Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d'affinité bispécifiques petits

L’objectif global de l’expérience suivante est de produire des protéines recombinantes très pures par une procédure de purification d’affinité en deux étapes. Pour ce faire, une étiquette de purification bispécifique basée sur un domaine de liaison à l’albumine est clonée dans un vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt et est suivie de l’expression de la protéine de fusion dans e coli. Dans un second temps, le lysat bactérien contenant la protéine cible est soumis à une purification sur une colonne chromatographique avec de l’albumine sérique humaine immobilisée ou HSA.

Ceci est suivi d’une purification supplémentaire sur une résistance supérieure MAB select ou une colonne sûre contenant le domaine Z immobilisé dérivé de la protéine staphylococcique A. Il en résulte un produit très pur adapté aux applications exigeantes. Ensuite, la pureté est évaluée par la page SDS et si nécessaire, par spectrométrie de masse afin de s’assurer que la protéine d’intérêt a été purifiée avec succès jusqu’à l’homogénéité, les résultats montrent une purification efficace après deux étapes successives par rapport à une seule étape avec la nouvelle étiquette de purification bispécifique utilisée dans ce protocole. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la purification par affinité en une étape, est qu’il est possible d’obtenir une protéine pure par un protocole simple en utilisant une seule poignée d’affinité, quelles que soient les propriétés ou la protéine cible.

Cette méthode peut être utilisée pour des protéines aux caractéristiques très diverses. De plus, comme l’étiquette est très petite, elle est facilement produite par l’hôte bactérien. En général, les personnes novices dans cette procédure de purification la trouveront très simple et directe.

Une étape critique consiste à ajuster le pH de votre échantillon avant de le charger sur la deuxième colonne. Une petite étiquette de purification avec deux affinités inhérentes a été mise au point en incorporant un site de liaison supplémentaire dans un domaine de liaison à l’albumine existant dérivé de la protéine streptococcique G.Le domaine de liaison à l’albumine de 46 acides aminés se replie en un faisceau stable à trois hélices et contient un site de liaison pour l’albumine sérique humaine, principalement situé sur la deuxième hélice en randomisant génétiquement 11 acides aminés exposés à la surface situés dans la première et la troisième hélice. a conçu plusieurs cycles de panoramique biop contre un zoma diamétralement dérivé de la protéine staphylococcique A avec la banque combinatoire exprimée sur le phage, a abouti à une molécule bispécifique appelée A BDZ one avec une affinité pour HSA et le domaine Z. Pour préparer le plasmide d’expression de l’étiquette de fusion bispécifique, préparez les fragments PCR du gène A BDZ one flanqués de sites de restriction appropriés pour l’ation et en phase terminale du gène cible dans le clivage du plasmide d’expression, les fragments de PCR A BDZ one et le vecteur d’expression purifié contenant le gène d’intérêt Avec les enzymes de restriction choisies dans un tampon de réaction approprié, purifiez les produits avant la ligature.

Ensuite, ligaturez le fragment restreint A BDZ one dans le vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt et transformez le produit de ligature en e coli. Répartissez les cellules transformées sur des plaques agricoles, complétées par des antibiotiques appropriés pour la sélection. Le criblage PCR de quelques colonies et la séquence vérifient la cassette d’expression résultante par séquençage de l’ADN.

Enfin, préparez le plasmide à partir d’une culture nocturne d’une colonie dont la séquence a été vérifiée et transformé en souche d’expression préférée pour exprimer la protéine cible. Une fois la nouvelle étiquette fusionnée à sa fin, Termini inoculent d’abord une seule colonie bactérienne dans 10 millilitres de tryptyques, de bouillon de soja complété par cinq grammes par litre d’extrait de levure et les antibiotiques appropriés, incubent à 150 tr/min et 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, inoculer un millilitre de culture pendant la nuit dans 100 millilitres de culture fraîche et moyenne et induire l’expression des protéines.

Lorsque les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique. Après l’induction des protéines, incuber les cellules à 150 tr/min et 25 degrés Celsius pendant la nuit, récolter les cellules le lendemain par centrifugation La purification par affinité orthogonale de la protéine A BDZ one fusion est réalisée par purification initiale sur une colonne avec HSA immobilisé ou zoma. Une étape de purification successive est ensuite effectuée, en utilisant la deuxième affinité de l’étiquette bispécifique.

