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Iperinsulinemico-euglicemico Morsetti in Cosciente, Mouse sfrenato

1, 2,3, 3, 2,3, 3, 4, 2,3, 2,3

1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

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    Summary

    Il iperinsulinemico-euglicemico morsetto, o pinza insulina, è il gold standard per valutare l'azione dell'insulina

    Date Published: 11/16/2011, Issue 57; doi: 10.3791/3188

    Cite this Article

    Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

    Abstract

    Diabete di tipo 2 è caratterizzato da un difetto in azione dell'insulina. Il iperinsulinemico-euglicemico morsetto, o pinza insulina, è largamente considerato il "gold standard" metodo per valutare l'azione dell'insulina in vivo. Nel corso di un morsetto di insulina, iperinsulinemia è ottenuta da una infusione di insulina costante. Euglicemia è mantenuto tramite un infusione di glucosio concomitante ad un tasso variabile. Questa variabile velocità di infusione glucosio (GIR) è determinato dalla misurazione della glicemia a intervalli brevi durante tutto l'esperimento e regolando di conseguenza il GIR. Il GIR è indicativo di tutto il corpo l'azione dell'insulina, come i topi con l'azione dell'insulina maggiore richiedono una maggiore GIR. Il morsetto di insulina può incorporare somministrazione di isotopica 2 [14 C] desossiglucosio per valutare tessuto-specifici assorbimento di glucosio e [3 - 3 H] glucosio per valutare la capacità dell'insulina di sopprimere il tasso di comparsa di glucosio endogeno (Endora), un marker di produzione epatica di glucosio e di stimolare latasso di tutto il corpo scomparsa di glucosio (Rd).

    La miniaturizzazione del morsetto insulina per l'uso in modelli murini di malattie genetiche metaboliche ha portato a progressi significativi nella ricerca sul diabete. Metodi per l'esecuzione pinze insulina variano tra laboratori. E 'importante notare che il modo in cui viene eseguito un clamp di insulina possono influenzare significativamente i risultati ottenuti. Abbiamo pubblicato una valutazione completa dei diversi approcci a svolgere morsetti insulina nei topi coscienti 1 nonché una valutazione della risposta metabolica dei quattro ceppi del mouse comunemente usata inbred con tecniche varie morsetto 2. Qui vi presentiamo un protocollo per l'esecuzione di morsetti insulina cosciente, topi sfrenato sviluppato dal mouse Vanderbilt Metabolica Fenotipizzazione Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu / MMPC). Ciò include una descrizione del metodo per impiantare cateteri utilizzati durante il morsetto insulina. Il protocollo impiegato dalVanderbilt MMPC utilizza un esclusivo doppio catetere sistema a 3. Un catetere viene inserito nella vena giugulare per infusioni. Un catetere è inserito il secondo in arteria carotide, che consente il prelievo di sangue, senza la necessità di limitare o gestire il mouse. Questa tecnica fornisce un significativo vantaggio per il metodo più comune per ottenere campioni di sangue durante le fascette di insulina che è quello di campione dalla punta della coda mozzata. A differenza di questo ultimo metodo, il campionamento di un catetere arterioso non è stressante al mouse 1. Abbiamo inoltre descrivere i metodi per l'utilizzo di infusi traccianti isotopici per valutare tessuto-specifica azione dell'insulina. Abbiamo anche fornire orientamenti per la presentazione adeguata dei risultati ottenuti dai morsetti insulina.

    Protocol

    1. Preparazione di cateteri e Antenna del mouse per l'accesso di campionamento (MASA tm)

    1. Preparare un catetere arterioso inserendo un pezzo di 1,3 cm di PE-10 (0,011 pollici di diametro interno) in un pezzo di 6 cm di tubo silastic (0,012 pollici di diametro interno) come mostrato nella Figura 1A. Smussare la punta del PE-10 con un bisturi così la lunghezza a partire dalla fine del silastic alla punta dello smusso è di 0,9 cm.
    2. Preparare catetere venoso facendo scorrere un 1 pezzo di tubo silastic millimetri (0,020 pollici di diametro interno) 1,1 cm dalla fine smussato di un pezzo 6 cm di tubo silastic (0,012 pollici di diametro interno) come mostrato nella Figura 1B. Il 1 pezzo mm di silastic viene utilizzato come contenimento tallone.
    3. Per preparare un tm MASA, inserire ciascuno dei due pezzi di 1,3 cm di 25 connettori in acciaio inox calibro in ciascuno dei due 3 pezzi cm di PE-20 (0,015 pollici di diametro interno).
    4. Fissare il PE-20/connectors l'un l'altro facendo scorrere un pezzo di 5 mm silastictubi (0,040 pollici di diametro interno) sopra l'area in cui i tubi di acciaio e PE-20 si incontrano.
    5. Piegare i tubi d'acciaio ad un angolo di ~ 120 ° e separare ogni tubo da ~ 45 °.
    6. Luogo completato impianto in un ciuffo di adesivo siliconico medici in modo che il tubo PE-20 è verticale e le estremità dei tubi in acciaio inossidabile si estendono oltre l'adesivo (Figura 1C). Permettere che questo set per 24 ore.

    2. Cateterizzazione chirurgico

    1. Prima dell'intervento, sterilizzare cateteri con il 70% di etanolo, li riempiono con soluzione fisiologica eparinata (200 U eparina / ml soluzione salina) e inserire i tasselli in acciaio inox.
    2. Anestetizzare il mouse, preferibilmente utilizzando un metodo che fornisce continuamente l'agente anestetico (ad esempio isoflurano per via inalatoria).
    3. Usando la tecnica sterile, eliminare i peli dai siti di incisione con tagliaunghie e / o di una crema depilatoria e disinfettare la cute con alcool seguito da uno scrub Betadine. Per l'inserimento del catetere, rimuovere i peli sulregione che si estende dalla mascella inferiore alla parte superiore della gabbia toracica e tra le clavicole. Di esternalizzazione dei cateteri dietro la testa, rimuovere i capelli nella zona tra la base del cranio e della regione interscapolare e disinfettare la cute con alcool seguito da uno scrub Betadine.
    4. Posare il mouse sul dorso su una superficie di riscaldamento e sotto l'area di visualizzazione di un microscopio operatorio. Fissare la coda e le estremità con del nastro adesivo chirurgico. Fissare la testa nel cono consegnare l'anestesia.
    5. Fai una piccola incisione verticale mediana 5 millimetri cefalica allo sterno. Utilizzando pinze, smussato sezionare il tessuto per esporre il muscolo sternocleidomastoideo sinistro. Riflettere questo muscolo per esporre l'arteria carotide sinistra. Stuzzicare delicatamente fuori dal tessuto connettivo l'arteria. E 'importante a questo punto per isolare il nervo vago dalla arteria senza danneggiare l'arteria e il nervo.
