルは、14ゲージの針、、。マウスの背面に、それを体外に出すために針を介して動脈カテーテルを通します。背面の肩甲骨間の切開の前に切開部位から、マウスの右側の皮膚の下に14ゲージの針をトンネリングすることによって、内頸静脈カテーテルのためにこれを繰り返します。
  14. 肩甲骨の間の切開部位におけるマイクロ止血小鉗子クランプで動脈カテーテルをクランプする。 〜1 cmこのクランプ上記カテーテルをカット。マウスの頭部に向かって直面しているステンレス製のコネクタとMASA TMを置きます。マウスの左側に向かっているステンレス製のコネクタに動脈カテーテルを接続してください。カテーテルには穴やねじれがないように注意してください。 、静脈カテーテルについて、この手順を繰り返しますマウスの右側を指しているステンレス製のコネクタに接続する。
  15. 肩甲骨の間の切開にMASA TMを挿入します。内頸静脈カテーテルに対応するPE - 20チューブは、マウスの右側にでなければならず、動脈カテーテルに対応するPE - 20チューブは左にしてください。
  16. ナイロン縫合糸で腹側と背側切開を閉じます。背側閉鎖の場合は、縫合糸は、所定の位置に固定するMASA TMの硬化性シリコーンを使って実行できます。ヘパリン加生理食塩水と感染のリスクを最小限に抑えるために抗生物質を含んだフラッシュ溶液を使用してカテーテルの開存を確認してください。即時回復のための加温した、クリーンケージの場所をマウス。 図2は、完成した製品を示しています。
  17. マウスは少なくとも5日間で回復することができます。重量と全体的な健康状態を監視します。機関のアニマルケアにより承認された適切な術後鎮痛剤の処方を活用し、委員会を使用してください。

3。高インスリン血症、正常血糖クランプ

  1. 5 - 6Hのための高速なマウス。基準として、時刻t = 0分、高速の終わりとインスリンとグルコース注入(すなわちクランプ期間)の先頭を指します。
  2. 典型的な実験のセットアップと時間線を図3に示されています。注入とサンプリングラインのためのマイクロRenathaneまたは同等のチューブを使用してください。マウス上記のデュアルチャネルのスイベルを一時停止します。これは、マウスと注入/サンプリングシリンジの間にハブとして機能します。実験中、マウスがホームケージまたは類似の容器に残っているため、旋回につながれている。
  3. マウスを接続する前に、ヘパリン生理食塩水(10 Uヘパリン/ mlの生理食塩水)で動脈サンプリングラインを記入し、行の下端にステンレス製のコネクタを配置。サンプリングラインの上部に接続されているヘパリン生理食塩水(クリアシリンジ)とシリンジを残す。これは、血液sampを策定するために使用されます。LES。
  4. スイベルの注入ポート( 図3Aのセグメント )からの行の下端までのすべての方法を開始する、非ヘパリン生理食塩水による静脈点滴ラインを埋める。行の上端を接続し、ラインの下端(ボーラスが投与される場合またはY -コネクタ)ステンレス鋼のコネクタを配置。同位体グルコースのトレーサー(例:[3 - 3 H]グルコースが)場合、注入されて、点滴の注射器にトレーサを含有する、1mlの注射器を固定します。代わりに生理食塩水のトレーサー( 図3B)と静脈輸液ラインを埋める。
  5. 高速に三時間は、マウスの重量を測定し、それぞれ、頸静脈と点滴とサンプリングラインに動脈カテーテル用PE - 20を接続してください。
  6. [3 - 3 H]管理する場合、グルコースのトレーサーを、tでのプライム、連続的なトレーサーの注入を開始= -90分( 図3C)。一般的なプライミング量は1μCiのです。グルコースsolutio - 0.05μCiの/μlの[3 H 3]を準備する非ヘパリン生理食塩水でn個。 1mlのシリンジにソリューションをロードし、輸液ポンプ、シリンジを固定します。 1分間20μL/分を導入することで、プライミング量を管理する。 90分の平衡期間の0.05μCiの/分(1μL/分)の連続注入に従ってください。
  7. インスリンとグルコースのinfusatesを準備します。インスリンは、キャリア(BSAの適切な濃度を用いることもできる)として3%のプラズマを含む非ヘパリン生理食塩水で調製される。グルコースinfusatesは、​​濃度の様々な(5、20および50%)で市販されている。
  8. 望ましい実験的なマウスと同じ系統の背景の、ドナーマウスから全血を得ることにより、生理食塩水で洗浄したerythorocyte注入物を準備します。全血の、典型的には1 mlを試験マウスごとに必要とされる。別々の赤血球に血液を遠心する。生理食塩水を破棄するには10 U / mlのヘパリン添加生理食塩水と遠心分離機で赤血球を洗浄してください。赤血球の量を決定し、10 U / mlのhepari等量の再懸濁生理食塩水同期が可能です。
  9. 1mlのシリンジに各注入物を描画し、個々の輸液ポンプに各注射器を固定します。 4ウェイのコネクタ( 図3)にそれぞれのシリンジを接続してください。
  10. 時刻t = -15分は徐々にクリアシリンジに血液の50〜100μLを描画することにより、血液サンプルを取る。動脈サンプリングラインをクランプし、クリアシリンジを取り外します。ハンドヘルド血糖測定器を使用して、動脈サンプリングラインのクランプを除去し、血液はグルコースメーターストリップに流入させることによって血糖値の測定値を取る。
  11. グルコースの測定が行われると、動脈のサンプリングラインをクランプし、動脈サンプリングラインに鈍針注射器(サンプリングシリンジ)を挿入する。クランプを外し、サンプリングシリンジに( 注を参照)血液の量を引く。動脈サンプリングラインをクランプし、サンプリングシリンジを取り外します。動脈サンプリングラインに戻ってクリアシリンジを挿入します。気泡を除去し、再注入するプランジャを引くもともと描かれた血液の50〜100μL。

注:サンプリングされた血液の量は、実行される分析によって異なります。例えば、[3 - 3 H]の分析グルコース濃度は、血漿10μlを必要とするので、血液50μlを描かれています。これは、必要に応じて分析のために十分なプラス追加のプラズマであるプラズマ、20〜30μlを得られます。ホルモンおよび他の代謝物(例えばインスリン、遊離脂肪酸)の測定は、追加の血液のサンプリングを必要とする。

  1. EDTAでコーティングされたマイクロチューブにサンプリングシリンジで血液を分注する。血漿を遠心分離して収集する。研究の終了まで、氷上にプラズマを維持するか、直ちに-20℃で保存します。
  2. 繰り返しは、t = -5分で3.12を通じて3.10を繰り返します。ベースラインの血漿インスリン濃度の測定のための追加の血液(50μl)を入手してください。ヘパリンまたはEDTA処理したキャピラリーチューブに血液を描画することによりベースラインのヘマトクリット値を測定する。 frを得られた測定値T = -15〜-5分でOM血漿サンプルは、ベースライン(つまり空腹時)の値を表します。
  3. トン= -5分でサンプルした後、最大4ウェイのコネクタへのグルコース、インスリンおよび生理食塩水で洗浄した赤血球の点滴ラインを埋める。 図3に示すように-スイベル注入ポート(グルコースまたは[3 H 3]を注入する場合チューブはYコネクタに接続)に接続されたチューブに4ウェイのコネクタを接続します。
  4. 第一生理食塩水で洗浄した赤血球を注入開始。 (例えば、血液中の500μlの合計が、研究の120分にわたってサンプリングされている場合、4.2μL/ minの注入速度を設定)研究の期間にわたってサンプリングされている血液の総量を交換する注入速度を設定します。他のinfusatesとは対照的に、赤血球のソリューションは赤です。このソリューションを注入すると、最初に識別し、修正する輸液ライン内の任意の潜在的な抵抗や障害物が可能になります。
  5. 赤血球注入物がマウスに達すると、インスリンを開始し、ブドウ糖の点滴。これは、現在時刻t = 0分です。インスリンは、定数、予め定められた速度で注入する。 4 MUのインスリン注入速度は•キロ-1•min -1では、通常、80から100パーセントで内因性グルコース産生を抑制し、2〜3倍でグルコースの消失を刺激する。初期のグルコース注入率(GIR)はベースラインの血糖値と過去の経験に基づいて推定されている。
  6. [3 - 3 H]注入した場合グルコースを、一つには、グルコースの代謝回転(通常は2〜3倍に増加)の推定増加に合わせて、トレーサーの注入速度を増大するよう選択できます。
  7. マウスにおけるグルコースの代謝回転率が高いことを考えると、血液サンプルは、実験の期間にわたってグルコース濃度の測定毎に10分以上の値動脈ラインから入手する必要があります。ターゲットの正常血糖値( 図3C)を達成し、維持するGIRを調整します。このターゲットは、モデルや研究の目的によって異なる場合があります。良いターゲットGLこれはチャウ葉C57BL/6Jマウスの代表的な6時間絶食血糖値なのでucose濃度は150 mgの•DL - 1です。
  8. 目標は、理想的に第一40〜50分以内に、速やかに血糖値を達成するため、および定常状態期間(t = 80分)の開始によってグルコースとGIRの安定を持つことです。
  9. [3 - 3 H]注入した場合グルコースを、T = 80、90、100、110およびプラズマの計測のための120分で、追加の血液を得る[3 - 3 H]グルコース比活性。
  10. 追加のT = 100で、血液と血漿インスリンの測定と他のホルモン(S)または代謝物(s)の120分を集める。 T = 110分で、クランプヘマトクリットの測定のためのヘパリンまたはEDTA処理したキャピラリーチューブに血液を描画します。
  11. tにおけるサンプル後= 120分が取られ、2 [14 C]デオキシグルコースが組織特異的グルコース取り込みの測定のために投与することができます。頚静脈サンプリングラインに接続されたボーラスラインに12μCiの塊を管理する( 図3B
  12. T = 2、15、25とプラズマ2 [14 C]デオキシグルコース濃度の測定のためのボーラス投与後35分で動脈のサンプリングラインから血液サンプル(50μl)を入手してください。
  13. 最後のサンプルの後、動脈ラインに直接与えられたペントバルビタールの投与でマウスを麻酔。迅速にグルコース取り込みの評価(各種、脂肪組織、心臓、脳の例:骨格筋)と、他の組織(例えば肝臓、脾臓、腎臓)に必要な組織を解剖。分析するまで-80℃で液体窒素とストア内の凍結組織をはめ込みます。組織のグルコースがリン酸化された2の蓄積を測定することによって分析されている[14 C]凍結組織におけるデオキシグルコースおよび血漿から2 [14 C]デオキシグルコースの消失。

