收养大鼠迟发型超敏反应的感应和监测

Biology

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Summary

迟发型超敏反应(DTH)是CCR7的效应记忆T(TEM)淋巴细胞介导的​​炎症反应。在这里,我们将演示如何激活抗原特异性的透射电镜细胞,诱导Lewis大鼠收养的DTH和监测的炎症反应。

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Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats. J. Vis. Exp. (8), e325, doi:10.3791/325 (2007).

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Abstract

迟发型超敏反应(DTH)是一个CCR7的效应记忆T淋巴细胞浸润针对其免疫系统已催芽的抗原注射部位介导的炎症反应。炎症反应的特点是由抗原挑战的部位的皮肤发红和肿胀。这是一个方便的模型,以确定在体内的免疫抑制剂的疗效。可诱发皮肤直接到户,抗原特异性T淋巴细胞过继转移或与抗原的主动免疫,并随后在给定面积的皮肤,诱发炎症反应的抗原皮内挑战。 DTH反应,可诱发各种抗原,如卵清蛋白,结核菌素,破伤风类毒素,或锁孔戚血蓝蛋白。这种反应也可以对自身抗原诱导,例如,髓鞘碱性蛋白(MBP)在大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎,多发性硬化症(1)动物模型的MBP诱导。在这里,我们将演示如何在Lewis大鼠诱发领养的DTH反应。我们将首先在体外刺激卵清蛋白特异性T细胞,注入这些天真大鼠腹腔激活细胞。允许细胞以平衡体内2天之后,我们将挑战同在一耳耳廓的卵清蛋白的老鼠,而另一只耳朵WIL收到生理盐水。炎症反应将是可见的3-72小时后,耳厚度测量的DTH严重性的迹象。

Protocol

1。卵清蛋白特异性T淋巴细胞的刺激

休眠卵清蛋白特异性T细胞受到刺激照射Lewis大鼠胸腺细胞(30戈瑞)作为抗原提呈细胞(APCs)刺激中等,(准备的DMEM + PEN /链球菌/ L的过剩+ NEAA +的RPMI维生素的存在与卵清蛋白+ 2ME +大鼠血清+卵清蛋白,终浓度指出的材料清单。)

大鼠血清的制备

  1. 我们从我们牺牲的大鼠胸腺捐助者的血清。
  2. 大鼠深深氟烷吸入麻醉和尽可能多的血液是由心脏灌注,用10毫升的注射器和23政1针,之后将大鼠立即断头,以确保死亡(每大鼠5-10毫升)绘制。
  3. 血是允许10分钟的血块在37 ° C冰10分钟。
  4. 血块被删除,剥离剩余的液体。
  5. 收集血清,无菌过滤和储存在-20 ° C。

抗原提呈细胞的制备

  1. 一个断头使用无菌文书大鼠胸腺和地方在用含青霉素和链霉素(PBS - PS),在冰上。
  2. 以胸腺一个组织文化罩,清除血块和其他污染组织,并进入细胞过滤器放置在一个10厘米的培养皿含有10 ML的菜(费舍尔#08-771-2),切小块的PBS PS。
  3. 通过细胞过滤器使用1毫升无菌注射器推杆背面的每一块按下。收集到50毫升管上冰的单细胞悬液。
  4. 20-40多毫升的PBS - PS冲洗细胞过滤器。离心机1250克悬挂和重新悬浮在PBS - PS颗粒,5毫升/胸腺,在冰上。
  5. 辐射这个悬挂在伽马辐照(30戈瑞),应立即用50毫升PBS - PS的两倍。

    注:最好的胸腺捐助者是年轻成年大鼠5-7周龄。至10周的大鼠可被使用,但细胞的数量随着时间的推移而降低。 性别并不重要,虽然有些人说,男性更好的胸腺捐助者。 我们总是用女性,因为我们所有的动物都在同一个房间内,我们不希望在同一房间内的男性和女性。

刺激

  1. 一次洗的T淋巴细胞和计数。
  2. 抗原提呈细胞计数。
  3. 混合3 × 10 6 150 × 10 6装甲运兵车在10厘米的培养皿刺激培养基中含有10毫升菜的卵清蛋白,特定的T细胞。
  4. 48小时在37 ° C。

2。卵清蛋白特异性T淋巴细胞过继转移

  1. 我们作为接受者的老鼠是7-10周的女性。
  2. T淋巴细胞计数,他们应该是大而圆。抗原提呈细胞将死亡。
  3. 离心机的T淋巴细胞,并在10 × 10 6细胞/毫升的PBS重悬。
  4. 注入1毫升腹腔注射3毫升的注射器和23政1“针。

3。在耳边具有抗原性的挑战

  1. 继转移后两天,一只耳朵和生理盐水在另一只耳朵(或不相关的抗原)注入20μL1 mg / ml的卵清蛋白溶液(=相关抗原)。不过滤的抗原的解决方案,您可能会失去增强炎症反应的聚合。

    注:大鼠麻醉,以避免动作。如果你是右撇子,保持您的左手拇指和食指,食指,耳内,面对你的鼠之间的耳朵。

  2. 注入使用27G半“针耳耳廓的解决方案。尝试注入完全在同一个地方所有的老鼠。

4。测量的DTH

  1. 耳朵将开始变成红和肿胀炎症的标志。衡量一个弹簧加载的千分尺(例如从三丰模型PK - 0505)每耳的厚度。
  2. 在每个时间点每个耳朵5-6测量和计算平均值。
  3. 最大的肿胀发生24小时和72小时之间。

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Discussion

抗原的挑战,也可以在其他网站,例如背部的皮肤(2)。不过,我们发现,具有挑战性的。在此视频中显示,使用耳的耳廓,允许DTH反应的最精确的测量。

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Acknowledgments

我们感谢为我们提供了GFP标记,卵清蛋白特定的T细胞在本议定书中使用的行博士亚历山大弗留葛尔(Martinsried,德国)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO, by Life Technologies 12430-062 500ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 1 mM final, in Stimulation medium
Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine Cambrex/BioWhittaker 17-718R 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium
Non essential amino acids Sigma-Aldrich R7131 NEAA, 1% final, in Stimulation Medium
RPMI vitamins Sigma-Aldrich R7256 1% final, in Stimulation medium
beta-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium
Syngeneic rat serum 1% final. See explanation in Protocol.
Ovalbumin Sigma-Aldrich A5503 10 μg/ml final, in Stimulation Medium.

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References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166-936 (2001).
  2. Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).

Comments

2 Comments

  1. Hi, Thank you very much for your protocols. Do you have any protocol describing the preperation of Ag specific T cell line (or Ag specific primary culture) from a rat?   Thank you very much in advance, Keren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 11, 2009 - 5:29 PM
  2. Hi Keren, Protocols for generating antigen-specific T cell lines from rats have been published. Basically, you need to immunize the rats with the antigen of interest in emulsion with an adjuvant (Alum, IFA, or CFA) and then collect the draining lymph nodes, isolate the mononuclear cells and stimulate them in vitro with the same antigen. Most cells will die but the antigen-specific cells will grow. Note that you will need to go through several rounds of stimulation in vitro to increase the % of antigen-specific T cells in your culture as some non-specific bystander cells will survive for some time. Here are a few references you may want to look at:     Flügel, A., M. Willem, T. Berkowicz, and H. Wekerle. 1999. Gene transfer into CD4 + T lymphocytes: Green fluorescent protein engineered, encephalitogenic T cells used to illuminate immune responses in the brain. Nature Med. 5:843–847. Ben-Nun, A., Wekerle, H., and I.R. Cohen. 1981. The rapid isolation of clonable antigen-specific T lymphocyte lines capable of mediating autoimmune encephalomyelitis. Eur. J. Immunol. 11:195-199. For immunization of rats you can look at two of my JoVE videos: Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH) in rats, J. Vis. Exp. 6, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²37&VID=²33. PMCID: PMC²557114. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Vis. Exp. 5, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²²4&VID=²14. PMCID: PMC²557091.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    March 17, 2009 - 7:18 PM

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