Vorbereitung von Intact Bovine Rute Bandscheiben für Orgel Kultur

Bioengineering

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Summary

Dieses Protokoll stellt eine Erntetechnik für coccygeal Rinder Bandscheiben für Orgel Kultur

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Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490, doi:10.3791/3490 (2012).

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Abstract

Die Bandscheibe (IVD) ist das Gelenk der Wirbelsäule verbinden Wirbel zu Wirbel. Es funktioniert nach Belastung der Wirbelsäule übertragen und bieten die Flexibilität, um die Wirbelsäule. Es komponiert aus drei Abteilungen: der innerste Kern pulposus (NP) umfasst von der Faserring (AF), und zwei knorpeligen Endplatten Anschluss der NP und AF auf die Wirbelkörper auf beiden Seiten. Bandscheibenbedingte Schmerzen möglicherweise durch degenerative Bandscheibenleiden (DDD) und Bandscheibenvorfälle verursacht hat, als ein großes Problem in unserer modernen Gesellschaft identifiziert worden. Zur Untersuchung möglicher Mechanismen der IVD-Degeneration, sind in vitro Orgelkultur Systeme mit Live-CD-Zellen sehr ansprechend. Die in vitro-Kultur von intakten Rinder coccygeal IVD hat einen entsprechenden Modell, das die Untersuchung der mechanisch-biologischen Aspekten in einer gut kontrollierten physiologischen und mechanischen Umgebung ermöglicht fortgeschritten. Bovine Schwanz IVD erhalten relativ leicht in höhere Zahlen Seien Sie eind sind sehr ähnlich wie das menschliche Lendenwirbelsäule IVD in Bezug auf die Zelldichte, Zell-Population und Dimensionen. Allerdings gelang früheren Rinder caudal IVD Erntetechniken Beibehaltung knorpeligen und knöchernen Endplatten Endplatten nach 1-2 Tagen der Kultur, da die Ernährung Wege waren offensichtlich durch geronnenes Blut blockiert. IVD sind die größten avaskuläre Organe, so sind die Nährstoffe zu den Zellen in der NP allein abhängig von der Diffusion über die Kapillare Knospen aus der benachbarten Wirbelkörper. Präsenz von Knochen Schutt und geronnenes Blut auf der Endplatte Oberflächen können Nährstoffdiffusion in die Mitte der Scheibe und des Kompromisses die Lebensfähigkeit der Zellen zu verhindern. Unsere Gruppe wurde eine relativ schnelle Protokoll-out "knacken" des IVD vom Schwanz mit einem geringen Risiko für Verunreinigungen. Wir sind in der Lage, den frisch geschnittenen knöchernen Endplatte Oberflächen mit Hilfe eines chirurgischen Jet-Lavage System, das die Bildung von Blutgerinnseln und Schneidabfall entfernt und sehr effizient öffnet die Ernährung Diffusionsweg permeabilisierenum die Mitte des IVD. Die Anwesenheit des Wachstums Platten auf beiden Seiten der Wirbelknochen muss vermieden werden und vor der Kultur entfernt werden. In diesem Video stellen wir die entscheidenden Schritte bei der Vorbereitung und Demonstration der Schlüssel zu einer erfolgreichen Orgelkultur Beibehaltung der hohen Lebensfähigkeit der Zellen für 14 Tage unter freiem Schwellungen Kultur. Die Kultur der Zeit könnte erweitert werden, wenn geeignete mechanische Umwelt durch mechanische Belastung Bioreaktor aufrechterhalten werden kann. Das kann die Methode auf andere Tierarten wie Schweine, Schafe und leporine caudal-und Lendenwirbelsäule IVD Isolation erweitert werden.

Protocol

1. Bandscheiben-Harvesting

  1. Ganze Länge Rinder Schwanz ist von einem örtlichen Schlachthof erhalten, wenn möglich, ohne Haut, da die Anwesenheit der Haut erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination (Abb. 2).
  2. Bereiten Sie große Schneidebrett und bereiten sterile Arbeitsplatz und Instrumente auf einem Schneidebrett (Abb. 2).
  3. Bereiten Sie unter der sterilen Laminarströmungshaube steriler Gaze angefeuchtet mit 0,9% Natriumchlorid enthalten, 55mm Natriumcitrat und in jedes Well der 6-Well-Platte.
  4. Bereiten Sie eine Schüssel und verdünnt 1:100 Betadine Lösung mit Leitungswasser.
  5. Tauchen Sie den gesamten Rinder-tail in einem Becken mit 1% Betadine Lösung für 5 min.
  6. Kurz trocknen Schwanz mit steriler Gaze und legen Sie sie auf sterile Arbeitsplatz.
  7. Entfernen Sie vorsichtig Muskeln rund um den Schwanz mit Skalpell Nr. 22.
  8. Hacken weg die Teile des Schwanzes, die nicht benötigt werden, in der Regel an beiden Enden des Schwanzes, die relativ große und sehr kleine enthaltenIVD (Abb. 3).
  9. Trim weiter die Muskeln und Sehnen auf der ganzen IVD mit Skalpell Nr. 10. Vorsicht nicht auf die äußeren Ring der Scheiben schneiden.
  10. Mark der vorderen des IVD mit einem chirurgischen Hautmarker (dieser Schritt ist optional, hilft es, das Zentrum für axiale Rotation in unsere Bioreaktor zu bestimmen).
  11. Suchen Sie den IVD und Wirbel Anschlusspunkt, indem Sie den Schwanz sanft. Spüren Sie die Grenze zwischen IVD und Knochen mit der stumpfen Seite eines Skalpell. Die Spaltung Website sollte 1-2 mm entfernt von der IVD in Richtung des Wirbels werden. Legen Sie maßgeschneiderte industrielle Messerhalter auf die Spaltung Website (Abb. 4).
  12. Cleave IVD und Wirbel durch Hämmern auf der Oberseite des maßgeschneiderten industriellen Messerhalter (Abb. 3).
  13. Wiederholen Sie auf der anderen Seite des IVD-Wirbel-Verbindung.
  14. Wrap isoliert IVD mit steriler Gaze angefeuchtet mit 0,9% Natriumchlorid enthalten, 55mm Natriumcitrat.
  15. Fahren Sie mit der Isolierung von IVD, um die gewünschte Sample-Nummer (in der Regel rund 6 könnengeerntet werden mit einem Durchmesser zwischen 10-20 mm).
  16. Schließen Sie das Jet-Lavage System (Zimmer, inkl..) Mit steriler Ringer-Laktat-Lösung werden 5L Beutel eine nützliche Größe (alternativ sterile PBS oder 0,9% iger Kochsalzlösung).
  17. Halten Sie die IVD mit einer Pinzette und Jet-Lavage beiden Seiten der Endplatte Oberfläche mit Zimmer Pulsavac Jet-Lavage System (Abb. 1C). Die Jet-Pistole sollte auf der Endplatte Oberfläche in einem Winkel zwischen 30 Schuss - 60 ° für ca. 30s auf jeder Seite. (Abb. 1 und 7)
  18. Setzen Sie den IVD zurück zu den 6-Well-Platte und wickeln mit angefeuchteten Mull, während Jet Waschen eine andere Disc Probe.
  19. IVD sind bereit für Orgel Kultur und down-stream-Applikationen (zB die Lebensfähigkeit der Zellen, mechanische Belastung, Orgelkultur) (Abb. 1D).

2. Repräsentative Ergebnisse

Outcome-Messungen zu einer erfolgreichen Bandscheiben-Vorbereitung Richter kann eine Diffusion Experiment sein, wo ein kleines Molekulargewicht Fluoreszenzfarbstoff (zB Procion Red)bereit ist, als eine 1% ige Lösung in PBS 2. Der IVD ist dann mit mindestens 100 ml Farbstofflösung und der Farbstoff wird dann erlaubt, passiv diffundieren in die IVD für 24 Stunden unter freiem Schwellung gehalten. Der IVD ist dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und brachte wieder auf Raumtemperatur und dehydrierte durch eine Reihe von Aceton Transfers (first in -80 ° C, dann -20 ° C, dann 4 ° C und schließlich auf Raumtemperatur vorgekühlt ). Die Disc kann dann in Poly-Methyl-Acrylat (PMMA) eingebettet und mit einem scharfen Messer bis 100 Mikrometer dicke Schnitte erzeugen. Diese Abschnitte können dann von jedem Standard-Hellfeld-Mikroskop, sondern vorzugsweise durch Verwendung von Fluoreszenz-Mikroskopie seit Procion Red emittiert eine rote Fluoreszenz (Abb. 5-6) eingesehen werden. Die trabeculi der knöchernen Oberfläche erscheinen sehr sauber nach dem jet lavaging Schritt (Abb. 7).

Parameter für eine erfolgreiche Orgelkultur sind in erster Linie das Fehlen von Verschmutzungen, erhalten die Lebensfähigkeit der Zellen (Abb. 8-9), Disc-Höhe undGesamt-Wertung "Disc Integrität", mit histologischen Schnitten und Safranin O / schnell grün färben oder Meyers Hämatoxilin 3 gemessen. Wir entwickelten Protokolle und Makros an anderer Stelle veröffentlicht 4,5 zu leben Bandscheibengewebe färben und die Lebensfähigkeit der Zellen in 3D mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop und dem Live / Dead Färbekit (Molecular Probes, Invitrogen, Basel, Schweiz) zu scannen. Wir weiterentwickelt einem Makro und Routine, um automatisierte Zellzählung, um die Lebensfähigkeit der Zellen in 3D-Gewebe-oder 3D-Träger mit dem NIH ImageJ-Plattform 6.4 Schätzung durchzuführen. Alternate-Protokolle wurden vorgeschlagen, um die Lebensfähigkeit der Zellen des Disc-Zellen durch anfängliche Verdauung mit sequentiellen Verdau der extrazellulären Matrix mit Pronase und Kollagenase Typ zu bestimmen 2 und dann auf die Zelle Aufhängung 7 Fleck. Eine frühere Version des Protokolls beteiligt einem Inkubationsschritt in PBS, die zehn Mal stärker konzentriert Penicillin / Streptomycin-Konzentration für 10 Minuten nach der Ernte der Scheiben vor Organ culture. Mit dem Jet-Lavage Schritt dieser Schritt hinfällig, da dieser Schritt vorteilhaft erscheint für die Kultivierung Zwecke.

Abbildung 1
Abbildung 1. Überblick über die methodischen Schritte an Rinder coccygeal Bandscheiben mit intakten Endplatten und eine dünne Schicht (1-2mm) von Knochen vorzubereiten. A) Schematische Darstellung der Bandscheibe (IVD) und ihre ernährungsphysiologischen Wege. B) Verfahren zum Ausschneiden der IVD mit einer angepassten Klinge-Halter und ein industrielles scharfe Klinge. C) Jet Lavage Schritt, um eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen und Stoffaustausch halten die Endplatten und 1-2 mm Knochen auf beiden Seiten angebracht zu ermöglichen. D) Schließlich wird die IVD kann in der Probenkammer eines Bioreaktors kultiviert werden oder für jede down-stream-Anwendung verwendet werden.

Abbildung 2
Abbildung 2 TOP:. Volle Länge frischem Rind Schwanz (idealerweise obtainiert innerhalb von 2-3 Stunden post mortem zu hohen Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Unten: Röntgenaufnahme eines Rinder-Schwanz um 6 Monate, welche die Existenz der Wachstumsfugen (GP), sekundäre Zentrum von Verknöcherung, zwischen den knöchernen Endplatten (EP) und der Wirbelkörpern (VB) im Alter.

Abbildung 3
Abbildung 3. A) Tools, um die Rinder Schwanz unter sterilen Bedingungen zu sezieren. B) Customized Blade-Inhaber, cut-out Bewegungs-Segmente aus der Rinder-Schwanz in Aktion während des Schneidens der Bandscheibe. C) Side-Blick auf den kundenspezifischen Blade-Halter mit einem Standard-Industrie-Klinge (Lutz, Deutschland).

Abbildung 4
Abbildung 4. Zeichnen und Bild von der Rinder-tail nach dem Entfernen der umgebenden Muskeln und Bänder, welche die Spaltung von Websites zum Ausschneiden der Bewegungs-Segmente. Teilweise Wirbel sollte "geknackt" werden with die maßgeschneiderte Messerhalter idealerweise 1-2 mm entfernt von der knorpeligen Endplatten, um sicherzustellen, voller Knochenoberfläche.

Abbildung 5
Abbildung 5. Demonstration der effektiven Reinigung des Jet-Lavage Schritt vor (A) und nach (B). Beachten Sie die saubere Knochenoberflächen der Bandscheibe Segmente nach dem Sprühverfahren.

Abbildung 6
Abbildung 6. Free-Schwellungen Diffusionsversuch an frisch zubereiteten herausgeschnitten Rinder Schwanz Bandscheiben (IVD) für 24 Stunden in 1% Procion rote Lösung links, demonstriert Blockade-Effekt durch das Wachstum Platte. Ein digitales Röntgen sagittale Ansicht eines IVD noch mit dem Wachstum Platte und eine zweite Schicht von Knochen Fluoreszenzmikroskopie Bild sagittal durchschnitten des Steißbeins Rinder Bandscheibe Explantation mit knorpeligen und knöchernen Endplatte nach 24h freie Diffusion. GP: Epiphysenfuge, 2ndry CO: Mittelzentrum der Verknöcherung.

Abbildung 7
Abbildung 7. Free-Schwellungen Experiment an frisch zubereiteten herausgeschnitten Rinder Schwanz Bandscheiben (IVD) für 24 Stunden in 1% Procion rote Lösung links, zeigt reinigende Wirkung der Jet Lavage Behandlung. Sagittal dicke Abschnitte (~ 100 mm) von Rindern herausgeschnitten IVD mit ~ 1,5-mmthick knöchernen Endplatten, die Jet-Lavage Behandlung (links) Steuerseite ohne Behandlung (rechts) jet-gespült Behandlung unterzog. Inlet zeigt das Spritzbild, die aus dem Zimmer Wundreinigung verwendet wurde 24 Stunden freie Diffusion Experimente von Rindern Bandscheibe Explantate in 1% Procion rot.

Abbildung 8
Abbildung 8. Live / Dead Bilder von Projektionen der konfokalen Imaging-Stacks (250μm) aus bovin genommene Bandscheibe Segmente mit diesem Jet-Lavage-Methode unter freien Schwellungen für 0 und 14 Tagen jeweils für den Nucleus pulposus (NP), der inneren Faserring (IA) und dem äußeren Faserring (OA) gehalten vorbereitet. Grüne Zellen = lebende Zellen von Calcein AM (Acetyl-Methylester) gefärbt, rote Blutkörperchen = tote Zellen Kern von Ethidium Homodimer-1 gefärbt.

Abbildung 9
Abbildung 9. Zellviabilitätsmessungen der Bandscheibe mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie an lebenden Gewebe und 3D-Stapel scannen. Die Lebensfähigkeit der Zellen des Nucleus pulposus (NP) und Faserring (AF) über die 21-Tage-Kultur unter free-Schwellungen Zustand. (Mittelwert ± SEM, N = 6) Statistische Unterschiede wurden mit nicht-parametrischen Kruskal-Wallis unterzeichnet Rangsummentest zwischen den Gruppen. Signifikante Unterschiede wurden zwischen Tag 21 und allen anderen Zeitpunkten in NP gefunden. Während in AF signifikanten Unterschiede zwischen Tag 7 gefundenTag 0. (* P <0,05, ** p <0,01).

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Discussion

Der erste Schritt für eine erfolgreiche Orgelkultur ist, um sicherzustellen, dass die Explantation sollte nicht kontaminiert werden. Die Rute sollte gehäutet, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen. Jedes Tier Haare in ein steriles Labor gebracht werden konnte in Bezug auf die Kontamination problematisch. Die Rinder Schwanz sollte idealerweise so frisch wie möglich (dies betrifft zunächst die Lebensfähigkeit der Zellen). Darüber hinaus ist die betadine Waschschritt empfohlen, das Risiko einer Kontamination weiter zu verringern. Anstelle der Verwendung eines maßgeschneiderten Messerhalter und einem Hammer auf die IVD aus dem Wirbelkörper zu trennen, könnte dies durch eine histologische Bandsäge (der Diamant-Trennscheibe sollte mit PBS oder Ringer-Lösung gekühlt werden beim Schneiden) durchgeführt werden. Beachten Sie, dass die Bandsäge, den Probenhalter und Schneidmesser sollten steril sein. Die Technik zeigte sich hier nicht um Rinder Schwanz IVD Isolation beschränkt, sondern kann auf andere Tierarten wie Schweine, Schafe und leporine caudal oder sogar Lendenwirbelsäule IVD Isolation erweitert werden. Für IVD hARVEST in der Region, wo Dornfortsätze vorhanden sind, ist es wichtig, alle Prozesse zunächst entfernen.

Die Lebensfähigkeit der Zellen Daten in Abbildung 9 gegeben wurden unter free-Schwellung bis zu 21 Tage gesammelt und kann als Referenz verwendet werden. Diese Methode hält die Lebensfähigkeit der Zellen für 14 Tage unter frei-Schwellung. Der Rückgang der Lebensfähigkeit der Zellen nach 21 Tagen konnte aufgrund der fehlenden mechanischen Belastung, die gezeigt worden ist, werden bei der Unterstützung Nährstoffdiffusion über die Endplatten wichtig und auf Disc Lebensfähigkeit der Zellen 3 aufrecht zu erhalten. Es wird sehr wahrscheinlich, dass die Lebensfähigkeit der Zellen wird noch höher unter hydrostatischen Druck-und / oder zusätzliche tägliche Belastung 8-10.

Als alternative Protokoll kann der Rinder-Discs, indem Sie alle angrenzenden Knochen der Wirbelsäule mit Hilfe eines zahnärztlichen Grat und gerade aus der knorpeligen Endplatten 11 hergestellt werden. IVD Lebensfähigkeit der Zellen wurde über 4 Wochen mit dieser Methode erhalten.Doch in diesem Fall Torsion kann nicht auf einfache Weise auf die Bewegungs-Segmenten angewendet werden, da es keine steifen Knochen vorhanden zu "greifen" die Scheibe. Die konkave Endplatten anstelle einer parallelen Flächen auf beiden Seiten muss auch eine Anpassung der Probenkammer in einem Bioreaktor-Design zu berücksichtigen für das Be-Profil Differenzen 11. Darüber hinaus ist die Evaluierung der Diffusion von Molekülen über knöchernen Endplatten auch unmöglich in diesen Explantaten.

Die Bedeutung unserer Arbeit

  • Der Einsatz von Single-Nutzung industrieller Klingen cut-out intakte Bandscheibe Segmente für Orgel Kultur verkürzt die Ernte-Protokoll erheblich zu den Protokollen, die einen Schnitt-Schritt mit einer histologischen Bandsäge verglichen. Auch die trabekuläre Struktur des Knochens ist nicht betroffen, wie es der Fall von einem Schleif-Bewegung mit einer Diamant-Sägeblatt.
  • Jet-lavaging der knöchernen Oberfläche spült-out geronnene Blut sehr effizient und significantly verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen des Nucleus pulposus (Mitte der Scheibe) im Laufe der Zeit im Vergleich zu unbehandelten Bandscheiben.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Dieses Projekt wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF # 310030-127586/1) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin).
Pulsavac Plus AC System Zimmer inc., Switzerland 00-5150-486-01 Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack d–s also work but is less convenient)
High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length Zimmer inc., Switzerland 00-5150-175-00 There are several spray heads available, we tested this one successfully
Scalpel blades #22 and #10 Swann-Morton #10: 0201 #22: 0208
Scalpel blade holder # 3 and #4 Hausmann, Germany #3: 06.103.00 #4: 06.104.00
Lutz industrial blade Lutz, Germany 1022.0884
Phosphate buffered Saline (PBS) Invitrogen 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) GIBCO, by Life Technologies 11960-044
Lactated Ringer’s solution (without glucose) Bichsel, Switzerland 133 0002
6-well multi-well plate Techno Plastic Products 92006
Betadine solution Mundipharma, Switzerland 10055025
Surgical skin marker Porex Surgical, Switzerland 9560
Large cutting board Any brand is possible

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References

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