Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR

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Summary

primers와 열린 독서 프레임 1 (ORF1) ORF2 접합 영역입니다 노로 바이러스의 게놈 중 가장 보존 지역에 대한 구체적인 TaqMan 프로브를 이용하여 아이들의 stools에서 탐지 및 노로 바이러스의 분리의 genogroup 식별을위한 원 - 스텝 RT-PCR 분석 설명했다. 비상업적인 비용 효율적인 RNA 추출 방법을 자세히 설명하고 있습니다.

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Apaza, S., Espetia, S., Gilman, R. H., Montenegro, S., Pineda, S., Herhold, F., et al. Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR. J. Vis. Exp. (65), e3232, doi:10.3791/3232 (2012).

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Abstract

Noroviruses (NoVs)는 모든 연령층의 사람에있어서 세계적으로 산발적 급성 위장염의 발생의 주요 원인입니다. 그들은 Rotavirus의 그것과 유사한 공중 보건에 미치는 영향과 아동 입원의 중요한 원인입니다. NoVs 좋은 유전자 다양성의 RNA 바이러스이며 새로운 변종의 지속적인 모습이 있습니다. 다섯 genogroups 인식되며, GI과 GII들의 많은 genotypes과 인간의 감염에 대한 가장 중요한되고 subtypes와 함께. 그러나,이 두 genotypes의 진단은 진단과 치료를 지연, 문제가 남아 있습니다. 1, 2, 3

대변​​ 표본에서 RNA 추출에 가장 일반적으로 사용되는 방법은 Qiagen에서 QIAmp 바이러스성 RNA 상용 키트입니다. 이 메서드는 버퍼, 실리카 겔 막의 바인딩 속성을 결합하여 그 제어 RNases 및 microspin의 속도와 함께 컬럼으로 RNA의 최적의 바인딩을 제공합니다. 이 방법은 간단하고 빠르고 신뢰성이 있으며 카입니다제조 업체에서 제공한 설명에 자세히되는 몇 가지 단계에 뻔했어.

노로 바이러스는 설사의 가장 흔한 원인으로서 rotavirus에게만 초입니다. 노로 바이러스 진단은 설사의 pathogenesis에 대한 모든 연구에서뿐 아니라 발병이나 개별 설사 케이스에서 사용할 수 있어야합니다. 현재는 그러나 노로 바이러스 진단은 진단 간단한 방법의 부족으로 인해 단 몇 센터로 제한됩니다. 이 지연 진단 및 치료 1, 2, 3. 또한, 국가 사이와 사이의 비용과 부식성 버퍼의 규제로 인해 교통이 병참 문제를 포즈 이러한 제조 키트를 사용하십시오. 따라서이 프로토콜에 우리는 원래 붐을 기반으로 대안, 경제, 사내 방법을 설명 guanidinium thiocyanate의 안티 nuclease 특성과 함께 실리카 입자의 핵산 바인딩 속성을 사용합니다. 방법 4 .

외 의해 설명되어 primers를 사용 5.의 주요 단백질에서 높은 변수 N-터미널 - 껍질을 대상으로 기존의 RT-PCR의 경우 상세하게됩니다. 종래의 PCR에서 PCR 제품의 시퀀싱하면 GI과 GII의 genogroups에 속하는 genotypes의 차별을 가능하게합니다.

Protocol

1. 대변​​ 샘플

  1. 대변​​ 샘플은 RNA를 유지하기 위해 냉동 보관해야합니다. 10 % 배설물 현탁액을 하시려면 해동 대변 샘플의 약 0.1 g을 가지고 PBS 1 개 ML을 완료합니다.
  2. 피할 200 μl의 나누어지는은 동결 융해 반복했다. -70 ° C.에 aliquots를 저장
  3. 영유권 및 추출에 사용하기 전에 10 분 동안 4천그램에서 aliquots을 원심 분리기.