Les milieux chromatographiques avec le domaine Z immobilisé, tels que MA select sure, sont facilement disponibles pour la purification des anticorps. Alors que HSA peut être couplé chimiquement à un milieu pour fournir la deuxième matrice pour procéder à la purification par affinité orthogonale Resus, suspendre la pastille dans 25 millilitres de tampon courant. Ensuite, perturbez les cellules par sonication à 60 % d’amplitude et impulsions d’une seconde, suivies d’une pause d’une seconde pour un total de trois minutes.

Après la centrifugation de l’échantillon, filtrez la protéine cible contenant de la super natine à travers un filtre de 0,45 micron avant de poursuivre la purification. Ensuite, équilibrez une colonne de spheros HSA d’un millilitre ou une colonne activée par NHS couplée à HSA avec 10 volumes de colonne de tampon de fonctionnement à un millilitre par minute sur un système de purification de protéines approprié. Une fois équilibré, chargez le lysat bactérien à 0,5 millilitre par minute, réinitialisez le débit à un millilitre par minute et lavez la colonne avec cinq volumes de colonne de tampon de lavage, suivis de cinq volumes de colonne de tampon de lavage.

Éluer l’échantillon avec un tampon d’élution à raison d’un millilitre par minute et recueillir les fractions. Surveillez l’absorption à 280 nanomètres pour sélectionner des fractions du pic éludé. Pour une purification ultérieure, regroupez les fractions ayant la plus forte concentration en protéines, puis diluez deux fois.

Assurez-vous que le tampon fonctionne et assurez-vous que le pH est autour de neutre. Cette étape est essentielle pour la liaison des protéines au domaine Z. Ajouter une molaire tris HCL pH huit pour augmenter le pH si nécessaire.

Ensuite, chargez l’échantillon à 0,5 millilitre par minute sur une MA de piège d’un millilitre de haut, sélectionnez la colonne sure qui a été équilibrée avec sure. Une fois que le débit a été réinitialisé à un millilitre par minute, la colonne est lavée avec cinq volumes de colonne de tampon de fonctionnement sûr. Ensuite, éluez les protéines avec 0,2 molaire d’acide acétique pH 2,7 pour les protéines cibles sensibles.

L’EIT peut être neutralisé directement lors de la collecte par l’ajout de T tris. La page H-C-L-S-D-S peut être utilisée pour évaluer la pureté des protéines. Il est important de réduire complètement l’échantillon car un cycle libre dans un cycle BDZ peut provoquer une dimérisation du produit dans des conditions non réductrices.

Comme dernière étape, le poids moléculaire du produit purifié peut être analysé par spectrométrie de masse après purification par protocole orthogonal sur une colonne HSA, suivie d’une colonne MA select sure. Différents échantillons collectés à plusieurs points de purification ont été analysés par la page FDS. Les échantillons comprenaient l’étiquette A BDZ elle-même, ainsi que trois protéines cibles humaines différentes fusionnées à AB DZ one représentant différentes classes de solubilité, poids moléculaires et points isoélectriques.

Les voies un à quatre montrent les lysats de protéines avant purification pour les trois différentes protéines de fusion AB DZ one et l’étiquette AB DZ One elle-même. Les couloirs cinq à huit montrent les résultats de l’étape de purification HSA des protéines. Enfin, les voies neuf à 12 résultent de l’étape finale de sélection Purification certaine.

De plus, des échantillons acquis à partir des mêmes lysats purifiés dans l’ordre inverse sur les mêmes colonnes ont été analysés ici. Les voies un à trois montrent les lysats avant la purification, tandis que les voies quatre à six ont été empruntées après la première étape de purification sur la colonne MAB Select Sure. Les produits de haute pureté dans les couloirs sept à neuf résultent de la purification finale HSA.

Les résultats montrent clairement l’utilité d’un double tag et de deux étapes de purification très spécifiques. Même si une pureté raisonnable est obtenue après l’étape de purification initiale, comme le montrent les gels, l’étape successive donne un produit très pur bien adapté aux applications très exigeantes. Une fois maîtrisée, l’étape de purification centrale de cette méthode peut être réalisée en quelques heures par une seule personne pour obtenir une protéine recombinante très pure adaptée à de nombreuses applications différentes.

Par exemple, à la suite de cette procédure, les biomolécules purifiées peuvent être utilisées pour d’autres applications, telles que des études d’interaction, afin de répondre à des questions telles que la force de liaison d’un complexe. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon d’obtenir un véritable produit protéiné pur en utilisant cette étiquette à double affinité.