Rivelando Topografia Neural Circuit in Multi-Color

Neuroscience

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Summary

Forniamo una guida pratica per fornire traccianti

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Reeber, S. L., Gebre, S. A., Filatova, N., Sillitoe, R. V. Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color. J. Vis. Exp. (57), e3371, doi:10.3791/3371 (2011).

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Abstract

Circuiti neurali sono organizzate in funzionali mappe topografiche. Al fine di visualizzare complessa architettura del circuito, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per etichettare il modello globale di molteplici proiezioni topografiche. Il cervelletto è un modello ideale per studiare la disposizione ordinata dei circuiti neurali. Per esempio, l'organizzazione compartimentale dei spinocerebellare fibre muschio ha dimostrato di essere un sistema indispensabile per lo studio di patterning muschio fibra. Abbiamo recentemente dimostrato che il germe di grano agglutinina (WGA), coniugata con Alexa 555 e 488 può essere utilizzato per il tracciamento spinocerebellare proiezioni in fibra di muschio nello sviluppo e topi adulti (Reeber et al. 2011). Abbiamo trovato tre proprietà principali che rendono il WGA-Alexa strumenti traccianti auspicabile per l'etichettatura di proiezioni neurali. In primo luogo, fluorofori Alexa sono intensi e la loro luminosità permette l'imaging wholemount subito dopo traccia. In secondo luogo, WGA-Alexa traccianti etichetta l'intera traiettoria di sviluppo e di adulti neurali projections. In terzo luogo, WGA-Alexa rivelatori rapidamente trasportato sia in direzione retrograda e anterograda. Qui, descriviamo in dettaglio come preparare i traccianti e altri strumenti necessari, come eseguire l'intervento chirurgico per spinocerebellare tracciamento e il modo migliore per proiezioni di immagini tracciate in tre dimensioni. In sintesi, forniamo un passo-passo il protocollo di analisi che sarà utile per decifrare l'organizzazione e la connettività di mappe funzionali non solo nel cervelletto, ma anche nella corteccia, tronco encefalico e del midollo spinale.

Protocol

1. Fornire traccianti in vivo utilizzando chirurgia sterile (Sezioni 1,1-1,16)

Nel corso della procedura si consiglia di tecniche standard di sterili chirurgici essere utilizzato. Questo include l'utilizzo di guanti sterili, camice e mascherina. Strumenti devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso o puliti accuratamente con acqua e etanolo. Durante l'intervento, e soprattutto tra gli animali, frammenti di tessuto pulire gli strumenti e asciugare sterilizzare gli strumenti con un caldo tallone sterilizzatore (Steri 250 cat. # 18000-45, strumenti Scienza Fine). Inoltre, è fondamentale che a organizzare il vostro spazio di lavoro tale che si sono aree designate per la preparazione animale (da barba, ecc), la chirurgia, e una zona di recupero dove l'animale può essere facilmente monitorati, riscaldato e dotato di analgesici se necessario. La chiave per la sopravvivenza interventi chirurgici di successo è quello di ridurre il rischio di infezioni e mantenere un aggressivo post-operatorio strategia di cura. Si prega di fare riferimento alla tabella dove è possibile pinnad tutte le attrezzature necessarie e reagenti per questo protocollo.

  1. Anestetizzare topi adulti con preparati al momento Avertin (2,2,2-Tribromoethanol, Sigma, St. Louis, MO;. Cat # T48402) via intraperitoneale (ip) di iniezione con una dose del peso corporeo 0.2ml/10grams. Altri anestetici come isoflurano o ketamina / xylazina sono ugualmente efficaci, ma assicurarsi che il laboratorio ha richiesto l'approvazione istituzionali e federali prima dell'uso. Se si utilizza cuccioli (P0 - P10) è possibile anestetizzare su ghiaccio tritato per 10-15 minuti. Assicurarsi che la pelle di ogni cucciolo non è in contatto diretto con il ghiaccio (per esempio, mettendoli nelle dita dei guanti in lattice), come l'acqua fredda rapidamente indurre un livello letale di ipotermia. Verificare che l'animale è in una pianura accettabile di anestesia eseguendo un pizzico dito del piede con una pinza o dita per le zampe posteriori degli animali '. Se c'è un riflesso pedale, attendere che l'animale non risponde a questo stimolo come indicazione di una più profondapiana di anestesia.
  2. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato si trovava con il suo lato dorsale su un tampone di garza sterile con la testa rivolta verso te e la coda rivolta verso di voi. Accorciare il pelo con tosatrici per dare voi stessi un campo libero chirurgica che è abbastanza larga per accedere al sistema nervoso centrale. Pulire la regione rasata con due set di cotone imbevuto di alcol, poi 70% di alcol / Betadine, e poi pulire ancora una volta con cotone imbevuto di alcol. Utilizzare un dall'interno verso l'esterno modello circolare quando si pulisce l'area chirurgica. Si può scegliere di delimitare chiaramente il campo chirurgico, tagliando un piccolo foro in una garza sterile e ponendo l'apertura sul vostro sito rasato e pulito chirurgico. Pur mantenendo il campo sterile chirurgico può essere difficile quando si opera su piccoli animali, in questo modo si contribuirà a ridurre il rischio di infezione.
  3. Sollevare la pelle con pinze e fare un'incisione con le forbici direttamente sulla linea mediana sopra abbassare la toraco-lombare superiore regione. Abbassare la regione superiore del torace regione lombare può essere identificato eseguendo il dito lungo le vertebre per sentire una gobba della colonna vertebrale (Fig. 1).
  4. Tagliare la fascia superficiale dei muscoli e della colonna vertebrale. Se necessario, interrompere ogni sanguinamento da cauterizzare i vasi sanguigni (Strumenti Scienza Fine, Foster City, CA;. Cat # 18000-00). Nei cuccioli, applicando una leggera pressione intorno alla incisione con tamponi di cotone è sufficiente per fermare le emorragie.
  5. Eseguire una laminectomia dorsale, eliminando i processi spinosi di uno o due segmenti del toracica inferiore - superiore del midollo spinale lombare dopo il taglio della lamina su entrambi i lati della colonna vertebrale, a metà strada fra il processo articolare e il processo spinoso dorsale (Fig. 2) . Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale con le forbici e togliere sempre l'piccoli frammenti ossei che potevano lacerare il midollo spinale. Si noti che la colonna vertebrale nei primi mesi dopo la nascita i cuccioli non è completamente ossificata, il che significa che le ossa sono moltomorbida e può essere tagliato facilmente. Pertanto, fare attenzione a non tagliare troppo in profondità per evitare di danneggiare il midollo spinale.
  6. Se si preferisce non eseguire una laminectomia dorsale in topi adulti, abbiamo scoperto che è possibile tagliare i tessuti molli tra i segmenti vertebrali per esporre una piccola regione del midollo spinale senza tagliare alcun osso. Sebbene entrambi i metodi sono efficaci percorsi di ingresso nel midollo spinale, evitando una laminectomia dorsale può garantire che il midollo spinale rimane intatto.
  7. Riempire un elettrodo di vetro tirato (vetro borosilicato capillari; Cat # 300056, Harvard Apparatus, Holliston, MA;. Doppio stadio di vetro Micropipetta Puller da Narishige Modello 001-PC-10) con il tracciante utilizzando una siringa micrometro (0,2 ml; Gilmont Instruments Cat . # GS-1100) o di un apparato di consegna equivalente.
  8. Serrare le microelettrodo vetro in posizione su un micromanipolatore e inserire l'elettrodo 0,1-0.5mm in basso toraco-lombare superiore del midollo spinale a metà strada tra la metàlinea e il bordo laterale del midollo spinale. L'animale può essere tenuto in un apparato stereotassico per l'identificazione accurata di loci di iniezione e per stabilizzare l'animale (Small Animal Modello Strumento Stereotassica 940-A e manipolatore del modello 960 da elettrodi Strumentazione Kopf). In alternativa, se il regime anestetico può essere adattata per ottenere un aereo costante senza variazioni significative a causa di respirazione profonda, delicatamente taping dell'animale sarà sufficiente.
  9. Pressione iniettare nel midollo spinale oltre 3-5 minuti circa 0.5μl di una soluzione al 2% del WGA-Alexa 488 (germe di grano agglutinina, Alexa Fluor 488 coniugato;. Cat # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA), Alexa WGA-555 (germe di grano agglutinina, Alexa Fluor 555 coniugato;. Cat # W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), Alexa WGA-350 (germe di grano agglutinina, Alexa Fluor 350 coniugato;. Cat # W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA- HRP (germe di grano agglutinina perossidasi del rafano, Sigma, St. Louis, MO Cat # L7017) o 0.5μl del 10%BDA (biotinilato destrano ammine;. Cat # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) in tampone fosfato salino (PBS, Sigma, St. Louis, MO; Cat # P4417). Iniettando questi volumi dei risultati traccianti nell'etichettatura un gran numero di fibre. Volumi più piccoli dovranno essere iniettata per il targeting nuclei più piccoli (o sub-regioni di nuclei individuali) e ciascun ricercatore deve empiricamente determinare il volume ideale da consegnare. Ionoforesi dovrebbe essere considerata per la consegna nanoliter accurato per preparazioni iniettabili precisa. Noi di solito integrare tutte le soluzioni tracciante con Fast Green 0,5% (Sigma, St. Louis, MO; Cat # F7252) per visualizzare il luogo di iniezione durante l'intervento chirurgico.
  10. Noi aggiungiamo 1ml di olio di mais (Sigma, St. Louis, MO; Cat # C8267) ad ogni 10μl di soluzione BDA prima di iniettare per evitare che il composto si attacchi alle pareti delle pipette tirato. Se avete difficoltà a espellere il tracciante dalla pipetta, lentamente rientrare la punta per creare una piccola tasca in tessuto quindi provare l'iniezione di nuovo.Non è insolito per la punta microelettrodo a intasare. Nella maggior parte dei casi il tascabile aiuta anche a creare un serbatoio da cui i neuroni circostanti in grado di assorbire il tracciante. Ricordate sempre di espellere il tracciante lentamente per evitare danni enormi tessuto in prossimità del vostro ago.
  11. Chiudere delicatamente la pelle con clip ferita e colla tessuti. In alternativa, è possibile utilizzare punti di sutura per chiudere la ferita.
  12. Si noti che con la pratica l'intervento chirurgico, almeno fino a questo punto, può essere completato in meno di 20 minuti.
  13. Posto l'animale in una camera di recupero (Vetcare modello da camera 9.16.0 cat. # 340508 Apparecchi da Harvard) su una piastra elettrica (Pad Cat riscaldamento. # 341241 Apparecchi da Harvard) per evitare ipotermia e accelerare la ripresa. In alternativa, è possibile utilizzare una delle molte marche e modelli di camere di riscaldamento. Monitorare il tasso di respirazione e verificare la presenza di segni che l'animale sta tentando di spostare. Maggior parte degli animali sono di solito sensibili entro 10-15 minuti dopo la chirurgia.
  14. WGA-Alexa 555, Alexa WGA-488, e WGA-HRP sono rapidamente trasportati in neuroni e abbiamo trovato che in entrambi i primi topi postnatale e adulta la Alexa coniugato traccianti robusta tratti di fibre lunghe etichetta entro 24 ore (Reeber et al. 2011) . Alexa WGA-350 è anche rapidamente trasportato anche se, rispetto ai coloranti altri Alexa la sua visibilità dipende in larga misura la qualità e la sensibilità del set di filtri (dati non riportati;. Reeber et al 2011) BDA genere richiede tempi di sopravvivenza più lunga di tracciare completamente le proiezioni neurali e dunque per la mappatura completa di proiezioni spinocerebellare animali dovranno essere sacrificati dopo circa 11 giorni.

2. Rilevamento di anterogradely tracciato fibre muschio

  1. Dopo i periodi di sopravvivenza rispettivi anestetizzare i topi con Avertin (o il vostro preferito anestetico).
  2. Una volta non ci sono riflessi il sangue deve essere lavata con il cuore da perfusione con 0,1 M PBS (pH7.2). Quindi, fissare il tessuto mediante perfusione l'animale con il 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. Oltre alle regioni che analizzerà, è sempre necessario acquisire il tessuto dal sito di iniezione per l'analisi retrospettiva di quanto grande fosse l'iniezione, l'indicazione della estensione del danno tissutale causato da l'elettrodo, e per identificare l'eventuale etichettatura, in fibre di passaggio (Fig. 3, vedi Mesulam, 1982;. Reeber et al 2011).
  3. Postfix il brains dai topi perfusi per 24-48 ore in 4% PFA e poi li cryoprotect in soluzioni di saccarosio tamponato diluito in PBS (15% per circa 2 ore o fino a quando il affonda tessuto sul fondo del contenitore e poi il 30% durante la notte o fino a quando il tessuto lavandini). Il tessuto viene poi rimosso dal saccarosio, tamponò asciugare delicatamente con carta assorbente e poi immerso in uno stampo contenente tessuto ottobre (temperatura ottimale di taglio; Sakura Finetech USA Inc, CA). Il tessuto viene poi congelato utilizzando un congelatore ° -80 C e conservato alla stessa temperatura fino alla sua pronta per essere tagliata.
  4. I fluorofori Alexa sono visibili direttamente dopo l'etichettatura e non necessitano di colorazione aggiuntiva. Pertanto, dopo la perfusione WGA-Alexa tessuto tracciato può essere tagliato e montato per l'imaging o direttamente ripreso nel 4% PFA come preparazione wholemount. Abbiamo scoperto che il tessuto di imaging nel 4% PFA ha dato il miglior indice di rifrazione per l'imaging della topografia di proiezioni tracciate in wholemounts. Per le sezioni, tagliare seriale Coron 40μm di spessoresezioni al criostato e su un loro raccogliere il free-floating sezioni in PBS. Data la tossicità del PFA, garantire che un'adeguata maschera è indossata durante la perfusione e di imaging, tenere la zona ben ventilata, e quando non in uso immediatamente restituire il PFA o PFA-fisse del tessuto di contenitori sigillati. E 'l'ideale se il vostro microscopio è situato in una cappa aspirante adatto.
  5. Fibre WGA-HRP marcata può essere rivelato con tetrametilbenzidina (TMB) come cromogeno. Non descrivere il protocollo di colorazione HRP qui dal momento che è già stato descritto in dettaglio (Vogel e Prittie 1994;. Sillitoe et al 2010)
  6. Per BDA fibre etichettati incubare libero di fluttuare sezioni di tessuto per 2 ore in Streptavidina-CY3 (Cat. # 434315, Invitrogen, Carlsbad, CA) o streptavidina-Alexa Fluor 488 o 555 (Cat. # S11223 per 488 e cat. # S21381 per 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), lavate in PBS e poi montare con fluoro-GEL. Per DAB, sezioni di tessuto incubare una notte in tampone di reazione ABC (Cat. # PK-4000, Vettore Laboratories, Inc. Burlingame, CA), lavare 3 volte in PBS e poi reagire per 5-10 minuti in DAB (0.5mg/ml, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) integrata con 10μl del 30% di H 2 O 2 per ogni soluzione 50ml DAB.

3. Immunoistochimica

  1. Immunoistochimica è stata effettuata come descritto in precedenza (Sillitoe et al. 2008). In breve, incubare sezioni di tessuto a 0,1 M PBS contenente 10% di NGS (NGS, Sigma, St. Louis, MO), 0.1% Tween-20 e gli anticorpi primari (vedi sotto) per 16-18 ore a temperatura ambiente. Lavare le sezioni di tessuto per tre volte in PBS e poi incubare anticorpi secondari (vedi sotto) per un massimo di 2 ore a temperatura ambiente. Lavare il tessuto nuovo e rivelano l'immunoreattività come descritto di seguito.
  2. Per determinare la relazione tra cellule di Purkinje e le fibre muschio abbiamo co-etichettati senza sezioni di tessuto mobile usando i metodi convenzionali di colorazione doppia. Abbiamo usato WGA-555 Alexaper il tracciamento e Alexa 488 coniugato asino anti-topo anticorpi secondari (Invitrogen / Molecular Probes Inc., Carlsbad, CA) per rilevare ZebrinII (1:250; gentile dono dal Dott. Richard Hawkes, Università di Calgary, Calgary, Canada). ZebrinII è un anticorpo monoclonale di topo ed è stato utilizzato direttamente dal medium ibridoma speso cultura. Il fluoroforo anticorpi coniugati secondari sono stati utilizzati alla diluizione di 1:1500. Dopo la colorazione le sezioni di tessuto sono stati montati su vetrini carico, quindi coperti con fluoro-GEL in tampone Tris (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) o con Vectashield hardset montaggio di medie dimensioni con DAPI (Cat. # H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) per l'imaging tripla fluorescenza di colore.
  3. Abbiamo testato la specificità degli anticorpi secondari elaborando le sezioni di tessuto in assenza di anticorpi primari. Nessun segnale è stato rilevato negli esperimenti di controllo, indicando che la colorazione che abbiamo osservato non era dovuta ai segnali non specifici da the Alexa anticorpi coniugati (dati non riportati).

4. Microscopia e analisi dei dati

  1. Catturiamo microfotografie delle sezioni di tessuto con Leica DFC360 FX (fluorescenza) e DFC490 (DAB e TMB reagito sezioni di tessuto) telecamere montate su un microscopio Leica DM5500.
  2. Noi acquisire e analizzare le immagini delle sezioni di tessuto con Leica Application Suite e Leica Application Suite pacchetti software FX.
  3. Microfotografie di wholemounts vengono catturati utilizzando una macchina fotografica Leica DFC3000 FX montata su uno stereomicroscopio Leica MZ16 FA esecuzione Leica Application Suite di software FX.
  4. Entrambi i nostri microscopi sono dotati di Leica CY3 (modello # 11600231) e CIC (modello # 11513880) filtri e il DM5500 con una A4 aggiuntivo DAPI / filtro UV (modello # 11504162).
  5. Immagini vengono acquisite dopo l'ottimizzazione per i sotto / sovra-esposizione, come determinato con il software Leica. Importiamo tutti i dati grezzi in Adobe Photoshop CS4 e, se necessario, we corretto l'intero campo di ciascuna immagine per nitidezza, luminosità, contrasto o livelli solo. Altri software di fotoritocco può essere utilizzato come preferito.
  6. Gli schemi qui presentati sono stati elaborati in Adobe Illustrator CS4.
  7. Alexa 555 e CY3 neuroni colorati, che vengono rilevati in rosso con i nostri filtri, erano pseudo-color magenta nelle immagini presentate in tutto il manoscritto.

Animali

Tutti gli studi animali sono state effettuate nell'ambito di un protocollo approvato animale IACUC secondo le linee guida istituzionali dell'Albert Einstein College of Medicine. Maschio e femmina outbred svizzera Webster (Taconic, Albany, NY) o inbred C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME), i topi sono stati mantenuti nella nostra colonia e utilizzato per tutti gli studi. Mezzogiorno del giorno è stato rilevato un tappo vaginale era considerato giorno embrionale 0,5.

5. Rappresentante dei risultati:

Afferenze spinocerebellare interrompere in parasagibande ttal nel cervelletto (Fig. 3; Voogd et al 1969;. Grishkat e Eisenman 1995; Vogel e Prittie 1994; Vig et al 2005;. Apps e Hawkes 2009; Sillitoe et al 2010;.. Reeber et al 2011). Abbiamo iniettato WGA-Alexa traccianti in basso toraco-lombare superiore del midollo spinale per dimostrare: 1) che tali rivelatori può essere utilizzato per etichettare in modo coerente specifici sottoinsiemi di terminali nel cervelletto (Fig. 3; Reeber et al 2011), 2). che WGA-Alexa traccianti sono intensamente luminosi e possono essere usati per visualizzare lo schema generale di topografia in fibra di muschio cervello dei intera (Fig. 3;. Reeber et al 2011), 3) che WGA-Alexa 488 e 555 può essere utilizzato in combinazione per tracciare tratti più nello stesso animale (Fig. 4), e 4) che WGA-Alexa traccianti sono compatibili con colorazione immunoistochimica (Fig. 5). Nel recente lavoro abbiamo dimostrato che WGA-Alexa terminali etichetta traccianti nel cervelletto già 6 ore dopo la consegna del tracciante nel midollo spinale e sono una scelta eccellente per il tracciamento degli Architetturae di percorsi di sviluppo (Reeber et al., 2011).

Figura 1
Figura 1. Installazione di apparecchiature per la distribuzione di traccianti in vivo. A. Un 'immagine della nostra area chirurgica. B. Il basso-superiore del torace regione lombare può essere identificato eseguendo le dita lungo le vertebre per sentire una gobba della colonna vertebrale. La laminectomia dorsale deve essere effettuata o meno a metà della "gobba", che è indicata dalla freccia gialla.

Figura 2
Figura 2 Illustrazione di un toracica inferiore -... Superiore del segmento vertebrale lombare prima e dopo laminectomia dorsale A. schematica di un segmento vertebrale intatto dal basso-toraco-lombare superiore della colonna vertebrale del mouse B. Un Dorsalaminectomia l viene eseguita rimuovendo i processi spinosi di uno o due segmenti vertebrali, dopo aver tagliato la lamina a metà strada tra il processo articolare e il processo spinoso dorsale.

Figura 3
Figura 3. WGA-Alexa traccianti sono intensamente luminosi e possono essere utilizzati per visualizzare topografia afferenti proiezione ad alta risoluzione. A. Lo schema illustra l'origine e la terminazione di WGA-Alexa 555 neuroni marcati spinocerebellare. B. Immagine di un sito di iniezione dopo la consegna WGA-Alexa 555 nella regione toracica inferiore superiore lombare del midollo spinale adulto. Dell'immagine C. Wholemount del lobuli anteriori a seguito di una iniezione di WGA-555 Alexa in abbassare la toraco-lombare superiore del midollo spinale. D. WGA-Alexa 555 anterograda tracciamento del tratto spinocerebellare rivela fasce di fibre di muschio, come visto su un cotessuto sezione Ronal. I lobuli sono definiti da numeri romani e l'etichetta del numero di fasce in fibra di muschio su entrambi i lati della linea mediana (si applica a tutte le immagini). Barre di scala: B, C 500 micron, 500 micron D, 200 micron.

Figura 4
Figura 4. WGA-Alexa rivelatori efficiente per l'etichettatura più percorsi neurali nello stesso animale. A. schematica Wholemount del cervelletto del mouse che riassume lo schema generale di spinocerebellare fasce in fibra di muschio. Alexa WGA-555 è stato iniettato nella parte destra del midollo spinale lombare e WGA-Alexa 488 nel segmento stesso, sul lato sinistro. B. Come si è visto in una sezione di tessuto coronale tagliare i lobuli posteriore, entrambi WGA-Alexa traccianti sono stati trasportati al cervelletto e con successo etichettati sottoinsiemi distinti di terminali (vedi anche Reeber et al. 2011). Abbreviazioni: talpalare strato (ml); strato di cellule di Purkinje (PCL); strato di cellule dei granuli (GCL); materia bianca (WM). Bar Scala: B, 100 micron.

Figura 5
Figura 5. WGA-Alexa traccianti può essere utilizzato in combinazione con immunoistochimica e istologia per l'etichettatura tripla di neuroni e proiezioni. A. WGA Alexa-555 è depositato in terminali in fibra di muschio nel lobulo III. B. colorazione ZebrinII rivela una serie di strisce delle cellule di Purkinje nel lobulo III. C. colorazione DAPI dei nuclei neuronali e gliali. D. uniti immagine di pannelli A, B , e C che mostra l'etichettatura tripla di bande afferenti, strisce delle cellule di Purkinje, e citoarchitettura generale. EH. Immagini ad alto ingrandimento delle regioni in scatola mostrata in AD pannelli. Righe delle cellule di Purkinje sono numerati come descritto in precedenza (recensionein (Apps e Hawkes 2009)). Abbreviazioni: strato molecolare (ml); strato di cellule di Purkinje (PCL); strato di cellule dei granuli (GCL). Barre di scala: D, 500 micron (per CA), H, 500 micron (per EG).

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Discussion

Abbiamo descritto i dettagli chirurgiche e tecniche necessarie per il successo tracciamento degli assoni e dendriti utilizzando un nuovo approccio basato fluorescente per rapidamente l'etichettatura proiezioni neurali nello sviluppo e topi adulti. Utilizzando WGA-Alexa si mostra come traccianti e marcatori possono essere usati per analizzare la topografia del circuito modellata ad alta risoluzione e in tre dimensioni.

Traccianti molti sono disponibili per il tracciamento circuiti neuronali tra cui subunità B della tossina del colera, biocitina, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (phal), fluororuby, fluoremerald e fluorogold. Inoltre, recenti traccianti genetiche e virali a base hanno dimostrato che i sottoinsiemi di neuroni molecolarmente distinti topograficamente sono collegati ai loro bersagli con grande precisione. Si noti che, sebbene alcuni traccianti neuronali sono prevalentemente trasportati in entrambe le direzione anterograda o retrograda (ad esempio BDA 10.000 MW rispetto al 3000 MW), le molecole traccianti sono spesso trasportati in entrambe lele direzioni. Nei nostri studi, abbiamo introdotto WGA-Alexa traccianti a base affidabili strumenti neuroanatomici per l'analisi dei modelli di proiezione topografica. Abbiamo dimostrato che WGA-Alexa fluorescente vivaci, viene trasportato rapidamente, ed è abbastanza versatile da essere accoppiato con i marcatori immunoistochimici inclusi quelli per cerebellare comparti sagittale (Fig. 3).

Abbiamo trovato diversi limiti di utilizzo WGA-Alexa in confronto ad altri traccianti neuroanatomici disponibili. A differenza di BDA (Wu et al. 1999), abbiamo precedentemente dimostrato che WGA-Alexa (e WGA-HRP) non rivela la morfologia dell'intero complesso di terminazioni terminale (Reeber et al. 2011). Tuttavia, abbiamo migliorato il valore delle informazioni anatomiche acquisite dai terminali tracciate con l'associazione WGA-Alexa tracciando con colorazione immunoistochimica per trasportatore del glutammato vescicolare 2 (VGLUT2) e cocaina e anfetamine peptide trascrizione regolamentati (CART) immunoistochimica (Reeber et al 2011;. Reeber e Sillitoe, 2011). Unaltro difetto di WGA-Alexa è che il segnale si degrada in tempi relativamente brevi su sezioni di tessuto, pur essendo montato in mezzi di comunicazione che proteggono il segnale fluorescente. Pertanto, di solito l'immagine del tessuto immediatamente dopo il taglio, anche se l'imaging entro 2 giorni di taglio consente ancora fibre etichettati e terminali di essere ripreso con successo. C'è una tendenza per il WGA-Alexa segnale a perdere intensità durante immunocolorazione delle sezioni di tessuto. Utilizzando un minor numero di lavaggi e più brevi durante la colorazione può minimizzare questo problema. Un'altra raccomandazione è quella di montare sempre e immagine una delle serie di sezioni di tessuto tracciate il giorno del taglio per un riferimento impostato per il confronto con sezioni adiacenti che verranno trattati per immunoistochimica. Nelle nostre mani ottobre (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) incorporati blocchi di tessuto conservati a -80 ° C dopo perfusione e crioprotezione possono essere conservati per lunghi periodi di tempo senza alcuna perdita di intensità tracciante.

Il nostro approach di fibre tracciamento potrebbe essere facilmente adattato per tracciare mappe neurali nei percorsi corticali, tronco cerebrale e spinale. Attualmente stiamo esplorando la possibilità di utilizzare WGA-Alexa traccianti per l'imaging in vivo di formazione circuito negli animali geneticamente modificati e per lo studio della dinamica della formazione del circuito dopo le lesioni del tratto selettivo e la manipolazione farmacologica. Poiché il trasporto rapido di WGA-Alexa traccianti consente di breve durata analisi il nostro approccio ha il potenziale per rivelare i cambiamenti dinamici che si verificano durante plasticità strutturale dei circuiti topografiche.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da investigatore nuove start-up fondi da Albert Einstein College of Medicine della Yeshiva University di RVS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead sterilizer Fine Science Tools Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Cauterizer Fine Science Tools Cat. # 18000-00
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus Cat. # 300056
Dual stage Glass Micropipette Puller Narishige International Model 001-PC-10
Micrometer syringe Gilmont Instruments Cat. # GS-1100
Small Animal Stereotaxic Instrument Kopf Instruments Model 940-A
Electrode Manipulator Kopf Instruments Model 960
Vetcare chamber Harvard Apparatus Cat. # 340508
Heating Pad Harvard Apparatus Cat. # 341241
Leica DFC360 FX camera Leica Microsystems DFC360 FX
Leica DFC490 camera Leica Microsystems DFC490
Leica DM5500 microscope Leica Microsystems DM5500
Leica DFC3000 FX camera Leica Microsystems DFC3000 FX
Leica MZ16 FA microscope Leica Microsystems MZ16 FA
CY3 Filter Leica Microsystems Model # 11600231
FITC Filter Leica Microsystems Model # 11513880
A4 DAPI/UV filter Leica Microsystems Model # 11504162
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Cat. #W11261
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen Cat. #W32464

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  2. Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
  3. Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. Wiley. New York. (1982).
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