2. 구아니딘 및 실리카로 추출을위한 실리카 입자의 작성

  1. RT에서는 이산화 규소 30 G를 중지하고 최대 250 ML에 DH 2 O와 완료합니다.
  2. 침전의 24 시간 후에 흡입에 의해 뜨는의 215 ML을 제거합니다. 최대 250 ML에 DH 2 O를 추가하고 흔들림으로 실리카 펠렛을 일시 중지합니다.
  3. 또 24 시간 후에 흡입에 의해 뜨는을 제거하고 pH를 2.0으로 실리카 현탁액의 산도를 조정, 염산 (HCL)을 사용합니다. 유리 봇에서 나누어지는 실리카 현탁액을tles 및 압력솥.

3. 구아니딘 및 실리카로 추출을위한 L6 버퍼의 작성

  1. RT에서, 0.1 M 트리스 염산염, 산도 6.4, 그리고 0.2 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0 용액 중 11 ML의 50 ML에 X-100 guanidinium thiocyanate의 60 G (GuSCN)와 트라 이튼 1.3 g을 용해하여 L6 버퍼를 준비합니다.

4. 구아니딘 및 실리카로 추출을위한 L2 버퍼의 작성

  1. RT에서, 0.1 M 트리스 염산염, 산도 6.4의 150 ML에 guanidinium thiocyanate 180 G (GuSCN)을 해소하여 L2 버퍼를 준비합니다.

5. 추출 절차

  1. 각 추출에 월 긍정적인 대변 샘플은 긍정적인 제어 및 DEPC 처리 물로, 부정적인 컨트롤로 포함되어야합니다.
  2. 마이크로 원심 튜브에 다음을 섞어, 버퍼 L6, 실리카 입자 20 μL 1 ML, 그리고 10 % 배설물 추출물 서스펜션 200 μL를 추가합니다. 와동의 간략 15 마일을 위해 RT에두고N.
  3. 10 s에 대한 6천그램에서 현탁액을 원심 분리기와 70 %의 에탄올을 가진 두 세차장 및 아세톤으로 한 번에이어서, 두 버퍼의 L2의 1ml와 펠렛을 씻는다. 5 분 동안 56에서 건조 가열 블록 ° C로 펠렛을 건조합니다.
  4. RNase가없는 DH 2 0 50 μL를 추가하여 실리카 펠렛의 하이드 RNA. 15 분 동안 RNasin 1 μL, 56에서 반전 튜브 및 부화에 의한 믹스 ° C를 추가합니다.
  5. 탁상 원심 분리기에서 전속력으로 3 분 동안 원심 분리기와 RNA를 포함하는 표면에 뜨는 40 μL를 수집합니다.
  6. Nanodrop 2000 분광 광도계 (써모 과학)을 사용하여 압축을 푼 RNA 샘플을 계량. 그렇다면 -70에서 보관 ° C를 이용 때까지 최대 6 개월까지. (참고 : 손상 총 RNA를 유지하기 위해 더 좋은 방법은 cDNA로 변환합니다.)

6. 상업 RNA QIAamp 바이러스성 RNA Kit를 사용하여 대체 추출

전체 지침은 책자 prov에서 발견되는QIAGEN 키트 ided. 다음과 같이 간단히 절차는 다음과 같습니다

  1. 버퍼 AVL의 Pipet 560의 μL은 1.5 ML 튜브로 캐리어 RNA를 포함하고, 10 %의 대변 현탁액 140 μL를 추가합니다. 15 초위한 펄스 vortexing하여 섞는다. 10 분 동안 RT에서 품어.
  2. 15 초 동안 펄스 vortexing에 의해 시료와 혼합으로 에탄올의 560 μL (96~100%)를 추가 후 간단히 원심 분리기.
  3. 2 ML 회수 관에 배치 스핀 컬럼이 솔루션의 630 μL을 적용합니다. 6천g에서 1 분 동안 원심 분리기, 그리고 깨끗한 두 ML 관에 스핀 컬럼을 넣으십시오.
  4. 1 분 용 6천그램에서 버퍼 AW1 및 원심 분리기 500 μL로 묶인 RNA를 포함하는 컬럼을 씻으십시오. 깨끗한 두 ML 수집 관에서 개최 칼럼.
  5. 3 분은 최고 속도 (20,000 G 또는 14,000 RPM)에서 500 버퍼 AW2의 μL와 원심 분리기로 열을 씻으십시오.
  6. 깨끗한 1.5 ML 마이크로 원심 분리기 튜브의 장소 스핀 컬럼은 40 μL DEPC-처리된 물을 추가하고 전속력으로 RNA를 elute. 에 반복eluted RNA의 최종 80 μL를위한 CE.
  7. Nanodrop 2000 분광 광도계 (써모 과학)을 사용하여 압축을 푼 RNA 샘플을 계량. 그렇다면 -70에서 보관 ° C를 이용 때까지 최대 6 개월까지. (참고 : 손상 총 RNA를 유지하기 위해 더 좋은 방법은 cDNA로 변환합니다.)

7. 한 단계 실시간 특정 Taqman 프로브와 RT-PCR에 의해 추출된 RNA의 노로 바이러스의 검출

악기 StepOnePlus 리얼 타임 PCR 시스템 (응용 Biosystems).

방법론

  1. 닦아내기 및 기타 잠재적인 RNase 오염을 제거 행방불명 RNase와 함께 모든 작업 표면, pipettes, 그리고 원심 분리기를 청소합니다.
  2. Pipet 월 GI과 GII 심사 마스터는 표 1에 따라 혼합. Primers 및 Taqman 프로브는 표 2에 나열되어 있습니다.
  3. 각 반응 튜브에 맞는 마스터 믹스 나누어지는 10 μL.
  4. undiluted 미지 시료의 5 μL를 추가하십시오해당 반응 우물에 각각 RNA, DEPC-처리된 대조군과 같은 물, 혹은 GI GII 긍정적인 제어 RNA. 모든 샘플은 중복으로 실행해야합니다. 각각 300 μg / μL와 500 μg / μL의 농도로 긍정적인 컨트롤과 기준은 질병 통제 예방을위한 국립 Calicivirus 연구실 센터 (CDC)에 의해 제공되었다.
  5. 10 초 동안 6,000g에 반응 판을 원심 분리기.
  6. 실험 등록 정보 화면에서, 실행을위한 실험의 종류를 정의하고 선택합니다. TaqMan의 시약은 시약의 종류 및 그 사전 PCR 증폭 읽기와 선택으로 표시하고 있는지 확인하십시오.
  7. 표 3에서 열 프로파일을 사용하여 15 μL 반응을 실행합니다.
  8. 결과를 분석.

8. 기존의 RT-PCR과 장면을 사용하여 월 GI과 GII의 Genotyping

(이것은 일반적이고 널리 사용되는 방법 이니 그것은이 동영상에서 언급하지 않은 것.)

악기는. Biosystems StepOne 및 Quantitec 템플릿과 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템을 적용했습니다.

방법론

  1. genotyping 전에 샘플 genogroup (GI 또는 GII)은 RT-PCR은 위에서 설명한 심사에 따라 결정됩니다. GI 월 RNA는 GII genotyping 마스터 믹스와 GI의 genotyping 마스터 믹스와 GII 월 RNA와 증폭되어야한다.
  2. Pipet 월 GI과 GII genotyping 마스터는 표 4에 따라 혼합. Primers GI SKF / SKR 및 G2 SKF / SKR은 표 5에 나열되어 있습니다.
  3. 0.2 ML 반응 튜브에 적합한 마스터 믹스 나누어지는 45 μL.
  4. 각 부정적인 제어 튜브에 DEPC-처리된 물에서 5 μL, 그리고 사전 스크린, 월 (GI 및​​ / 또는 GII) 해당 반응 튜브에 긍정적인 RNA의 5 μL를 추가합니다.
  5. 표 6에 온도 프로파일을 사용하여 50 μL 반응을 실행합니다.
  6. PCR 제품 contai 보내기적어도 100은 증폭 capsid 지역의 μL / NG 정화 및 시퀀싱을위한 회사 Macrogen하기 닝. (시퀀싱 당 9,700 위대한 세네카 Hwy. 락빌, 메릴랜드 20850 및 샘플 당 $ 10).

9. 대표 결과

그림 1
그림 1은 Taqman diarrheal 아이들의 대변 샘플에서 추출한 RNA 분석에 사용되는 원 - 스텝 RT-PCR에서 대표적인 결과를 보여줍니다. 긍정적인 샘플에 대한 문턱주기 (CT)은 GII를위한 GI와 CT 39 이하 CT 37 같음에서 설정되었습니다. 긍정적인 컨트롤을위한 CT-값은 각각 27, GI과 GII위한 ORF1-ORF2 교차점 18 미만이어야하는 것으로 확인되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 2
그림 2

마스터 믹스 최종 Conc 볼륨 (μL)
H 2 0 PCR 2.875
Quantitect RT-PCR 마스터 믹스 1X 6.250
RT 믹스 1X 0.125
50 μm의 예지 자의 R 프라이머 1 μm의 0.250
50 μm의 예지 F 조의 입문서 일μm의 0.250
10 μm의 링 프로브 1 μm의 0.125/0.250 *
10.00

각 프로브의 0.125 μL가 GII 시험에 사용되는 동안 각 프로브의 * 0.250 μL은 GI 테스트에 사용되었다.

심사 GI과 GII위한 표 1. Qiagen Quantitect 마스터 믹스 (트루히요 외., 2006) 7.

이름 제노 - 그룹 사용 시퀀스 (5 '3')
코그 1R 노병 뇌관 CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C
코그 1 층 노병 뇌관 CGY TGG ATG CGN TTY CAT 조지아
코그 2R GII 뇌관 TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
코그 2 층 GII 뇌관 자동차 GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG
반지 1A 노병 탐침 우리 식구들-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1
링 1B 노병 탐침 우리 식구들-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1
Ring2-TP GII 탐침 우리 식구들-TGG 개그 GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1

표 2. 프라이머와 genogroups I, II (Kageyama 외.위한 실시간 정량 RT-PCR에 사용되는 프로브 oligonucleotides,2003) 8.

단계 온도 (° C) 시간 (분)
50 30:00 cDNA 합성
2 95 15시 HotStart DNA 형성 촉매 효소의 활성화
3 95 0시 15분
60 1시 45X주기

테이블3.를위한 써멀 프로파일 한 단계 Taqman 실시간 RT-PCR (트루히요 외., 2006) 7.

마스터 믹스 최종 Conc 볼륨 (μL)
H 2 0 PCR 29.50
5 배 Qiagen RT-PCR 버퍼 1X 10.00
10 MM dNTP 믹스 0.4 MM 2.00
효소 믹스 2.00
40 U / μL RNAsin 20 U / μL 0.50
10 μm의 SKF 0.1 μm의 0.50
10 μm의 제품 SKR 0.1 μm의 0.50
45.00

표 4. Qiagen genotyping GI과 GII를위한 원 - 스텝 RT-PCR 마스터 믹스.

이름 제노 - 그룹 사용 시퀀스 (5 '3')
G1SKF 노병 뇌관 5'-CTG C​​CC GAA TTY GTA AAT GA - 3
G1SKR 노병 뇌관 5'-CCA ACC 차 CCA TTR 전술 - '3
G2SKF GII 뇌관 5'-CNT GGG AGG GCG ATC GCA - 3
G2SKR GII 뇌관 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3

표 5. Primers는 Capsid 지역의 지역 C (코지마 외., 2002)의 증폭에 사용 5.

단계 온도 (° C) 시간 (분)
60 30:00 cDNA 합성
2 96 15시 HotStart DNA 형성 촉매 효소의 활성화
3 94 0시 3분0
52 1시 40X주기
72 0시 반
4 72 10시 가열 냉각

표 6. Taqman 원 - 스텝 RT-PCR을위한 열 프로필입니다.

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Discussion

대변​​ 샘플로부터 핵산을 분리해위한 방법을 사내에 경제를 사용하여, 우리는 Qiagen의 상업 QIAmp 바이러스성 RNA 키트와 마찬가지로 동일한 결과를 얻을, 함께 TaqMan RT-PCR 저희 연구실에서 개발된들과 우리 월 광범를 감지할 수 있습니다 GI과 GII genogroup에 속하는 genotypes. 지역 C 프로토콜의 최근 출간은 78 % 6의 genotyping 속도를 보도했다. 현대 월의 종자의 다양성 이전 년 동안 증가되어 있기 때문에 성공률 테스트중인 표본에 대한 지역 C의 primers의 불일치에 따라 달라집니다. 그것 때문에 시간이 7 주위의 회전을 단축, 사후 증폭 제품 처리를 제거로서 분석은 일상적인 진단하는 데 유용합니다. 외에도 진단에서이 프로토콜은 또한 따라서이 질환의 공중 보건 관리에 유용되고, 월 감염의 역학을 명확히 사용할 수 있습니다.

검사를 실행하면 RT-PCR, 프라이머 / 프로브 집합에 대해 부정적인 제어 (NC) 반응 임계값 선을 넘지 형광 성장 곡선을 전시 안됩니다. 거짓 긍정은 프라이머 / 프로브 세트의 NC 반응 중 하나 이상이 발생하면, 샘플 오염이 발생했을 수 있으며, 이러한 모든 경우에, 전체 운영은 무효가되었고 지침에 엄격한 준수와 반복했다.

RT-PCR은 CDC에서 제공하는 GI과 GII 긍정적인 표준을 사용하여 테스트되었습니다 심사에 대한 반응을 보도록. 아무 교차 반응은 GII RNA와 그 반대로 GI primers와 프로브 사이에서 관찰되지 않았습니다. 심사 RT-PCR의 재현성은 CT-값을 높게 어디에 긍정적인 조절에서 RNA와 반복적인 실행을위한 비슷합니다. RNA 월에 대한 긍정적인 발견하고 20 이후 기존의 RT-PCR에 의해 증폭 및 genotyping을 위해 보낸 33 사이의 CT-값을 가지고 있었다 어린이 대변 샘플에서. 35와 38 사이의 CT-값을 가진 다섯 긍정적인 표본 sequen 위해 전송되지 않았습니다기존의 RT-PCR을 사용하여 이후의 증폭을 위해 너무 낮은 것으로 발견된 바이러스 부하로 cing.

방법은 오직 기본적인 장비로 현지 실험실에서 구현할 수없는 때문에 현재 노로 바이러스 진단의 이용이 제한됩니다. 개별적인 설사의 경우 또는 발병이 지연 진단 및 치료. 키트 메서드는 신뢰할 수 있고 빠르고 아직 국가에 자료를 수송하기위한 시간과 자원의 상당한 금액이 필요합니다. 비용은 우리의 방법의 세 배입니다. 우리는 똑같이 간단하고 신속하며 신뢰할 월의 탐지를 위해 쉽게 - 사용 가능한 지역에서 시약을 사용하여 보조 방법을 보여주었다. 이 비용 효율적인 방법은 자료에 대한 신뢰는 궁극적으로 해외 채널에 접근 진단과 하나의 빠른 치료 위장염의 가장 흔한 원인 바이러스로 이어질 것입니다 그 운송에 관한 국제 및 내부 - 국가 규제의 문제점을 구입 무시ildren.

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Disclosures

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgements

저자는 월위한 표준 및 제어 반응의 종류 선물 질병 통제 예방을위한 국립 Calicivirus 연구실 센터 (CDC)에 감사 드리고, 그리고 시약을 제공 존스 홉킨스에​​서 공중 보건 학부의 실험실 것이다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate Sigma-Adrich G9277
Tris HCL Sigma-Aldrich T5941
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Silica Sigma-Aldrich S5631
Triton X 100 VWR 14530
Diethylpyrocarbonate Sigma-Aldrich D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250) Qiagen 52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) Qiagen 204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) Qiagen 210212
Rnase Inhibitor 2000 units A. Biosystems N808-0119 2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes Ambion AM12450
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550-100

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References

  1. Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
  2. Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
  3. Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
  4. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
  5. Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
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  7. Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
  8. Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).

Comments

1 Comment

  1. thanks a lot

    Reply
    Posted by: mohamed h.
    May 4, 2015 - 5:20 PM

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