En Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Kirurgisk lim, 'SurgiLux': Forberedelse og demonstrasjon

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fabrikasjon av en roman, fleksible tynnfilm kirurgisk lim fra FDA godkjente ingredienser, kitosan og indocyanine grønt er beskrevet. Liming av dette lim til kollagene vev gjennom en enkel aktiveringsprosessen med lavspent infrarød laser blir demonstrert.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Foster, L. J., Karsten, E. A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration. J. Vis. Exp. (68), e3527, doi:10.3791/3527 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Suturene er en 4000 år gammel teknologi som forblir "gull-standard" for lukking av sår i kraft av sin reparasjon styrke (~ 100 kPa). Imidlertid kan suturer fungere som en nidus for infeksjon og i mange prosedyrer er i stand til å bevirke sår reparasjon eller forstyrre funksjonell vev regenerasjon. 1 Kirurgiske lim og klebemidler, slik som de som er basert på fibrin og cyanoakrylater, har blitt utviklet som alternativer til suturer for reparasjon av slike sår. Men dagens kommersielle lim har også betydelige ulemper, alt fra virus og prion overføring og mangel på reparasjon styrke som med Fibrinlim, til vev giftighet og mangel på biokompatibilitet for Cyanoakrylat baserte lim. Videre, tilgjengelige kirurgiske klebemidler en tendens til å være gel-basert og kan ha utvidet herdetider som begrenser deres anvendelse. 2 Tilsvarende bruk av UV lasere lette tverrbindende mekanismer i proteinbasert eller albumin 'solders 'kan føre til DNA-skader, mens laser vev sveising (LTW) predisponerer termisk skade på vev. 3 Til tross for sine ulemper, lim og LTW har fanget ca 30% av lukking av sår markedet rapporteres å være i overkant av 5 milliarder USD per år, en betydelig testament til behovet for suturløs teknologi. 4

I søken suturløs teknologi har vi utnyttet kitosan som et biomateriale for utvikling av en fleksibel, tynn film, laser-aktivert kirurgisk klebemiddel betegnet 'SurgiLux'. Denne romanen bioadhesive bruker en unik kombinasjon av biomaterialer og fotonikk som er FDA godkjente og brukt i en rekke biomedisinske applikasjoner og produkter. SurgiLux overvinner alle de ulemper som er forbundet med suturer og aktuelle kirurgiske klebemidler (se tabell 1).

I denne presentasjonen rapporterer vi relativt enkel protokoll for fabrikasjon av SurgiLux og demonstreresin laser aktivering og vev sveis styrke. SurgiLux filmer overholde collagenous vev uten kjemisk modifisering som tverrbinding og gjennom bestråling ved hjelp av en forholdsvis lav-drevet (120 mW) infrarød laser istedenfor av UV-lys. Kitosan filmer har en naturlig, men svakt limet tiltrekning til kollagen (~ 3 kPa), understreker laser aktivering av chitosan baserte SurgiLux filmer styrken av denne adhesjon gjennom polymerkjede interaksjoner som følge av forbigående termisk ekspansjon. 5 Uten denne 'aktiveringen' prosess blir SurgiLux filmer lett fjernes. 6-9 SurgiLux har blitt testet både in vitro og in vivo på en rekke vev inkludert nerve, tarm, dura mater og hornhinne. I alle tilfeller viste det god biokompatibilitet og ubetydelig termisk skade som følge av bestråling. 6-10