    6. Isolare l'arteria e legare le estremità cefalica con sutura di seta. Vagamente un altro nodopezzo di sutura alla fine caudale della nave esposta.
    7. Morsetto vaso con un micro-serrefine pinza sull'estremità caudale e tagliate appena sotto alla fine legatura con le forbici a molla. Inserire con cautela catetere fino al morsetto. Attentamente rilasciare il micro-serrefine morsetto e far avanzare il catetere al silastic-PE giunzione.
    8. Cravatta entrambe le legature in modo sicuro al catetere e confermare che i campioni catetere collegando l'estremità libera del catetere ad una siringa di campionamento.
    9. Fare un altro 5 millimetri incisione a destra della linea mediana e di circa 2 mm caudale alla prima incisione. Utilizzando pinze, smussato sezionare il tessuto per esporre ed isolare la vena giugulare destra.
    10. Attentamente legare alla fine cefalica con sutura in seta e cravatta vagamente un altro pezzo di sutura alla fine caudale.
    11. Tagliato appena sotto la legatura cefalica con le forbici a molla e inserire il catetere fino al contenimento tallone. Tie una sutura dietro il tallone e confermare che i campioni del catetere.
    12. Turn il mouse sopra e fare una piccola incisione tra le scapole.
    13. Tunnel un 14-gauge sotto la pelle dall'incisione per il catetere arterioso, sulla parte anteriore del mouse, per l'incisione interscapolare sul retro. Infilare il catetere arterioso attraverso l'ago di esternare la parte posteriore del mouse. Ripetere questa operazione per il catetere giugulare mediante il tunneling del 14-gauge sotto la pelle sul lato destro del mouse dal sito incisione sulla parte anteriore per l'incisione interscapolare sul retro.
    14. Bloccare il catetere arterioso con un micro-serrefine morsetto al sito di incisione tra le scapole. Tagliare il catetere ~ 1 cm sopra il morsetto. Posizionare il tm MASA con i connettori in acciaio inox rivolto verso la testa del topo. Collegare il catetere arterioso al connettore in acciaio inox puntato verso il lato sinistro del mouse. Aver cura di garantire non ci sono buchi o pieghe nel catetere. Ripetere l'operazione per il catetere venoso,collegarlo al connettore in acciaio inox che punta verso il lato destro del mouse.
    15. Inserire il tm MASA nel incisione tra le scapole. I tubi in PE-20 corrispondente al catetere giugulare dovrebbe essere sul lato destro del mouse e il tubo PE-20 corrispondente al catetere arterioso dovrebbe essere quello di sinistra.
    16. Chiudere le incisioni ventrale e dorsale con sutura in nylon. Per la chiusura dorsale, la sutura può essere eseguito attraverso il silicone indurito del tm MASA per fissarlo in posizione. Confermare la pervietà dei cateteri utilizzando una soluzione di lavaggio contenente soluzione salina eparinizzata e un antibiotico per ridurre al minimo il rischio di infezione. Del mouse in un luogo riscaldato, gabbia pulita per il recupero immediato. La figura 2 mostra il prodotto finito.
    17. Lasciare il mouse per recuperare per almeno 5 giorni. Controllare il peso e la salute generale. Utilizzare l'appropriato post-operatorio regime analgesico come approvato dalla cura degli animali dell'istituzione eUsa comitato.

    3. Iperinsulinemico euglicemico-clamp

    1. Veloce il mouse per 5-6h. Come riferimento, il tempo t = 0 min si riferisce alla fine del digiuno e l'inizio della infusione di insulina e glucosio (cioè periodo il morsetto).
    2. La linea di impostazione e il tempo per un tipico esperimento sono illustrati nella Figura 3. Utilizza tubi micro-Renathane o equivalente per infusione e le linee di campionamento. Sospendere un dual-channel girevole sopra il mouse. Questo serve come un hub tra il mouse e infusione / campionamento siringhe. Durante l'esperimento, il mouse rimane a casa in una gabbia o contenitore simile ed è legato alla rotazione.
    3. Prima di collegare il mouse, riempire la linea arteriosa di campionamento con soluzione fisiologica eparinata (10 U eparina / ml soluzione salina) e inserire un connettore in acciaio inox, alla fine della linea di fondo. Lascia una siringa con soluzione fisiologica eparinata (clearing siringa) collegata alla parte superiore della linea di campionamento. Questo sarà utilizzato per redigere il sangue samples.
    4. Riempire la linea di infusione venosa con non eparinizzati salina a partire dal porto di infusione della girevole (segmento A in figura 3a) fino alla parte inferiore della linea. Inserire l'estremità superiore della linea e il luogo di un connettore in acciaio inossidabile (o di un connettore a Y se un bolo deve essere somministrato) alla fine della linea di fondo. Se un tracciante al glucosio isotopica (ad esempio [3 - 3 H] glucosio) viene infusa, garantire una siringa da 1 ml contenente il tracciante di una siringa di infusione. Riempire la linea di infusione venosa con tracciante al posto di soluzione salina (Figura 3B).
    5. Tre ore nel veloce, pesare il mouse e collegare il PE-20 per la vena giugulare e cateteri arteriosi per l'infusione e linee di campionamento, rispettivamente.
    6. Se l'amministrazione [3 - 3 H] glucosio tracciante, iniziare una mano di fondo-infusione continua tracciante al tempo t = -90 min (Figura 3C). Una tipica dose primaria è di 1 μCi. Preparare un 0,05 μCi / mL [3 - 3 H] glucosio solution non eparinizzati salina. Caricare la soluzione in una siringa da 1 ml e fissare la siringa in una pompa di infusione. Somministrare la dose primaria infondendo 20 l / min per 1 min. Seguire con una infusione continua di 0,05 μCi / min (1 ml / min) per un periodo di 90 minuti di equilibrio.
    7. Preparare sostanze infuse di insulina e glucosio. L'insulina viene preparato in non eparinizzati salina contenente il 3% del plasma come un vettore (un'adeguata concentrazione di BSA può anche essere utilizzato). Sostanze infuse glucosio sono disponibili in commercio in diverse concentrazioni (% 5, 20 e 50).
    8. Preparare soluzione salina lavato infusate erythorocyte ottenendo sangue intero da un topo donatore, preferibilmente dello sfondo stesso ceppo, come il mouse sperimentale. Tipicamente 1 ml di sangue intero è necessaria per lo studio del mouse. Centrifugare il sangue agli eritrociti separati. Lavare eritrociti con 10 U / ml soluzione salina eparinata e centrifugare a scartare la soluzione salina. Determinare il volume degli eritrociti e risospendere in un volume uguale di 10 U / ml heparisciuta salina.
    9. Disegnare ogni infusate in una siringa da 1 ml e sicuro ogni siringa per una pompa per infusione individuale. Collegare ogni siringa ad un connettore a 4-vie (Figura 3).
    10. A t = -15 min prendere un campione di sangue lentamente redazione 50-100 ml di sangue nella siringa radura. Fissare la linea arteriosa campionamento e rimuovere la siringa di compensazione. Usando un portatile glucometro, prendere una lettura di glucosio nel sangue, rimuovendo la pinza sulla linea di campionamento arteriosa e permettendo al sangue di fluire nella striscia misuratore di glucosio.
    11. Una volta che la misurazione del glucosio è presa, morsetto linea arteriosa campionamento e inserire un brusco-ago della siringa (siringa di campionamento) nella linea di campionamento arteriosa. Rimuovere il morsetto e disegnare un volume di sangue (vedi nota) nella siringa di campionamento. Fissare la linea arteriosa campionamento e rimuovere la siringa di campionamento. Inserire la siringa di compensazione indietro nella linea di campionamento arteriosa. Redigere lo stantuffo per eliminare eventuali bolle d'aria e re-infondere il50-100 ml di sangue che è stato originariamente disegnato.

    Nota: il volume di sangue campionato dipende dalle analisi in corso. Per esempio, l'analisi di [3 - 3 H] concentrazione di glucosio richiede 10 ml di plasma, quindi 50 ml di sangue sono tratte. Questo produce 20-30 ml di plasma, che è sufficiente per l'analisi più al plasma aggiuntive, se necessario. Misure di ormoni e altri metaboliti (ad esempio l'insulina, gli acidi grassi liberi) richiedono il campionamento di sangue aggiuntivo.

    1. Dispensare il sangue nella siringa di campionamento in un EDTA rivestite microprovette. Centrifugare e raccogliere il plasma. Mantenere il plasma in ghiaccio fino alla fine dello studio o immediatamente conservare a -20 ° C.
    2. Ripetere i passi da 3,12 a 3,10 con t = -5 min. Ottenere ulteriori sangue (50 ml) per la misurazione dei livelli plasmatici basali di insulina. Misurare ematocrito al basale da un prelievo di sangue in una provetta con eparina o EDTA trattati capillare. Le misurazioni ottenute from campioni di plasma al tempo t = -15 e -5 min rappresentano basale (a digiuno per esempio) valori.
    3. Dopo che il campione al tempo t = -5 min, riempire le linee di infusione di emazie di glucosio, insulina e salso-lavato fino al connettore a 4 vie. Collegare il connettore a 4 vie per il tubo collegato alla porta girevole infusione (o il tubo collegato al connettore a Y se infondendo [3 - 3 H] glucosio) come mostrato in Figura 3.
    4. Iniziate versando la soluzione salina-eritrociti lavati prima. Impostare la velocità di infusione per sostituire il volume totale del sangue che viene campionata per tutta la durata dello studio (ad esempio se un totale di 500 ml di sangue sono campionati oltre 120 minuti di studio, impostare la velocità di infusione a 4,2 microlitri / min). A differenza della altre sostanze infuse, la soluzione degli eritrociti è di colore rosso. Infondendo questa soluzione consente prima di qualsiasi potenziale resistenza o ostruzioni nelle linee di infusione di essere identificati e corretti.
    5. Una volta che il infusate eritrociti raggiunge il mouse, avviare l'insulina einfusioni di glucosio. Questo è ora t = 0 min. L'insulina è infuso in una costante, pre-determinata tariffa. Una velocità di infusione di insulina di 4 mU • • kg -1 min -1 in genere sopprimere la produzione endogena di glucosio da 80-100% e stimolare la scomparsa di glucosio dal 2-3 volte. L'iniziale velocità di infusione di glucosio (GIR) è stimato in base ai livelli basali di glucosio nel sangue e precedente esperienza.
    6. Se infondendo [3 - 3 H] glucosio, si può scegliere di aumentare la velocità di infusione del tracciante per soddisfare l'aumento stimato del fatturato glucosio (tipicamente un aumento di 2-3 volte).
    7. Considerando l'alto tasso di turnover del glucosio nel topo, i campioni di sangue sono ottenuti dalla linea arteriosa non meno di ogni 10 min per la misurazione della concentrazione di glucosio per tutta la durata dell'esperimento. Regolare il GIR per raggiungere e mantenere euglicemia bersaglio (Figura 3C). Questo obiettivo può variare a seconda del modello o le finalità dello studio. Un buon obiettivo glucose concentrazione è di 150 mg • dL-1 dal momento che questo è un tipico livello di 6h di glucosio a digiuno per un chow-fed C57BL/6J del mouse.
    8. L'obiettivo è quello di raggiungere rapidamente euglicemia, idealmente entro i primi 40-50 minuti, e di avere glucosio e stabile GIR entro l'inizio del periodo di steady-state (t = 80 min).
    9. Se infondendo [3 - 3 H] glucosio, ottenere ulteriori sangue al tempo t = 80, 90, 100, 110 e 120 minuti per la misura di plasma [3 - 3 H] glucosio attività specifiche.
    10. Raccogliere il sangue aggiuntivi al tempo t = 100 e 120 minuti per la misura di insulina plasmatica e qualsiasi altro ormone (s) o metabolita (s). T = 110 min, prelievo di sangue in una provetta con eparina o EDTA trattati capillare per la misurazione del morsetto ematocrito.
    11. Dopo che il campione al tempo t = 120 min è preso, 2 [14 C] desossiglucosio può essere somministrato per la misurazione del tessuto-specifiche glucosio. Amministrare un 12 μCi bolo nella linea bolo collegato alla linea di campionamento giugulare (Figura 3B
    12. Ottenere campioni di sangue (50 ml) dalla linea di campionamento arteriosa al tempo t = 2, 15, 25 e 35 minuti dopo la somministrazione del bolo per la misurazione di plasma 2 [14 C] desossiglucosio livelli.
    13. Dopo l'ultimo campione, anestetizzare il mouse con una infusione di pentobarbital dato direttamente nella linea arteriosa. Dissezionare rapidamente di qualunque tessuto necessario per la valutazione di assorbimento di glucosio (ad esempio muscoli scheletrici di vario tipo, tessuto adiposo, cuore, cervello) ed eventuali altri tessuti (es. fegato, milza, reni). Snap tessuti congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino al momento dell'analisi. Glucosio tessuto viene analizzato misurando l'accumulo di fosforilato 2 [14 C] desossiglucosio nei tessuti congelati e la scomparsa di 2 [14 C] desossiglucosio dal plasma.

    4. Rappresentante Risultati

    Un esempio dei risultati ottenuti da un esperimento pinza insulina è mostrato in Figura 4.Questo esempio mostra la capacità di una dieta ricca di grassi per l'insulino-resistenza precipitare nei topi. Tutte le presentazioni dei risultati pinza insulina deve includere le seguenti essere interpretabile: un corso di tempo dei livelli di glucosio nel sangue, un corso di tempo dei GIR e dei livelli di insulina plasmatica (linea di base e morsetto). Come mostrato qui, glicemia a digiuno (Figura 4A) e insulina (Figura 4C) i livelli sono più alti nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi, indicativo di insulino-resistenza. Presentazione di un corso di tempo dei livelli di glucosio nel corso dello studio morsetto (Figura 4A) permette al lettore di valutare come euglicemia stata mantenuta, il che è indicativo della qualità del morsetto. Allo stesso modo, un corso momento del GIR (Figura 4B) permette al lettore di determinare quanto rapidamente una steady-state è stato raggiunto. La manifestazione di questi dati come corsi di tempo è molto più informativo rispetto alla pratica tradizionale nella letteratura morsetto insulina topo di presentare un esperimento di 2 orecome un punto di riferimento unico che rappresentano i valori medi di un indefinito periodo di "pinza" (4-13). Nel presente esempio, i livelli di glucosio erano uguali tra il controllo e alto contenuto di grassi alimentati i gruppi, ma il GIR era significativamente più basso nel settore high-grasso nutrito gruppo (Figura 4B). Questo è indicativo di un danno in tutto il corpo l'azione dell'insulina. Morsetto livelli di insulina sono stati anche maggiori nel settore high-grasso nutrito gruppo (Figura 4C), sostenendo ulteriormente la presenza di un fenotipo insulino-resistente in questi topi. L'uso di infusi traccianti isotopici permette per la valutazione della azione dell'insulina in tessuti specifici. [3 - 3 H] glucosio viene utilizzato per stimare il tasso di comparsa di glucosio endogeno (Endora), che è un indice della produzione epatica di glucosio (HGP) e il tasso di tutto il corpo la scomparsa di glucosio (Rd). Mentre l'insulina sopprime completamente HGP nei topi di controllo, questo è alterata nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi (Fig. 4D). Allo stesso modo, la capacità di inSulin per stimolare la Rd in topi di controllo è compromessa nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi (4E Figura). 2 [14 C] desossiglucosio viene usato per valutare l'indice del metabolismo del glucosio (Rg), una misura di tessuto-specifica l'assorbimento del glucosio. Come si è visto in questo esempio, insulino-stimolato l'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico è alterata nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi (4F Figura).

    Figura 1
    Figura 1: Preparazione della arteriosa (A) e (B) cateteri venosi e (C) MASA tm. Cateteri arteriosi sono preparati inserendo un pezzo di 1,3 cm di PE-10 di circa 3 mm in un pezzo 6 cm di 0,012 "silastic ID. Il PE-10 punta è smussato in modo che la lunghezza dalla coppia conica al silastic è di 0,9 cm. Venoso cateteri sono realizzati facendo scorrere un piccolo pezzo di 0.020 "ID silastic 1,1 centimetri dall'estremità smussata di un pezzo 6 cm di 0,012" silastic ID. I 0.020 "atti pezzo ID silastic come una goccia di ritenuta per sé curare il catetere alla vena giugulare. Per il montaggio del tm MASA, ciascuno dei due 1.3 cm 25-gauge connettori è inserito in ciascuno dei due 3 pezzi cm di PE-20. Queste sono tenute insieme da un piccolo pezzo di 0,040 "silastic ID. I connettori sono piegate ad un angolo di 120 ° e separati in un angolo di 45 °. L'intera assemblea è immerso in silicone medicale.

    Figura 2
    Figura 2: mouse cateterizzati. Cateteri sono impiantato chirurgicamente nella arteria carotide sinistra e la vena giugulare destra. Le estremità libere dei cateteri sono esternalizzati dietro la testa e collegato ad un tm MASA. Il tm MASA viene inserito per via sottocutanea tra le scapole. Ciò permette un accesso vascolare durante gli esperimenti morsetto insulina senza la necessità di frenare, gestire o anestetizzare il mouse.

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    Figura 3: Rappresentazione della linea di impostazione e il tempo per un esperimento pinza insulina. Il mouse è legato ad un doppio canale girevole che agisce come un hub per infusione e siringhe di campionamento. Configurazioni tipiche per gli esperimenti non usare infusioni tracciante (A) e utilizzando sia [3 - 3 H] glucosio e 2 [14 C] desossiglucosio (B) vengono visualizzati. Una linea del tempo di procedure per l'impostazione e l'esecuzione di insulina il morsetto (C) viene anche mostrato. Durante la pinza, i campioni di sangue ( sangue ) Vengono effettuate ogni 10 minuti per misurare la glicemia. Il GIR è adeguato di conseguenza per mantenere euglicemia. I campioni di sangue di glucosio al basale, l'insulina plasma e plasma [3 - 3 H] glucosio sono prese a t = -15 e -5 min. I campioni di plasma morsetto [3 - 3 H] glucosio sono prese a t = 80, 90, 100, 110 e 120 e per l'insulina morsetto a t = 100 e 120 min. 2 [14 C] desossiglucosio è somministrata dopo il campione al tempo t = 120 min e blood viene raccolto a t = 2, 15, 25 e 35 minuti dopo. I tessuti sono prese dopo il t = 35 min campione.

    Figura 4
    Figura 4: I risultati di un esperimento pinza insulina confrontando topi con una dieta di controllo (Chow) a topi con una dieta ricca di grassi (HFD). Durata di glucosio arteriosa (A) e di insulina GIR (B), al basale e morsetto (C), Endora (D), e Rd (E) e nel muscolo scheletrico (gastrocnemio e vasto laterale) Rg (F) sono mostrati. Tutti i risultati indicano l'effetto di alta alimentazione di grassi per indurre insulino-resistenza.

    Discussion

    Il iperinsulinemico-euglicemico morsetto, o pinza insulina, è largamente considerato il "gold standard" metodo per valutare l'azione dell'insulina in vivo. Questa tecnica è stata applicata a diverse specie tra cui gli esseri umani, cani, ratti e topi. Dato il numero crescente di modelli di topi transgenici per i disturbi metabolici, la miniaturizzazione della tecnica per l'utilizzo nel topo ha fornito significativi progressi alla ricerca del metabolismo.

    Mentre i concetti dietro il fermo di insulina sono semplici, in pratica ci sono diversi approcci per l'esecuzione di esperimenti di clamp insulina. Questo non è un punto banale, dal momento che il modo in cui viene eseguito l'esperimento interessa risultati ottenuti 1. Qui vi presentiamo il protocollo utilizzato dal MMPC Vanderbilt. La distinzione fondamentale tra il nostro protocollo e quella di altri è che usiamo un catetere arterioso per ottenere campioni di sangue. Ciò è in contrasto con l'approccio più diffuso di OBTaining campioni di sangue da troncare la punta della coda 4, 7, 11, 12, 14-17. Il vantaggio di campionamento da un catetere arterioso è che l'esperimento è condotto in un topo consapevole e sfrenato. Campionamento dalla coda spesso richiede moderazione e aumenta gli indici di stress quando i campioni di sangue di grandi dimensioni vengono acquisiti 1. Ormoni dello stress stimola la produzione endogena di glucosio e mettere in pericolo lo smaltimento del glucosio 18, 19, potenzialmente dando l'apparenza di un fenotipo insulino-resistenti. Campionamento dalla coda mozzata potrebbe richiedere speciali Cura degli animali e del Comitato Istituzionale l'approvazione Usa per la sua natura stressante. La procedura di cateterismo arterioso è stato sviluppato per evitare lo stress al mouse di separare gli coda.

    Un aspetto fondamentale di realizzare pinze insulina è la capacità di mantenere euglicemia. Non ci sono algoritmi in grado di predire correttamente come il GIR deve essere regolato sulla base di letture di glucosio nel sangue. Come la chirurgia,personale che esegue esperimenti di clamp insulina diventare abili nel mantenere euglicemia ragionevole solo attraverso l'esperienza. E 'importante notare che a causa del loro tasso metabolico più elevato i dati ottenuti dagli studi del mouse sarà intrinsecamente rumorosa. Questo rende la presentazione completa dei dati, compresi i corsi tempo di glucosio e GIR e valori assoluti di insulina plasmatica, Endora, Rd e Rg cruciale per la capacità di qualsiasi lettore di interpretare i risultati. L'elevato tasso di glucosio nel flusso del mouse (circa 5 volte superiore al tasso nell'uomo) garantisce un'alta frequenza di campionamento di glucosio. Mentre il volume di sangue del mouse è limitato, una frequenza di campionamento minima di una volta ogni 10 minuti è necessario essere certi che un morsetto adeguato è stato raggiunto.

    Come mostrato nella Figura 4, i livelli di insulina morsetto può essere diversa tra i gruppi. Fattori come la dieta interventi, manipolazioni transgeniche o le differenze nei ceppi sfondo può influenzare faslivelli di insulina Ting, che possono influenzare i livelli di insulina in seguito morsetto. Interpretazione dei risultati quando i livelli di insulina sono diversi morsetto può essere problematico. Questo può essere affrontato sperimentalmente eseguendo esperimenti pilota di selezionare velocità di infusione di insulina che consentano di raggiungere livelli equivalenti morsetto di insulina tra i gruppi. In alternativa, la somatostatina può essere utilizzato per inibire l'ormone della secrezione pancreatica, e l'insulina e il glucagone può essere sostituito a tassi sperimentalmente controllati. Quest'ultimo approccio è più comunemente fatto in fascette di insulina in ratti che topi. Se questi approcci sperimentali non vengono presi, allo steady-state GIR può essere normalizzata al livello di insulina morsetto, o un indice di sensibilità insulinica (S I) può essere ricavato da dati morsetto come S = I GIR / (G • ΔI), dove G è allo steady-state concentrazione di glucosio e ΔI è la differenza tra le concentrazioni di insulina a digiuno e morsetto. Un assunto con entrambi gli approcci è che il livello di insulina morsetto raggiunto èall'interno del campo in cui la sensibilità all'insulina è linearmente correlata al livello di insulina a seconda del gruppo oggetto di studio. Questa seconda ipotesi non può applicare quando si confrontano insulino-resistenti e gruppi sensibili all'insulina. Idealmente, una dose di insulina curva di risposta dovrebbe essere generato per selezionare l'appropriata infusione di insulina. Tuttavia, a causa della necessità di ulteriori esperimenti, ciò avviene raramente.

    La versatilità fornita da cateterismo arterioso si estende al di là di approcci sperimentali morsetti euglicemico. Per esempio, fascette iperglicemia, in cui viene infuso glucosio a tasso variabile per mantenere l'iperglicemia rispetto alla glicemia a digiuno, può essere utilizzato per valutare la funzione endogena del pancreas in vivo 2, 20, 21. La misura della secrezione di insulina prima fase nel corso di questo test richiede l'acquisizione frequente di campioni di sangue (cioè ogni 2-5 minuti), che non è possibile ottenere campioni quando dalla punta della coda. Inoltre,catecolamine elevato relativi al campionamento coda può mettere in pericolo la secrezione di insulina e migliorare la secrezione di glucagone 22. Il protocollo morsetto insulina può anche essere modificato per consentire livelli di glucosio a cadere a ipoglicemia rispetto per valutare contro-regolatore di risposta 2, 23, 24. Cateterismo arterioso può essere utilizzato anche per valutare le dinamiche del metabolismo del glucosio durante l'esercizio fisico 25-30. Questo è decisamente vantaggioso rispetto agli approcci convenzionali condotto in momenti singoli pre-e post-esercizio o negli isolati ex vivo muscoli. Le tecniche qui presentate può essere utilizzato anche per valutare non solo il glucosio, ma anche il metabolismo degli acidi grassi 31.

    Disclosures

    Nessun conflitto di interessi dichiarati.

    Acknowledgements

    Questo lavoro è stato sostenuto da Grant 5-U24-DK059637-10 al Centro Fenotipizzazione mouse Vanderbilt Metabolica.

    References

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    31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

    Comments

    21 Comments

    Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona
    Reply

    Posted by: Rona S.November 29, 2012, 8:09 AM

    Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala
    Reply

    Posted by: Julio A.November 29, 2012, 8:46 AM

    Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona
    Reply

    Posted by: Rona S.November 29, 2012, 9:39 AM

    Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,
    Reply

    Posted by: Teayoun K.March 26, 2014, 1:17 PM

    Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio
    Reply

    Posted by: Julio A.March 26, 2014, 2:06 PM

    Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,
    Reply

    Posted by: Teayoun K.March 28, 2014, 12:20 PM

    Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.
    Reply

    Posted by: Julio A.March 28, 2014, 3:42 PM

    Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.
    Reply

    Posted by: Joseph C.April 8, 2014, 5:11 PM

    Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio
    Reply

    Posted by: Julio A.April 11, 2014, 4:15 PM

    Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.
    Reply

    Posted by: Kai M.April 15, 2014, 11:17 AM

    Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.
    Reply

    Posted by: Julio A.April 16, 2014, 10:32 AM

    Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 12:32 PM

    Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.
    Reply

    Posted by: Carlo M.October 2, 2014, 1:29 PM

    Thanks. I will try it!

    Kai
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 4:11 PM

    Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:05 PM

    Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 1:25 PM

    Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:38 PM

    We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:31 PM

    Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 2:56 PM

    Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 1:47 PM

    Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.
    Reply

    Posted by: Kai M.November 4, 2014, 1:04 PM

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