4。代表的な結果

インスリンクランプの実験から得られた結果の例を図4に示されています。この例では、マウスの沈殿物のインスリン抵抗性の高脂肪食の能力を示しています。血糖値の経時変化、GIRと血漿インスリンレベル(ベースラインとクランプ)の時間経過:インスリンクランプ結果のすべてのプレゼンテーションが正しく解釈するには、次を含める必要があります。ここに示すように、空腹時血糖値( 図4A)およびインスリン( 図4C)のレベルはインスリン抵抗性を示す高脂肪食を、与えたマウスの方が高い。クランプの研究を通して血糖値( 図4A)の時間経過を表示すると、読者はクランプの品質を示すである、血糖値が維持されてどれだけ評価することができます。同様に、GIR( 図4B)の時間経過は、読者が定常状態が達成されたかをすばやく判断することができます。時間のコースは2時間の実験を提示のマウスのインスリンクランプ文学における従来の方法よりもはるかに多くの有益なので、これらのデータを表示する未定義"クランプ"期間(4-13)から平均値を表す単一の基準点として。本例では、血糖値は、制御と高脂肪食群の間で同等であったが、GIRは、高脂肪食群( 図4B)で有意に低かった。これは、全身インスリン作用の障害の指標となる。クランプインスリンレベルは、さらに、これらのマウスにおけるインスリン抵抗性表現型の存在を支持する、高脂肪食群( 図4C)も高かった。同位体トレーサー注入の使用は、特定の組織におけるインスリン作用の評価が可能になります。 [3 - 3 H]グルコースは、肝臓のグルコース生産(HGP)および全身のグルコースの消失(路)の速度の指標となる内因性グルコースの外観(endoRa)、の速度を推定するために使用されます。インスリンが完全にコントロールマウスにHGPを抑制するのに対し、これは高脂肪食( 図4D)を与えたマウスでは低下している。同様に、のの能力対照マウスでRdを刺激するsulinは、高脂肪食( 図4E)を与えたマウスでは損なわれます。 2 [14 C]デオキシグルコースは、グルコース代謝指数(RG)、組織特異的グルコース取り込みの尺度を評価するために使用されます。この例に見られるように、骨格筋へのインスリン刺激によるグルコース取り込みは、高脂肪食( 図4F)を与えたマウスでは低下している。

図1
図1:動脈(A)と(B)静脈カテーテルおよび(C)MASA TMの準備。動脈カテーテルは、0.012"IDのシラスティックの6 cmの部分に約3mm PE - 10の1.3 cmの断片を挿入することによって調製されています。PE - 10チップはベベルからシラスティックの長さが0.9 cmであるように面取りされている。静脈はカテーテルは、IDのシラスティック0.020"0.012の6センチ部分の面取り端からIDシラ1.1センチメートル"の小片をスライドさせて作られています。自体に拘束ビーズとして0.020"IDシラピースの行為は、頚静脈にカテーテルを治す。 MASA TM、2つの1.3センチメートルのそれぞれの組立のために25ゲージコネクタは、PE - 20の2つの3cmの部分のそれぞれに挿入されます。これらは、0.040"IDのシラの小片によって一緒に保持されています。コネクタが120 °の角度に曲げたと45 °の角度で区切られている。アセンブリ全体が医療シリコーン接着剤に浸漬される。

図2
図2:カテーテルマウス。カテーテルは外科的に左頸動脈と右頸静脈に注入される。カテーテルの自由端は、頭の後ろに外部化し、MASA TMに接続されています。 MASA TMは、肩甲骨の間の皮下に挿入されます。これは、マウスを、抑制処理や麻酔を必要とせずにインスリンクランプ実験時の血管アクセスすることができます。

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図3:インスリンクランプ実験のセットアップと時間線の描写。マウスを注入し、サンプリングシリンジのためのハブとして動作するデュアルチャンネルのスイベルにつながれている。実験用の典型的なセットアップは、トレーサーの注入を使用して()との両方を使用していない[3 - 3 H]グルコースと2を[14 C]デオキシグルコース(B)が示されている。セットアップとインスリンクランプ(C)を実行するための手続きのタイムラインも表示されます。クランプの間に、血液サンプル( 血 )血糖値を測定する毎に10分を取られます。 GIRは、正常血糖を維持するためにそれに応じて調整されます。ベースライン血糖、血漿インスリン、およびプラズマのためのサンプル[3 - 3 H]グルコースをt = -15、-5分で行われます。クランププラズマ[3 - 3 H]のためのサンプルグルコースは、t = 80、90、100、110と120でとt = 100と120分でクランプインスリンに対して行われます。 2 [14 C]デオキシグルコースは、t = 120分とbで、サンプルの後に投与されるloodは、t = 2、15、25、後35分で収集されます。組織は、t = 35分のサンプルの後に行われます。

図4
図4:高脂肪食(HFD)のマウスに対照食のマウス(チョウ)を比較インスリンクランプ実験の結果。動脈グルコース(A)とGIR(B)、ベースラインとクランプインスリン(C)、EndoRa(D)、およびRd(E)と骨格筋(腓腹筋と外側広筋)RG(F)の時間経過が表示されます。すべての結果は、インスリン抵抗性を誘導するために、高脂肪食の効果を示している。

Discussion

高インスリン血症-正常血糖クランプ、またはインスリンクランプは、広く生体内でインスリンの作用を評価するための"ゴールドスタンダード"の方法と考えられている。この手法は、ヒト、イヌ、ラットやマウスを含むいくつかの種に適用されています。代謝性疾患のためのトランスジェニックマウスモデルの増加を考えると、マウスで使用するための技術の微細化は代謝の研究に大きな進歩を提供しています。

インスリンクランプの背後にある概念は単純ですが、実際にインスリンクランプ実験を行うためのさまざまなアプローチがあります。実験が行われる方法は、1を得られた結果に影響しますので、これは、些細な点ではありません。ここでは、ヴァンダービルトMMPCで使用されるプロトコルを提示する。我々のプロトコルや他の人のそれとの間の重要な違いは、我々は血液サンプルを得るために動脈カテーテルを使用することです。これはOBTのより広く使用されているアプローチとは対照的であるテール4、7、11、12、14から17の先端を切断することで血液サンプルをaining。動脈カテーテルからのサンプリングの利点は、実験が意識奔放マウスで実施されていることです。尾からのサンプリングはしばしば拘束を必要とし、大規模な血液サンプルが1を取得しているときにストレスの指標を向上させます。ストレスホルモンは、内因性グルコース産生を刺激し、グルコース処理18、19を損なう、潜在的にインスリン抵抗性の表現型の外観を与える。切断尾からサンプリングするため、そのストレスの多い性質の特殊な動物実験および使用委員会の承認を必要とする場合があります。動脈カテーテル法の手順は、尾を切断のマウスにストレスを回避するために開発されました。

インスリンクランプを行うことの重要な側面は、正常血糖を維持する能力です。正しくGIRは、血糖測定値に基づいて調整されるべきかを予測できるものアルゴリズムがありません。手術のような、インスリンクランプ実験を行う要員は、唯一の経験を通じて合理的な血糖値を維持するのに熟達するでしょう。ために彼らのより高い代謝率のマウスの研究から得られたデータは本質的に雑音になることに注意することは重要です。これは時間のグルコースとGIRのコースと血漿インスリン、endoRa、Rdと結果を解釈するためにあらゆるリーダーの能力のための重要なRgの絶対値を含むデータの完全なプレゼンテーションを、です。マウス(ヒトでの速度よりも約5倍)の高グルコースの流束率はグルコースのサンプリングの高周波数を保証。マウスの血液量が限られている間、一度、10分ごとの最小サンプリング周波数は、適切なクランプが確立されていることを確信する必要があります。

図4に示すように、クランプのインスリンレベルは、グループ間で異なる可能性があります。このような食事の介入、トランスジェニック操作やバックグラウンドの系統の違いなどの要因は、FASに影響を与える可能性がその後、クランプのインスリンレベルに影響を与える可能ティンのインスリンレベル、。クランプのインスリン濃度が異なる場合の結果を解釈するのが問題になる可能性があります。これは、実験群の間に相当するクランプのインスリンレベルを達成するインスリン注入速度を選択するためのパイロット実験を行うことにより対処することができます。また、ソマトスタチンは、膵臓のホルモンの分泌を抑制するために使用することができます、そしてインシュリンとグルカゴンは、実験的に制御するレートで交換することができます。この後者のアプローチは、より一般的にはマウスよりもラットにインスリンクランプで行われます。これらの実験的アプローチが取られていない場合、定常状態のGIRは、クランプインスリンレベルに正規化することができます、またはインスリン感受性指数(S I)は、S I = GIR /(G•ΔI)、などのクランプのデータから導出することができますGは、定常状態のグルコース濃度であり、ΔIは、空腹時やクランプのインスリン濃度との差です。どちらのアプローチで一つの仮定は達成クランプのインスリンレベルがあることです。インスリン感受性が直線的に研究されているグループに応じてインスリンのレベルに関連している範囲内で。インスリン抵抗性とインスリン感受性のグループを比較するときは、この後者の仮定は適用されない場合があります。理想的には、インスリンの用量反応曲線は、適切なインスリン注入を選択するために生成する必要があります。しかし、追加実験の必要性から、これはめったに行われません。

動脈カテーテルが提供する汎用性は、正常血糖クランプを超えた実験的なアプローチにも及ぶ。例えば、高血糖クランプは、グルコースが空腹時血糖値からの相対高血糖を維持するために可変速度で注入されている、 生体 2、20、21 内因性膵臓機能を評価するために使用することができます。このテスト中に第一段階のインスリン分泌の測定は、血液サンプルの頻繁な買収(毎2〜5分間すなわち)、尾の先端からサンプルを取得するときには不可能ですが必要です。また、尾サンプリングに起因する上昇カテコールアミンがインスリン分泌を障害するとグルカゴンの分泌22を高めることができる。インスリンクランプのプロトコルはまた、反規制への反応2、23、24を評価するために相対的な低血糖に低下する血糖値を可能にするために変更することができます。動脈カテーテルはまた、運動25から30の間にグルコース代謝の動態を評価するために使用することができます。これは、単一の時点の前後の運動時または分離された筋肉 ex vivoで実施された従来の手法よりも著しく有利で ​​ある。ここで紹介するテクニックは、だけでなくグルコースでなく、脂肪酸の代謝31を評価するために使用することができます。

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgements

この作品は、グラントヴァンダービルトマウスの代謝表現型のセンターに5 - U24 - DK059637 - 10によってサポートされていました。

References

  1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
  3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
  4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
  5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
  6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
  7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
  8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
  9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
  10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
  11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
  12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
  13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
  14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
  15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
  16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
  17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
  18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
  19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
  20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
  21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
  22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
  23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
  24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
  25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
  26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
  27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
  28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
  29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. (2004).
  30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

Comments

21 Comments

  1. Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 8:09 AM
  2. Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala

    Reply
    Posted by: Julio A.
    November 29, 2012 - 8:46 AM
  3. Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 9:39 AM
  4. Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 26, 2014 - 1:17 PM
  5. Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 26, 2014 - 2:06 PM
  6. Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 28, 2014 - 12:20 PM
  7. Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 28, 2014 - 3:42 PM
  8. Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.

    Reply
    Posted by: Joseph C.
    April 8, 2014 - 5:11 PM
  9. Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 11, 2014 - 4:15 PM
  10. Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    April 15, 2014 - 11:17 AM
  11. Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 16, 2014 - 10:32 AM
  12. Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 12:32 PM
  13. Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.

    Reply
    Posted by: Carlo M.
    October 2, 2014 - 1:29 PM
  14. Thanks. I will try it!

    Kai

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 4:11 PM
  15. Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:05 PM
  16. Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:25 PM
  17. Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:38 PM
  18. We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:31 PM
  19. Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 2:56 PM
  20. Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:47 PM
  21. Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    November 4, 2014 - 1:04 PM

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