Protocol

1. Utarbeidelse av SurgiLux Solution

  1. Forberede en 2% (v / v) løsning av eddiksyre ved hjelp av avionisert vann i et rent begerglass, bruke en laminær hette for å unngå forurensning.
  2. Veie 0,02% (w / v) av chromophore, indocyanine grønt ICG, i et sterilt Eppendorf rør; sikre røret er innpakket i folie for å forhindre noen lys penetrasjon.
  3. Ved hjelp av en ren, engangspipette, overføre omtrent 1 ml fortynnet eddiksyre til røret for å oppløse fargestoffet, rist forsiktig og holde innpakket i folie.
  4. Overfør solubilisert ICG inn begerglasset og legge til 2% (w / v) av kitosan pulver før tilsetning av en steril magnetrører.
  5. Dekk begerglasset med Parafilm deretter vikle i sølv folie, før blanding av de innholdet på ca 125 rpm i 72 timer ved romtemperatur i en laminær strømningshette.
  6. Overføre innholdet i rent sentrifugerør og sentrifuger ved 15.000 xg i 15 min ved 4 ° C for å fjerne eventuelle particulate saken.
  7. Nøye overføre grønne SurgiLux løsningen i en ren glassbeholder, dekke med Parafilm deretter vikle i sølv folie, før lagring i et kjøleskap i 12 timer for å øke viskositeten av løsningen.

2. Støping av SurgiLux Films

  1. Ved hjelp av en steril sprøyte og dispense 8 ml av den kalde SurgiLux løsningen i en ren, petriskål på 95 mm diameter, og forsiktig vippe platen for å sikre fullstendig dekning av løsningen. Å variere forholdet av løsningen volumet til støping området tillater kontroll av filmtykkelsen, se figur 1.
  2. Fjern eventuelle synlige bobler i løsningen ved hjelp av tuppen av en steril nål. Dekk formen i sølv folie og legg i kjøleskap for å fjerne eventuelle gjenværende mikron-størrelse bobler.
  3. Etter 20 min forsiktig fjerne petriskål fra kjøleskapet, sted i en laminær hette, dekk med folie og la løsningen å fordampe i 3 uker.
  4. Etter complete fordampning, vurdering de ytre kantene av den klare grønne SurgiLux film i petriskål og forsiktig 'skrelle filmen bort fra fatet overflaten.
  5. Den SurgiLux filmen skal være fleksibel og lett manipuleres uten å rive eller bryte.
  6. Oppbevar den sirkulære SurgiLux filmene i petriskål innpakket i folie på tørr veibane til alt er klart til bruk.

3. Laser Aktivering av SurgiLux Adhesive Films

  1. For å demonstrere laseren aktiveringsprosessen vi vil bruke et stykke av bovint vev som biff kuttet til en størrelse på 15 mm bredde og 20 mm lengde. Dissekere vevet i en rett linje ved hjelp av et nummer 10 kirurgiske blad, for å produsere 2 stykker av 15 med 10 mm.
  2. Tilnærmet de to biter av vev slik at kantene er rørende, men ikke overlappende, og ved hjelp av en bomullspinne eller gasbind, forsiktig absorbere overflødig væske.
  3. Deretter skjærer et stykke SurgiLux film 7 x 9 mm og forsiktig plasserer filmen på langs over bisected piece av vev, og trykk forsiktig ned med en tørr bomullspinne.
  4. SurgiLux filmer blir aktivert ved hjelp av en infra-rød diode laser ved en innstilling på 120 mW. Ettersom dette er en klasse IIIB laser, bør hensiktsmessige sikkerhetstiltak tas, herunder bruk av egnede vernebriller for alt personell.
  5. Starter i hjørnet, strålebehandling SurgiLux med en infrarød laser satt til 120 mW og en bjelke spot størrelse på 1 mm diameter. Passere strålen flekk over grønne filmen ved en hastighet på omtrent 1 mm per sekund. Gjenta bestråling prosessen to ganger til.

4. Styrke Repair

  1. Nøye sikre endene av vevet i klemmer en strekkprøvemaskin instrument. Vi bruker en Instron Mini55 system med en 50 Newton lastcelle. Maksimal belastning, strekkfasthet, og utvidelse ved brudd ble beregnet ved hjelp av Bluehill programvare (USA). Midler fra minst 10 prøver ble bestemt (n = 10).
  2. Ta opp 'slakk'og deretter skille vevet stykker med en hastighet på 1 mm pr sekund, inntil de to stykker av vevet holdt sammen av den SurgiLux felt avgrenset helt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sentrifugering fører til en gjennomsiktig grønn løsning, noe som øker viskositet etter lagring ved 4-6 ° C. Etter henstand i 3 uker, er det grønne løsningen omdannet til en gjennomsiktig grønn SurgiLux film ca 20 mikrometer tykt, og som vist i videoen, er lett fleksibel.

Ved bestråling med laser, SurgiLux film obligasjoner til vevet. Dette kan observeres ved kantene av filmen der vevet synes å faller like laserstrålen passerer over filmen (Figur 2). Ingen forkulling eller ablasjon av vevet og film bør observeres. Liming styrken SurgiLux til vevet bør være tilstrekkelig for å løfte bisected biter av vev, og når strekkfastheten måles må være omtrent 15 kPa for testen som rapporteres her.

Tabell 1
Tabell 1. </ Strong> Sammenligning av egenskaper for foreslåtte SurgiLux system og kommersielt tilgjengelig fibrin og Cyanoakrylat kirurgiske lim.

Figur 1
Figur 1 skjematisk illustrasjon av SurgiLux tynnfilm limet fabrikasjon og aktiveringsprosessen;.. Tilsvarende protokollen teksten Klikk her for å vise større figur .

Figur 2
Figur 2 Photograph (x20) som viser den tynne SurgiLux filmen etter laser aktivering overholdt bovint tarmen vev og 'kontrahering' inn i vevet innsnitt (T A, T B:. Separate stykker of vev, I: snitt, S: SurgiLux film).

Figur 3
Figur 3 Graf som viser vevsadhesjon styrker for ulike lim:. Chitosan og SurgiLux filmer anvendt på vev, TISSEEL (fibrin) og Histoacryl gels (cyanoakrylat) anvendt på vev.

Figur 4
Figur 4 scanning elektron mikrografer (SEM) som illustrerer celler festet til SurgiLux filmer;. Menneskecelle linjene (a) olfactory ensheathing celler [x1.5k], (b) stromale fibroblaster [X500], og (c) skjelettmuskel avledet satellitt stamceller [x1.7k]. Klikk her for å se større figur .


Figur 5. Graf som viser endringen i filmtykkelse med økende SurgiLux løsning avstøpning volum (ml) og en konstant avstøpning området (7,09 x 10 3 mm 2).

Figur 6
Figur 6. Scanning Electron Micrograph (SEM) av film som viser tilstedeværelsen av 'brystvorter' (SN) som stikker ut fra overflaten (S).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kitosan kan fås i en rekke molekylvekter og med ulik grad av deactylation (DDA). Variasjoner i kitosan renhet kan føre til tilstedeværelse av partikler i SurgiLux løsningen, sentrifugering brukes til å eliminere disse og bør resultere i en gjennomsiktig grønn løsning. Imidlertid kan filtrering også brukes som en ekstra eller alternativ fabrikasjon trinn. Som med alle materialer behandlingen, variasjoner, for eksempel chitosan DDA og molekylvekt, har implikasjoner for de fysiokjemiske, biologiske og materielle egenskapene til det resulterende SurgiLux filmer, inkludert styrken av sin binding til vev.

Fabrikasjonsprosessen for SurgiLux tillater stor variasjon. For eksempel endringer i forholdet mellom volumet til oppløsningen støpeflaten området (ml: mm 2) kan benyttes for å justere filmtykkelsen Figur 5 viser en lineær økning i tykkelsen av endelige SurgiLux filmer som volumet.av oppløsningen helles i petriskålen ble økt. Tilsvarende kan endringer i støpestykket overflaten brukes til å modifisere filmens overflatemorfologi. Figur 6 viser tilstedeværelsen av mikron-størrelse 'brystvorter' på overflaten av SurgiLux film. Slike templating teknikker kan benyttes til å fremstille forskjellige overflater for å forbedre vevsadhesjon, hindre mikrobiell celleadhesjon og fremme vev reintegrering. 11 Videre kan forskjellige biologisk aktive midler skal innlemmes fabrikasjonsprosessen å produsere en klebefilmen for regional levering av legemidler. 10

Tabell 1 oppsummerer de fordelene ved denne SurgiLux tynnfilm limsystem forhold til konvensjonelle fibrin og cyanoakrylatlim. Mens styrken av vev reparasjon er mindre enn suturer, unngår SurgiLux de tallrike ulempene ved denne tradisjonelle lukking av sår teknikk samt gjeldende favoriserte kommersielle kirurgiske klebemidler.

Evnen til SurgiLux å binde ulike collagenous vev kombinert med dens materielle fleksibilitet foreslår sitt potensial i laparoskopi, mens den allsidigheten av fabrikasjon prosessen fremmer den videre utvikling for bruk i tissue engineering og regenerativ medisin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Forfatterne erkjenner et stipend fra National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC # 1000674) til LJR Foster.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chitosan Sigma-Aldrich 448877
Indocyanine Green Sigma-Aldrich I2633 Also known as Cardiogreen
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm) CNI Lasers Fc-808 Variable system up to 5 W power
Laser safety glasses CNI Lasers LS-G
Tensile testing apparatus Instron Pty Ltd 5542 50 N load cell

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kjaergard, H. K. Suture support: is it advantageous. Am. J. Surg. 182, 15S-20S (2001).
  2. Lauto, A., Mawad, D., Foster, L. J. R. Adhesive biomaterials for tissue reconstruction. J. Chem. Tech. Biotech. 83, 464-472 (2008).
  3. Fung, L. C., Mingin, G. C., Massicotte, M., Felsen, D., Poppas, D. P. Effects of temperature on tissue thermal injury and wound strength after photochemical wound closure. Lasers Surg. Med. 25, 285-290 (1999).
  4. Piribo, Glues & Sealants: Industry Background Report. (2005).
  5. Lauto, A., Hook, J., Doran, M., Camacho, F., Poole-Warren, L. A., Avolio, A., Foster, L. J. R. Chitosan adhesive for laser tissue-welding: in vitro characterisation. Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).
  6. Lauto, A., Stoodley, M., Marcel, H., Avolio, A., Sarris, M., McKenzie, G., Sampson, D. D., Foster, L. J. R. In vitro and in vivo tissue repair with laser-activated chitosan adhesive. Lasers Surg. Med. 39, 19-27 (2007).
  7. Lauto, A., Foster, L. J. R., Avolio, A., Sampson, D., Raston, C., Sarris, M., McKenzie, G., Stoodley, M. Sutureless Nerve Repair with Laser-Activated Chitosan Adhesive: A Pilot in vivo Study. J. Photomed. Laser. Surg. 26, (3), 227-234 (2008).
  8. Marçal, H., Badylak, S. F., Sellaro, T. L., Lauto, A., Foster, L. J. R., Mahler, S. The coalescence of decellularized tissue scaffolds, laser-activated chitosan bioadhesive and olfactory ensheathing cells for tissue repair and regeneration of the spinal cord. Lasers Med. Sci. 23, (1), 96 (2008).
  9. Foster, L. J. R., Thomson, K., Marcal, H., Butt, J., Watson, S., Wakefield, D. A chitosan-vancomycin composite biomaterial as a laser activated surgical adhesive with regional antimicrobial activity. Biomacromolecules. 11, (12), 3563-3570 (2010).
  10. Shahbazi, J., Marcal, H., Watson, S., Wakefield, D., Sarris, M., Foster, L. J. R. Sutureless sealing of penetrating corneal wounds using a laser-activated thin film adhesive. Lasers Surg. Med. accepted 15/05/2011 Forthcoming.
  11. Meyers, M. A., Chen, P. -Y., Lin, A. Y. -M., Seki, Y. Biological materials: Structure and mechanical properties. Prog. Mater. Sci. 53, (1), 1-206 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics