العزلة ودراسة البيوفيزيائية البشرة من الفاكهة

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

محمية أجهزة محطة جوية من إهاب، وهو supramolecular biopolyester الشمع الجمعية. نقدم بروتوكولات لرصد إزالة الانتقائي للبرنامج الموسع للتمنيع، والشموع intracuticular البشرة من ثمرة الطماطم على مقاييس الجزيئية ومتناهية الصغر من قبل الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي النووي ومجهر القوة الذرية، على التوالي، وتقييم القدرات عبر ربط biopolyesters جليدية هندسيا.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chatterjee, S., Sarkar, S., Oktawiec, J., Mao, Z., Niitsoo, O., Stark, R. E. Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles. J. Vis. Exp. (61), e3529, doi:10.3791/3529 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إهاب، طبقة واقية مسعور على الأجزاء الهوائية من النباتات البرية ووظائفها، وحاجز دفاعي متعدد الاستعمالات لمختلف الضغوط الحيوية وغير الحيوية، وتنظم أيضا تدفق المياه من البيئة الخارجية. 1 A biopolyester (كوتين)، وسلسلة طويلة من الأحماض الدهنية ( الشموع) تشكل الإطار الأساسي الهيكلي للبشرة، والنزاهة الوظيفية للطبقة جليدية يعتمد على الطبقة الخارجية لل'epicuticular "، فضلا عن مزيج يتكون من البوليمر الحيوي كوتين و" intracuticular' الشموع 2 وهنا، نحن تصف وضع بروتوكول شامل. لاستخراج الشمع شاملة من الطماطم التجارية (مغد lycopersicum) البشرة فاكهة أو لإزالة الشمع وepicuticular intracuticular بالتتابع وبشكل انتقائي من مركب بشرة. تم تعديل طريقة Jetter وشافر (2001) لاستخراج متدرج من الشموع epicuticular وintracuticular من بشرة الفاكهة. 3،4 لمراقبةعملية إزالة الشمع متتابعة، الحالة الصلبة عبر الاستقطاب سحر الزاوية الغزل (CPMAS) 13 C تم استخدام الرنين المغناطيسي الطيفي بالتوازي مع مجهر القوة الذرية (فؤاد)، وتوفير المستوى الجزيئي الملامح الهيكلية للمواد السائبة تستكمل المعلومات عن تضاريس الميكروسكيل وخشونة السطوح جليدية. لتقييم قدرات عبر ربط البشرة dewaxed من المزروعة والبرية من نوع واحد الجينات الطافرة ثمار الطماطم، واستخدمت MAS 13 C NMR للمقارنة بين النسب النسبية لالأليفاتية الاوكسيجين (CHO وCH 2 O) الأنصاف الكيميائية.

dewaxing شاملة من قبل استخلاص Soxhlet متدرج مع لجنة من المذيبات متفاوتة قطبية يوفر وسيلة فعالة لعزل الأنصاف الشمع على أساس الخصائص مسعور من الأليفاتية والعطرية، مع الحفاظ على التركيبة الكيميائية للbiopolyester كوتين. استخراج الميكانيكية من الشموع epicuticular وسيليإزالة الشمع من ctive intracuticular، عندما ترصدها منهجيات بدنية تكميلية، ويوفر وسيلة غير مسبوقة للتحقيق في الجمعية إهاب: هذا نهج يكشف عن تنظيم supramolecular والتكامل الهيكلي لأنواع مختلفة من الشموع، والهندسة المعمارية من المصفوفة كوتين الشمع، والكيميائية لل تكوين كل التأسيسية. وبالإضافة إلى ذلك، الحالة الصلبة 13 C NMR يكشف عن اختلافات في الأعداد النسبية للCHO والكيميائية CH الأنصاف O 2 لمن النوع البري ومتحولة الحمراء ثمار الطماطم الناضجة. تقنيات الرنين المغناطيسي تقدم أدوات استثنائية لبصمة التركيب الجزيئي للمواد التي هي غير قابلة للذوبان جليدية، غير متبلور، وغير المتجانسة كيميائيا. كأسلوب موسع التصوير السطحي الانتقائي، فؤاد يوفر وسيلة فعالة ومباشرة للتحقيق في التنظيم الهيكلي للجمعية جليدية على مقياس طول نانومتر ميكرون.

Protocol

1. عزل الأنزيمية من الطماطم البشرة 5

  1. وضع العديد من الطماطم (البندورة) تجاري أو المزروعة في وعاء. قشر الجلد من الفواكه في قطاعات واسعة؛ تجاهل نسيج القشرة الداخلية. غسل الجلود الطماطم مع الماء منزوع الأيونات والحفاظ عليها تحت الماء في كوب.
  2. إعداد 50 ملي درجة الحموضة خلات الصوديوم 4.0 العازلة (في 31 درجة مئوية) وذلك بوضع 1،22 غرام من هيدرات خلات الصوديوم (م ص. 136.08 جم / مول) و 2.34 مل حامض الخليك الجليدي (17.485 م) في كوب، إضافة 200 مل من منزوع الأيونات الماء، ومن ثم ضبط درجة الحموضة إلى 4.0 في 31 درجة مئوية. إعداد مزيج يحتوي على 4 مل من بكتيناز (EC 3.2.1.15، و 10 مل يو -1، جزر تركس وكايكوس الأمريكية)، 0.2 غرام من سلولاز (EC 232.734.4؛ 1.3 وحدة / مجم الصلبة، سيغما الدريتش)، و 13 ملغ نان ثم قم بإضافة 196 مل من عازلة خلات الصوديوم إلى خليط انزيم للحصول على 200 مل من الكوكتيل انزيم النهائي. 5 تزج تماما الجلد الطماطم المقشرة في كوكتيل الانزيم واحتضانفي 31 درجة مئوية لمدة 24 ساعة مع الهز المستمر (G24 البيئة الحاضنة شاكر؛ نيو برونزويك العلمي شركاه).
  3. جمع جلود الطماطم باستخدام مصفاة المطبخ أو قمع بوخنر وغسلها بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، ووضعها في فرن فراغ في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. المحافظة على جلود الطماطم المجففة في زجاجة وصفت وتوج لإجراءات dewaxing اللاحقة.

2. شاملة Dewaxing بواسطة استخراج Soxhlet 6

  1. والمعدات المستخدمة لdewaxing شاملة تتكون من مصدر الحرارة (التدفئة وعباءة تحكم Variac)، جولة قارورة أسفل لخزان المذيبات، مستخرج Soxhlet، كشتبان متكلس من الزجاج القابل للتصرف أو كشتبان الاستخراج، ورقائق المضادة للارتطام ومكثف (انظر الشكل. 1). لاحظ أن ذراع سيفون ضيق (الأجزاء 6 و 7 في الشكل رقم 1) حساسة جدا وعرضة للكسر، والتي تتطلب معالجة متأنية.
  2. وضع 0،5-1 جرام من الجلد الطماطم (التي تم الحصول عليها فيالخطوة 1.) في بمدافع الهاون، وطحن العينة الى مسحوق خشن مع مدقة ما لم العينات لاستخدامها في القياسات فؤاد (القسم 5). ملء كشتبان متكلس من الزجاج أو القابل للتصرف في منتصف الطريق تقريبا مع العينة واستخدام الملقط وضعه بعناية عند قاعدة العمود الاستخراج.
  3. نعلق مكثف وألفه مع رقائق الألومنيوم. تسخين المذيبات الميثانول (ACS درجة) في وجود رقائق المضادة للارتطام قليلة حتى يغلي برفق وrefluxes على جدران القارورة. تغطية خزان مذيب مع الصوف الزجاجي على حد سواء، ورقائق الألومنيوم. تحقق هذه العملية لمدة ساعة، وتعديل الجهد Variac بحيث خزان تتجمع حول نقطة واحدة في الثانية، وشفط يحدث داخل جهاز Soxhlet عندما كشتبان غير كامل.
  4. تستمر عملية الاستخراج لمدة 12 ساعة، ثم خفض عباءة التدفئة والسماح للجهاز ليبرد. إزالة مستخرج وخزان كوحدة واحدة للتخلص من المذيبات. استخدم ينتف الريشالتمرير لرفع كشتبان إلى أسفل العنق من العمود الاستخراج، واستنزاف فائض مذيب منه، ووضع الكشتبان على سطح نظيف. إمالة عمود استخراج تسمح استخدامه في القارورة أدناه. قطع القارورة وصب النفايات في وعاء النفايات المسمى مذيب.
  5. كرر الخطوات من 2.3 و 2.4 على التوالي للمذيبات من قطبية تناقص تدريجيا، على سبيل المثال، الكلوروفورم والهكسين لمدة 12 ساعة في كل حالة على حدة.
  6. السماح للعينة كوتين الطماطم لتجف داخل كشتبان، إما عن طريق النفخ تيار من غاز النيتروجين أكثر من ذلك أو عن طريق وضعها في فرن فراغ في درجة حرارة الغرفة. أخيرا، قياس كتلة العينة الجافة وتخزينه في درجة حرارة الغرفة في وعاء المسمار أعلى ممهورة parafilm.

3. انتقائية عزل شموع Epicuticular وIntracuticular 3،4

  1. أولا، يغسل الطماطم كله (دفعة منفصلة من الطماطم (البندورة) من تلك التي وصفها في 1) مع الماء المقطر. تجفيفها مع حلمة الثديإيه المناشف وKimwipes، ووضعها وقف الهبوط على قطعة من رقائق الألومنيوم.
  2. تدهن الطماطم (البندورة) مع كامل 120٪ (وزن / وزن، نسبة الكتلة) صمغ عربي في محلول مائي من أعلى إلى أسفل الأزياء والسماح حوالي ساعة لالصمغ العربي لتجف على الجلد والفاكهة، وترك طبقة رقيقة. إزالة هذا الفيلم باستخدام الملقط، والحرص على عدم ثقب الجلد الطماطم. كرر الإجراء مرة أخرى.
  3. إضافة إلى الأفلام التي تحتوي على قوارير 1:1 (V / V) كلوروفورم المياه والمزيج لمدة ثلاث دقائق. بعد تحريض قوية وفصل المرحلة، ماصة خارج الكسور الكلوروفورم وتتبخر منها في قنينات منفصلة وكشف، وترك الشمع epicuticular. فإن الطماطم (البندورة)، لا تزال سليمة بدنيا. تراجع لهم في الكلوروفورم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وجمع شمع intracuticular بعد تبخير المذيب. الآن، قشر الطماطم (البندورة) والتعامل معهم إنزيمي (مع سلولاز وبكتيناز في عازلة خلات الصوديوم) لإزالة السليلوز والبكتين، على التوالي (كما هو موضح في
  4. اذا شئت، نفذ dewaxing شاملة على هذه البشرة معزولة إنزيمي بواسطة استخراج Soxhlet (راجع الخطوة 2)، وباستخدام ثلاثة من المذيبات القطبية متفاوتة (الميثانول، وكلوروفورم، والهكسين، على التوالي).

4. التوصيف الجزيئي للكوتين ثمرة الطماطم من الاستقطاب الصليب ماجيك الزاوية الحالة الصلبة النووية غزل بالرنين المغناطيسي (CPMAS ssNMR) 6

  1. مكان 4-6 ملغ من البشرة الطماطم dewaxed بالكامل (cutins) في 1.6 مم دوار زركونيا fastMAS استخدام الموفر من قبل المورد أداة التعبئة والتغليف. (اما البشرة الأرض dewaxed الطماطم أو قطع صغيرة جدا من البشرة dewaxed جزئيا مناسبة.) التأكد من أن يمتلئ العينة بشكل موحد، ولكن ليس بشكل محكم للغاية، في الدوار. بعد ارتداء غطاء رأس، والطلاء نصف الحد الأقصى مع قلم حبر علامة سوداء لتسهيل قياس معدل الدوران.
  2. ضبط shimming من مطياف الرنين المغناطيسي النووي للحد الأدنى من خط العرض الطيفي في الارتفاع نصفالثانية ومعايرة بروتون (1 H) والكربون (13 C) 90. ° بعرض نبض باستخدام مركب القياسية مثل ادامنتين
  3. باستخدام جليكاين أو الجلوتامين كما مركبات النموذج، والحصول على الحد الأقصى لكثافة إشارة عن طريق تحسين جميع المعلمات (هارتمان، هان مستويات من الطاقة مطابقة، 1 H - 13 C وقت الاتصال، heteronuclear 1 قوة فصل ح) من الغزل سحر الزاوية عبر الاستقطاب (CPMAS) التجربة. لطيف حصل على تردد H 1 من 600 ميغاهرتز، والظروف الموصى بها وتشمل 10 كيلوهرتز أو 15 كيلوهرتز تردد الغزل، تأخير 3 ثانية بين الاستحواذ، والبروتون heteronuclear الشوكي فصل 7 في قوة المجال المغناطيسي أي ما يعادل تردد من 185 كيلو هرتز.
  4. إدراج الدوار كوتين معبأة في التحقيق. ثم، وضع التحقيق في المغناطيس. زيادة سرعة دوران تصل إلى 10 كيلو هرتز تدريجيا للتحقق من والتعبئة والتغليف عينة جيدة والاستقرار الدوار. تحقق من استقرار نهائي الغزل من الدوار إلى داخل± 20 هرتز.
  5. ضبط ضبط ومطابقة المكثفات من لجنة التحقيق تكراري لتحقيق حد أدنى تفكير السلطة في كل من H 1 و 13 ترددات C NMR. ضبط درجة الحرارة التجريبية إلى 25 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة).
  6. بدء تجربة CPMAS قبل الأمثل المقابلة لحالة هارتمان، هان مطابقة العزم على التردد 10 كيلوهرتز الغزل.
  7. 4096 الحصول على العابرين، شرط الطيف مع الأسي (Lorentzian) خط توسيع نطاق 50-100 هرتز، والقيام تحويل فورييه لتوليد طيف الرنين المغناطيسي النووي من شدة إشارة مقابل الكيميائية التدريع (جزء في المليون).
  8. مرجع الكيميائية C 13 التحولات باستخدام خارجيا في مجموعة ادامنتين 38.4 جزء في المليون (-CH 2 - مجموعة) 8 كمعيار.
  9. زيادة وتيرة الغزل الدوار إلى 15 كيلو هرتز وتكرار قياس CPMAS (خطوات 4،6-4،8) المقابلة لحالة هارتمان، هان مطابقة تحدد في هذا التردد الأخير الغزل.
  10. Repeفي التجارب CPMAS (خطوات 4،1-4،9) مع الطبيعية (شمعي) وdewaxed جزئيا عينات بشرة الفاكهة.

5. سبر سطح البشرة الطماطم مع مجهر القوة الذرية (رقمي آلات الثالث ألف Nanoscope، والإجراءات سوف تختلف قليلا بين المجاهر) 6

  1. بدوره على مجهر المسح التحقيق (SPM) (الشكل 2)، وتأكد من أن يتم تعيين مفتاح الوضع مجهر تبديل لفرقة الميكروسكوب الاتصال الذرية (فؤاد) واسطة.
  2. رفع يدويا رئيس الحركة الوطنية الصومالية من خلال تحويل اثنين من المقابض أمام المستخدم للتعديل. فصل tipholder فؤاد من رئيس SPM بتدوير مسمار التثبيت في الجزء الخلفي من الرأس.
  3. استخدام الملقط لإزالة ناتئ فؤاد الموجودة من tipholder، ثم انتزاع بعناية نيتريد السيليكون جديد ناتئ (فؤاد التحقيق) من حزمة وتثبيته في مكان ناتئ القديمة. استخدام المجهر الضوئي للتحقق من أن لا يتم كسر ناتئ فؤاد المثبتة حديثا.
  4. نعلق عشره عينة بشرة الطماطم (مقطع من إهاب الطماطم dewaxed جزئيا ~ 10 ملم × 10 ملم) للقرص الصلب الذي لا يصدأ (عفريت العينة) مع وجهين الشريط. استخدام المجهر الضوئي للتحقق من أن سطح بشرة ثابتا وسلس بعد وضع العينة على عفريت.
  5. وضع عفريت مع الطماطم عينة إهاب على المنطقة المغناطيسية في الجزء العلوي من الماسحة الضوئية SPM.
  6. تعيين جبهة دليل التكيف مسمارين من الماسح الضوئي عالية من خلال تحويل المقابض؛ تعيين التكيف مرة أخرى بمحرك المسمار على نفس المستوى تقريبا مثل مسامير أخرى أمام اثنين. تأكد من أن يتم تعيين كل ثلاثة مسامير مرتفعة بما يكفي لتجنب كسر غيض فؤاد عندما وضع tipholder الى رئيس الحركة الوطنية الصومالية.
  7. إعادة إدراج tipholder في رأس الحركة الوطنية الصومالية وضمان الحصول عليها من خلال تشديد المسمار تحامل في الجزء الخلفي من الرأس.
  8. بعد تشغيل الليزر، ومحاذاة بقعة الليزر على ناتئ فؤاد باستخدام المركزية (ذ) وحق تعديل ليزر المقابض (X) على الجزء العلوي من الرأس.رصد شعاع الليزر تنعكس على قطعة من الورق لوضع بقعة الليزر بالضبط في نهاية ناتئ فؤاد.
  9. ضبط الموقف من المرآة المنقولة باستخدام تكراري المقابض تعديل photodetector لتحقيق أقصى قدر من إشارة (إشارة SUM)، وبالتالي ضمان أن يتم تلقي شعاع ليزر ينعكس بالتساوي من قبل الأرباع الأربعة من photodetector.
  10. تخفيض رأس فؤاد بواسطة التراجع الجبهة دليل التكيف مسامير وتعديل الظهر بمحركات المسمار من الماسح الضوئي SPM، ورصد بصريا نهج من طرف فؤاد نحو السطح عينة مع مجهر مقلوب. تأكد من أن جميع المسامير الثلاثة هم على نفس المستوى لتجنب القطع الأثرية من التصوير عينة مائلة. جلب طرف تجاه عينة، ولكن ليس قريبا جدا بحيث اللمسات طرف أو فواصل من خلال سطح العينة.
  11. عند هذه النقطة، ينعكس ضوء الليزر قبالة ناتئ فؤاد سوف ترتد قبالة مرآة المنقولة إلى photodetector. لوضع فؤاد اتصال مع سيلييهيخدع نيتريد فؤاد طرف، تعيين إشارة الإخراج (الإمالة عمودي) الجهد إلى -2 V لSetpoint V 0 وإشارة مهرجان دبي السينمائي الدولي (عمودي / أفقي فرق) إلى 0 الخامس عن طريق ضبط الموقف من المرآة.
  12. باستخدام برنامج Nanoscope، انقر على أيقونة المجهر واختيار الوضع المناسب (الاتصال وضع فؤاد).
  13. باستخدام "عناصر مسح الإعدادات" لوحة، تعيين معدل المسح الضوئي والمسح الضوئي على سبيل المثال حجم و 10 ميكرون حجم المسح الضوئي و 2 معدل المسح هرتز.
  14. السماح لطرف فؤاد لإشراك سطح عينة من خلال النقر على رمز الدخول معلومات سرية. من خلال التحكم في المسمار الخلفي بمحركات من قاعدة SPM، فإن البرنامج حاليا إلى تخفيض رأس حتى يشرك سطح العينة. وسوف تبدأ عملية المسح تلقائيا بمجرد التلميح شاركت بنجاح.
  15. مراقبة عملية المسح الضوئي باستخدام كل صورة ونطاقها وسائط من البرنامج، تعديل معايير مثل setpoint، مكسب لا يتجزأ، وزيادة يتناسب وحجم المسح، معدل المسح الضوئي، وعينات من خطوط / خط تكراري لتحقيق أعلىقرار الصور. بدء المسح الضوئي مع مجموعة Z-محور كبيرة (حجم البيانات)، ثم خفض قيمة بعناية نطاق البيانات لمراقبة أفضل على النقيض من السمات السطحية على الصورة. الحد من وقوع مناطق بيضاء في الصورة الممسوحة ضوئيا، والتي تشير إلى أن ارتفاع سطح ملامح يتجاوز ما هو متاح Z-محور النطاق.
  16. التقاط صورة لحفظ الملف البيانات، ثم معالجة البيانات باستخدام وظائف تسطيح لإزالة القطع الاثرية صورة بسبب الانحراف العمودي الماسح الضوئي (Z)، والانحناء صورة، وإزاحة رأسية بين خطوط المسح (9)؛ حساب أخيرا خشونة في المتوسط. بعد حفظ البيانات، والتراجع عن الطرف فؤاد عن طريق عكس عمل محرك المسمار الكمبيوتر التي تسيطر عليها التي تم استخدامها للانخراط فيه. ويمكن تنفيذ معالجة الصور في صورة الوضع حاليا تحليل و / أو استخدام كمبيوتر آخر.
  17. استخدام واجهة المقابض أسفل معدن رمادي صاحب تلميح لتغيير المواقف x و y لمنطقة المسح الضوئي، ثم كرر قياس على عينة المحلى 5ستعقد لفحص استنساخ، لتحل محل ناتئ فؤاد إذا كانت جودة الصورة تتدهور.

6. ممثل النتائج

حدد التحليل الكيميائي التحول من ال 13 CPMAS أطياف الرنين المغناطيسي النووي C (الشكل 3) مجموعات رئيسية وظيفية موجودة في إهاب الطماطم dewaxed الحصر (كوتين). تم العثور على الأنصاف الكربون الرئيسية في biopolyester كوتين أن تكون سلسلة طويلة aliphatics (0-45 جزء في المليون)، aliphatics المؤكسج (45-110 جزء في المليون)، تتضاعف المستعبدين والعطريات (110-160 جزء في المليون)، وكربونيل (160-220 جزء في المليون). والأنصاف الاوكسيجين ألكيل (CHO + CH 2 O) تلعب دورا حاسما في إقامة اتصالات بين وحدات التساهمية أحادى من البوليمر الحيوي كوتين، وبالتالي تكوين البنية الجزيئية للمصفوفة كوتين. الخلافات في مناطق الذروة النسبية التي لوحظت في منطقة الطيفية بين 45 و 100 جزء في المليون تشير إلى أن كوتين متحولة لديها نسبة كبيرة نسبيا من عبر وصلة structura CHO تشكيل الأنصاف لتر مقارنة مع من النوع البري كوتين؛ قياسات كمية دقيق باستخدام الاستقطاب المباشر (DPMAS) الرنين المغناطيسي النووي 5 طرق دعم هذا الاستنتاج (لا تظهر البيانات).

CPMAS 13 C NMR الأطياف كما أظهرت قمة شمع تناقص تدريجيا في 31 صفحة في الدقيقة (الشكل 4)، مما يدل على إزالة متتابعة من الشموع، والبرنامج الموسع للتمنيع، intracuticular من مركب كوتين الشمع مع الحفاظ على العمارة الكيميائية الرئيسية للالبوليمر الحيوي كوتين. وكشف تحليل صورة موازية فؤاد (الشكل 5) مخالفات سطح نظرا لاستخراج متدرج من الشموع، والبرنامج الموسع للتمنيع، intracuticular من بشرة الفاكهة، مما يدل على تغييرات في تنظيم الجمعية جليدية.

الشكل 1
. الشكل 1 Soxhlet مستخرج (مصدر الصورة: ويكيبيديا).

"/>
الشكل 2. ان تحقيقا المسح) المجهر. B) SPM رئيس (مقتبس من دليل التدريب فؤاد تقدمها آلات رقمية).

الشكل (3)
الشكل 3. 150 ميغاهيرتز CPMAS 13 أطياف الرنين المغناطيسي النووي C الحمراء الناضجة dewaxed الحصر البشرة ثمرة الطماطم (cutins) من نوع البرية (M82) ومتحولة (CM15) تظهر الأصداء مع التحولات الكيميائية المقابلة للجماعات وظيفية من حامض hydroxyfatty عبر ربط القائم على البوليستر، وكذلك بعض الأنصاف تتضاعف المستعبدين. تم الحصول على جميع الأطياف مع تردد 10 كيلوهرتز الغزل.

الشكل 4
الشكل 4. 150 ميغاهيرتز 13 أطياف الرنين المغناطيسي النووي CCPMAS الحمراء الناضجة التجارية البشرة ثمرة الطماطم عرض التغييرات التركيبية على إزالة متتابعة من الشموع epicuticular وintracuticular بواسطة استخراج الصمغ العربي والميكانيكية TW 1س دقيقة الكلوروفورم تراجع، على التوالي. تم الحصول على جميع الأطياف مع تردد 15 كيلوهرتز الغزل.

الشكل 5
البشرة وصف الشكل 5. صور فؤاد وتقديرات للخشونة الطماطم التجارية dewaxed جزئيا في الشكل (4) بعد زوال تدريجي من الشموع (يمين) epicuticular (يسار) وintracuticular.

Discussion

وصف البروتوكولات تسمح الوثيقة للمفصل التوصيف الجزيئي والميكروسكيل من المواد النباتية المستعصية المعقدة دون الحاجة إلى انهيار الكيميائية المدمرة. للتحقيق في المزج بين biopolyester كوتين مع الدهون المختلفة (الشموع) التي تتحكم في التنظيم الهيكلي للجمعية جليدية، 10 اجريناه ورصد الإجراءات لإزالة انتقائية من الشموع epicuticular وintracuticular من مزيج من جليدية غير المتجانسة. واستخدمت الحالة الصلبة 13 C NMR لقياس استخراج مكونات الشمع الجزيئية، وذرية المجهر قوة عمل لدراسة التغيرات المصاحبة في خشونة السطح. 6،11 لمقارنة القدرات عبر ربط cutins من الجينات المزروعة واحدة من النوع البري و ثمار الطماطم متحولة، كما تم استخدام الحالة الصلبة 13 C NMR لتقدير الأعداد النسبية للCHO وCH 2 الأنصاف يا الكيميائية.

وهناك عدد من ميزة تصميمق من هذا البروتوكول جديرة بالملاحظة. كما تشمل المواد الشمع مجموعة واسعة من الدهون، وعلاج بشرة الفاكهة مع سلسلة من المذيبات وجود أقطاب متنافرة أمر ضروري لتحقيق dewaxing شاملة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف من وقت dewaxing 8 ساعات إلى 24 ساعة تبعا لطبيعة العينات بشرة. لاستخراج الشمع epicuticular باستمرار من إهاب فاكهة سليمة، لا بد من تطبيق طلاء لاصق بشكل موحد على السطح.

الحالة الصلبة CPMAS 13 C NMR 12 هو طريقة سريعة لتحديد نوعية مكونات هيكلية مختلفة من البوليمرات الحيوية النباتية غير متجانسة للغاية وغير قابلة للذوبان مع الحفاظ على خصائصها الفيزيائية الأصلية، ويمكن أيضا 13 التقليدية حل الدولة الرنين المغناطيسي النووي يمكن استخدامها لوصف خليط من الشمع المستخرج. إذا كان المطلوب تقدير كمي للجماعات وظيفية للبوليمرات مصنع سليمة، 5 عالية الدقة المباشر الاستقطاب سحر الزاوية الغزل (DPMAS) 13 C وينبغي استخدام الرنين المغناطيسي النووي 5،14 كوسيلة تكميلية. تحديد الكميات الدقيقة من المجموعات الوظيفية يتطلب التحسين دقيق مرات إعادة تدوير، وأطوال نبض الإثارة، وقوة فصل heteronuclear. يمكن تعيين 15 وفصل heteronuclear لقوة 1 حقل H تتراوح بين 50 كيلو هرتز إلى 185 كيلو هرتز باستخدام TPPM 16 أو في العمود الفقري 7 المنهجيات. وبالإضافة إلى هذه المعايير، وحساسية من قياسات CPMAS يعتمد على الوقت تدور القفل وهارتمان، هان حالة مطابقة. (15) وفي مكان CPMAS التقليدية، ويمكن تنفيذ المنحدرة، سعة CP (RAMP-CP) تقنية لتعظيم الصليب القطبية الكفاءة من خلال تغيير السعة H 1 خطيا (~ 20-50٪) أو هامشية مع الحفاظ على السعة من 13 قوة الحقل C مستمر خلال الفترة تدور القفل (أو العكس). 17،18 إجراء القياسات في CPMAS ما لا يقل عن 2 ر مختلفةتور الغزل الترددات لا بد من التمييز بين sidebands الغزل من قمم الطيفية الرئيسية.

المتزامنة قياسات AFM التي أجريت في وضع الاتصال تمكين التصوير المباشر لحالة سطح بشرة بسرعات المسح العالية وارتفاع القرار، و 19 على سبيل المثال خلال إزالة متتابعة من مكونات شمعية. فؤاد العاملة في التنصت على (عدم الاتصال) ويمكن استخدام طريقة كبديل لتوصيف سطح "لينة" حساسة المواد النباتية، وتجنب الأضرار المحتملة نتيجة للقوات (القص) الجانبية وتجريف سطح العينة. 5،20 في كلتا الحالتين ، واقتناء متتابعة من صور متعددة من نفس البقعة على السطح يعمل على تحديد أي ضرر السطح بسبب "التفاعلات مسبار على سطح" في قياسات AFM. 6،21 للحصول على استنساخ الأمثل، يجب أن تحقيقات فؤاد مع الثوابت ربيع مناسبة للأسطح جليدية الناعمة لن تكون ينبغي الحفاظ على استخدامها، وثبات درجة الحرارة والرطوبة. 6،15،20 22،23 مكمل لتتبع تضاريس سطح هذه التجمعات الجزيئات المعقدة بشكل رائع. 1،2

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل الولايات المتحدة الوطنية للمنح مؤسسة العلوم # MCB-0741914 و 0843627 MCB؛ وقدم دعم البنية التحتية إضافية في كلية مدينة نيويورك من قبل المعاهد الوطنية للصحة 2 G12 RR03060-26 من المركز الوطني للبحوث الموارد. نحن نعترف بامتنان JKC روز مجموعة في قسم جامعة كورنيل بيولوجيا النبات لتوفير M82 (نوع البرية) وCM15 (المسخ) البشرة الطماطم. نشكر الدكتور سبيروس Monastiriotis من مجموعة الهندسة الكيميائية حقائق عجيبة البروفيسور الكسندر Couzis لمساعدته السخية مع التجارب فؤاد. نحن نشكر السيدة لورين الجوهره للحصول على دعم تصميم الرسوم البيانية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S8625-500G
Pectinase TCI America P0026 EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator
Cellulase Sigma-Aldrich C1184-100KU EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator
Glacial Acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G Extremely hazardous
Incubator/shaker New Brunswick Scientific Model No.G24 MFG No.M1036-000G
Vacuum Oven Precision Scientific 31566
Variac Controller
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) VWR international 89056
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) VWR international 28320
Methanol VWR international EMD-MX0485-7
Glass wool VWR international RK20789
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100
Tweezers VWR international 82027-452
Chloroform VWR international EM-CX1050-1
Hexane Fisher Scientific H302-4
Nitrogen gas
Parafilm VWR international 52858
Paper towels VWR international 89002-984
Kim wipes VWR international 21905-026
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752
1.6 mm fastMAS zirconia rotor Varian Inc., Agilent
NMR spectrometer Varian Inc., Agilent standard bore magnet
Glycine Sigma-Aldrich 50046 Model compound for CPMAS
Glutamine Sigma-Aldrich 49419 Model compound for CPMAS
Adamantane Sigma-Aldrich 100277 To calibrate 90° pulse in NMR
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) Digital Instruments
Nanoscope software Digital Instruments Version 5.30r3sr3 (2005)
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) Veeco Instruments, Inc. Model NP-20
Light microscope Digital Instruments
Magnetic puck Digital Instruments
Double sided tape VWR international
Fruit Peeler
Büchner funnel VWR international 89038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. The biophysical design of plant cuticles: an overview. New Phytologist. 189, 938-949 (2011).
  2. Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material? Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).
  3. Jetter, R., Schäffer, S. Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development. Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).
  4. Vogg, G. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).
  5. Isaacson, T. Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss. Plant J. 60, 363-377 (2009).
  6. Round, A. N. The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR. Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).
  7. Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids. J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).
  8. Morcombe, C. R., Zilm, K. W. Chemical shift referencing in MAS solid state NMR. J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).
  9. Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods. J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).
  10. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).
  11. Stark, R. E. NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters. Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).
  12. Schaefer, J., Stejskal, E. O. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle. J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).
  13. Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions. Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).
  14. Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester. Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).
  15. Stark, R. E., Garbow, J. R. Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall. Macromolecules. 25, 149-154 (1992).
  16. Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids. J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).
  17. Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR. J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).
  18. Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields. J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).
  19. lessandrini, A., Facci, P. AFM: a versatile tool in biophysics. Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).
  20. Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques. J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).
  21. Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).
  22. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).
  23. Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics