कृन्तकों के लिए पूरे पशु परफ्यूज़न फिक्सेशन

Neuroscience
 

Summary

चूहे के दिल के माध्यम से मस्तिष्क का सबसे अच्छा संभव संरक्षण प्राप्त: यहाँ हम एक कम लागत, तेजी से, नियंत्रित और वर्दी निर्धारण 4% नाड़ी तंत्र के माध्यम से perfused paraformaldehyde का उपयोग प्रक्रिया का वर्णन.

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Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564, doi:10.3791/3564 (2012).

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Abstract

स्थिरीकरण के लक्ष्य के लिए तेजी से और समान रूप से एक जीवन की तरह राज्य में ऊतक बनाए रखने के लिए है. जबकि ऊतक सीधे लगानेवाला कार्यों में अच्छी तरह से रखने के ऊतक के छोटे टुकड़े, विसर्जन के निर्धारण के लिए एक समस्या खड़ी बरकरार मस्तिष्क की तरह बड़ा नमूनों के लिए क्योंकि लगानेवाला ऊतक के सभी क्षेत्रों में एक ही दर 5,7 पर तक पहुँच नहीं है. अक्सर, hypoxia के जवाब में परिवर्तन शुरू से पहले ऊतक 12 संरक्षित किया जा सकता है. सीधे संचार प्रणाली के माध्यम से लगानेवाला perfusing का लाभ यह है कि रासायनिक जल्दी जीव प्राकृतिक संवहनी नेटवर्क का उपयोग के हर कोने तक पहुँच सकते हैं. क्रम में संचार प्रणाली का उपयोग करने के लिए सबसे प्रभावी ढंग से देखभाल करने के लिए शारीरिक दबाव 3 मैच के लिए ले जाया जा चाहिए. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि शारीरिक दबाव इस्तेमाल प्रजातियों पर निर्भर हैं. तकनीक छिड़काव निर्धारण के लिए तय किया जा ऊतक के आधार पर बदलती हैं और ऊतक निम्नलिखित निर्धारण कैसे संसाधित किया जाएगा. इस वीडियो मेंचूहे के दिल के माध्यम से immunohistochemistry के लिए मस्तिष्क की सर्वोत्तम संभव संरक्षण प्राप्त है, हम एक कम लागत, तेजी से, नियंत्रित और वर्दी निर्धारण 4% नाड़ी तंत्र के माध्यम से perfused paraformaldehyde का उपयोग प्रक्रिया का वर्णन. इस तकनीक का मुख्य लाभ (बनाम सिस्टम गुरुत्वाकर्षण खिलाया) है कि संचार प्रणाली सबसे प्रभावी ढंग से उपयोग किया जाता है.

Protocol

1. लगानेवाला तैयार

(तालिका लगानेवाला और Buffers देखें.)

2. परफ्यूज़न Buffers तैयार

(तालिका लगानेवाला और Buffers देखें.)

3. उपकरण और संज्ञाहरण तैयार

  1. 37 के लिए पानी स्नान, गर्म छिड़काव बफर का प्रयोग डिग्री सेल्सियस एक बफर के साथ भरा बीकर में जगह आउटलेट वाल्व. बफर के साथ एक 50 मिलीलीटर सिरिंज भरें और लगानेवाला टयूबिंग के लिए देते हैं. टयूबिंग को खदेड़ने और बफर वापस द्वारा बार - बार एक रंग के ताशों का जोड़.
  2. बफर के साथ लाइन साफ़ तक टयूबिंग में सभी हवाई बुलबुले को समाप्त हो जाते हैं. यह लाइनों के किसी भी हवाई बुलबुले नहीं है के छिड़काव की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. सिरिंज निकालें और 4% paraformaldehyde के कमरे के तापमान लगानेवाला कंटेनर कनेक्ट. टयूबिंग अंत में हवाई बुलबुले से बचने, निचोड़ ट्यूब जबकि कंटेनर में ट्यूब स्थिति इतनी है कि अंत टी से बफर protrudes की एक बूंदकंटेनर के भीतर तरल पदार्थ सतह से संपर्क ओ.
  4. आउटलेट बंदरगाह (सुई अंत) को बंद करें. बारी से लगानेवाला वाल्व (सफेद) के रूप में एक ही स्थिति के लिए बफर वाल्व (नीला). यह केवल बफर लाइन से प्रवाह की अनुमति होगी.
  5. आउटलेट बंदरगाह खोलें और बफर लाइन भरने के लिए A3 के माध्यम से A1: कदम दोहराएँ. के बाद सभी हवाई बुलबुले के पास आउटलेट बंदरगाह का सफाया कर रहे हैं, सिरिंज को हटाने और बफर कंटेनर कनेक्ट ख्याल रख रही टयूबिंग में हवाई बुलबुले नहीं परिचय.
  6. रबर दबाव नापने का यंत्र रोना पंप द्वारा दबाव धारण करने की क्षमता के लिए परीक्षण प्रणाली. वहां आम तौर पर कुछ सिस्टम में हवा के संपीड़न के कारण प्रतिरोध है.
  7. उपयोग के लिए आसान के लिए आदेश में शल्य चिकित्सा उपकरण सेटअप. बफर के छिड़काव सुई के साथ भरें हवाई बुलबुले की संभावना को खत्म करने.
  8. सर्जरी से पहले, एक मिश्रण / ketamine xylazine (80 मिलीग्राम / किग्रा वजन शरीर ketamine और 10 मिलीग्राम / किग्रा वजन शरीर xylazine) intraperitoneal इंजेक्शन (27 गेज सुई और 1 सीसी सिरिंज के) के माध्यम से प्रशासित किया जाता है. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के अतिरिक्त प्रशासन प्रत्येक आपरेशन के दौरान संज्ञाहरण के एक शल्य विमान को बनाए रखने के दौरान आवश्यक के रूप में प्रदर्शन किया जाएगा.

4. छिड़काव सर्जरी

  1. एक बार जानवर संज्ञाहरण के एक शल्य विमान तक पहुँच गया है, कुचल बर्फ से भरा उथले ट्रे पर जगह है. पैर की अंगुली (चुटकी - प्रतिक्रिया विधि का प्रयोग करें संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण पशु जारी रखने से पहले अनुत्तरदायी होना चाहिए.).
  2. आवरण और रिब पिंजरे के नीचे पेट की दीवार के माध्यम से एक 5-6 सेमी पार्श्व चीरा बनाते हैं. डायाफ्राम से ध्यान से जिगर अलग.
  3. घुमावदार, कुंद कैंची का उपयोग डायाफ्राम में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. और अपनी उंगली की स्थिति दबाव को डायाफ्राम कटौती करने की क्षमता में सहायता कर सकते हैं.
  4. रिब फुफ्फुस गुहा बेनकाब पिंजरे की पूरी लंबाई के साथ डायाफ्राम चीरा जारी रखें.
  5. पसलियों के एक पक्ष के साथ घुमावदार, कुंद कैंची रखें, ध्यान से फेफड़ों को विस्थापित, और घनरिब पिंजरे के माध्यम से हंसली के लिए टी. Contralateral पक्ष पर एक इसी तरह की कटौती करें.
  6. उरोस्थि दूर भारोत्तोलन, ध्यान से किसी भी दिल को जोड़ने के ऊतकों ट्रिम. Hemostat साथ उरोस्थि की नोक दबाना और सिर पर hemostat जगह है. जब ठीक से किया है, थाइमस, उरोस्थि साथ साथ दिल से दूर हटाया, प्रमुख वाहिकाओं की एक स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करते हैं.
  7. बाएँ वेंट्रिकल का उपयोग परितारिका कैंची के पीछे अंत में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं.

चित्रा 1
बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

  1. आरोही महाधमनी में कटौती निलय के माध्यम से एक 15 गेज कुंद या जैतून इत्तला दे दी छिड़काव सुई से गुजरती हैं. टिप महाधमनी की दीवार के माध्यम से दिखाई होना चाहिए, और महाधमनी चाप जहां बाहु और मन्या धमनियों हट जाना तक पहुंच नहीं होना चाहिए.
  2. Hemostat का उपयोग करने के लिए दिल दबाना, इस सुई सुरक्षित है और रिसाव को रोकता है. अगर वांछित है, संशोधित hemostat सुई टिप के आसपास महाधमनी दबाना (इन hemostats जगह में रहते हैं जब तक विच्छेदन शुरू होता है, लेकिन स्पष्टता के लिए भविष्य चित्र से लोप कर रहे हैं) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. अंत में, पशु सही परितारिका कैंची का उपयोग आलिंद अवरोही महाधमनी को नुकसान पहुँचाए बिना संभव के रूप में एक दुकान के रूप में बड़े बनाने के लिए एक चीरा बनाने के. इस बिंदु पर पशु perfused करने के लिए तैयार है.

5. छिड़काव

  1. खोलें और सुई देखभाल लेने के लिए किसी भी हवाई बुलबुले नहीं परिचय आधार आउटलेट बंदरगाह देते हैं.
  2. 80 मिमी Hg के एक जल्दी से और समान रूप से दबाव नापने का यंत्र बल्ब पंप. बफर जलसेक अवधि के दौरान इस दबाव बनाए रखें. टाइमर शुरू.
  3. सुई कोण समायोजित करें. सुई के कोण एक अधिकतम प्रवाह दर (कोण समायोजन के साथ प्रवाह परिवर्तन नोट) की उपलब्धि के लिए महत्वपूर्ण है.
  4. शौकीन स्विचएर (नीला) वाल्व एक बार बफर लगभग समाप्त हो गया है (200 मिलीलीटर). द्रव स्पष्ट किया जाना चाहिए. जिगर का समाशोधन एक अच्छा छिड़काव का एक संकेतक है. जिगर में इस बिंदु पर स्पष्ट किया जाना चाहिए. अपने रिकॉर्ड के लिए समय से संकेत मिलता है.
  5. फिक्सेशन झटके सेकंड के भीतर मनाया जाना चाहिए, इस निर्धारण का सही समय माना जाना चाहिए. अपने रिकॉर्ड के लिए समय से संकेत मिलता है.
  6. दबाव धीरे - धीरे 130 मिमी 2 पारा की एक अधिकतम करने के लिए बढ़ाने के लिए एक सतत प्रवाह दर को बनाए रखने कर सकते हैं.
  7. आउटलेट वाल्व बंद एक बार लगानेवाला लगभग समाप्त हो गया है. अपने रिकॉर्ड के लिए समय समाप्त होने का संकेत मिलता है.
  8. चूहे इस स्तर पर कठोर होना चाहिए.
  9. इस्तेमाल किया paraformaldehyde एकत्र किया जाना चाहिए है और अपनी संस्था के नियमों के अनुसार संग्रहीत निपटान के लिए.

6. 4,11 विच्छेदन

  1. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर सिर निकालें.
  2. गर्दन से नाक के आवरण के साथ एक midline चीरा और बेनकाबखोपड़ी.
  3. शेष गर्दन की मांसपेशियों को छाँटो इतनी है कि खोपड़ी के आधार संपर्क में है, किसी भी अवशिष्ट कैंची या rongeurs का उपयोग मांसपेशियों को दूर.
  4. एक तरफ रंध्र मैग्नम में परितारिका कैंची की एक जोड़ी की तेज अंत प्लेस, ध्यान से खोपड़ी के भीतरी सतह के साथ कैंची फिसलने.
  5. अगले, एक कट पीछे खोपड़ी की सतह के बाहर किनारे करने के लिए प्रदान करते हैं. Contralateral तरफ एक समान कटौती करें. सेरिबैलम के आसपास खोपड़ी स्पष्ट rongeurs का प्रयोग करें.
  6. ध्यान से खोपड़ी के भीतरी सतह के साथ कैंची स्लाइड के रूप में टिप लिए पृष्ठीय बाहर पीछे कोने से खोपड़ी के बाहर ललाट किनारे करने के लिए यात्रा, ब्लेड पर ऊपर उठाने के रूप में आप मस्तिष्क को नुकसान को रोकने के लिए काट रहे हैं. विपरीत पक्ष के लिए दोहराएँ.
  7. खोपड़ी की पृष्ठीय सतह छील rongeurs दूर का प्रयोग दिमाग से. दूर खोपड़ी rongeurs का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह के पक्ष को छाँटो.
  8. एक रंग का उपयोग करना है, घ्राण बल्ब और तंत्रिका कनेक्शन तोड़मस्तिष्क के उदर की सतह के साथ माहौल.
  9. धीरे मस्तिष्क सिर से दूर, किसी भी ड्यूरा कि अभी भी परितारिका कैंची का उपयोग खोपड़ी मस्तिष्क जोड़ता तंग trimming के.
  10. मस्तिष्क निकालें और यह लगानेवाला युक्त तरल पदार्थ कम से कम 10x ही मस्तिष्क की मात्रा की एक शीशी में डाल दिया. शीशी कभी कभी भंवर.

7. पोस्ट - निर्धारण और संग्रहण

  1. लगानेवाला में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मस्तिष्क रखने के लिए, कभी कभी घूमता.
  2. 24 घंटे के बाद, फॉस्फेट के साथ मस्तिष्क धो मीडिया 3 बार का आदान प्रदान और हर बार घूमता खारा बफर.
  3. दिमाग तो फॉस्फेट में संग्रहित किया जा सकता है खारा सोडियम azide साथ या HBHS बफर और 4 में रखा डिग्री सेल्सियस

8. प्रतिनिधि परिणाम

छिड़काव की सफलता का एक प्रारंभिक सूचक extremities के रूप में नाक, कान, और पंजे और thymus ग्रंथि और जिगर (आईएचसी विश्व) के रूप में आंतरिक अंगों को साफ है.मस्तिष्क की सकल निरीक्षण (सफेद पीला पीला उपस्थिति) रक्त के रक्त वाहिका शून्य से पता चलता है. यह भी धुंधला हो जाना और immunohistochemistry के लिए नियुक्त करना ऊतक वर्गों के भीतर सच हो जाएगा. छिड़काव के परिणाम की अंतिम सूचक ऊतकों में फैटी की हालत 1,6,7,8.

लगानेवाला तैयार:
8% Paraformaldehyde स्टॉक तैयार
  1. 500 मिलीलीटर DH 2 ओ के लिए 40 ग्राम Paraformaldehyde जोड़ें 60 से हल गर्मी - 65 डिग्री सेल्सियस जबकि सरगर्मी (क्या 65 से अधिक डिग्री सेल्सियस, ऐसा करने पर प्रतिकूल immunohistochemical प्रक्रिया की सफलता को प्रभावित कर सकते हैं).
  2. स्पष्ट समाधान के लिए, गर्मी को कम करने और एक dropper के साथ 1.0 एम NaOH के 2-3 मिलीग्राम जोड़ें.
  3. फ़िल्टर और डिग्री सेल्सियस 4 में 1 महीने के लिए दुकान.
0.2 एम सोडियम फास्फेट बफर, 7.4 पीएच तैयार
  1. सोडियम फॉस्फेट अकेले आधार का स्टॉक, 1 एल DH 2 ओ 27.8 छ नः 2 पीओ 4 * एच 2 हे
  2. सोडियम फॉस्फेट द्विबेसीय स्टॉक के लिए, 1 एल DH 2 ओ 28.4 छ ना 2 4 HPO
  3. Dibasic स्टॉक के 190 मिलीग्राम के लिए एक भस्मक शेयर के 810 मिलीलीटर जोड़ें.
4% Paraformaldehyde की लगानेवाला तैयार
  1. बराबर भागों 0.2M सोडियम फास्फेट बफर करने के लिए 8% paraformaldehyde स्टॉक जोड़ें
  2. नोट: यह तय सबसे ताजा तैयार है अग्रिम में 72 घंटे से अधिक नहीं है,.
परफ्यूज़न और भंडारण Buffers तैयार:
फास्फेट तैयार खारा, 7.4 पीएच बफर
  1. 1 एल DH 2 हे
  2. 9 छ NaCl
  3. 144 मिलीग्राम के.एच. 2 पीओ <> उप 4
  4. 795 मिलीग्राम ना 2 4 HPO
  5. पीएच की जाँच करें
HEPES सोडियम azide पीएच 7.4 के साथ हैंक्स समाधान (HBHS) के बफर
  1. 990 मिलीलीटर DH 2 हे
  2. 7.5 छ NaCl,
  3. 0.3 छ KCl
  4. 0.06 छ 2 के.एच. पीओ 4
  5. 0.13 छ ना 2 4 HPO
  6. 2 ग्राम Dextrose / ग्लूकोज
  7. 2.4 छ 10 मिमी Hepes
  8. 0.1 छ 2 MgCl 6 भागों DH 2 हे
  9. 0.05 छ MgSO 4 7 DH 2 हे भागों
  10. 0.165 छ 2 CaCl 2 भागों DH 2 हे
  11. 90 मिलीग्राम NaN 3
  12. पीएच की जाँच करें

तालिका 1 लगानेवाला और Buffers की तैयारी.

चित्रा 1
आकृति 1.

चित्रा 2
चित्रा 2. परफ्यूज़न उपकरण मैं तैयार लगानेवाला लाइन के साथ शुरू करो. हवा बुलबुले की टयूबिंग फ्लश और तेजी से खदेड़ने और सिरिंज में बफर और लाइन के माध्यम से वापस बफर के साथ भरें. सुई अंत पर वाल्व बंद. हवाई बुलबुले के बिना शुरू लगानेवाला लाइन लगानेवाला बोतल में रखें.

चित्रा 3
चित्रा 3 परफ्यूज़न उपकरण द्वितीय की तैयारी. 1. सुई के छोर पर वाल्व खोलें. 2. बफर वाल्व (नीला) बारी करने के लिए प्रवाह के लिए स्थिति. 3. हवा बुलबुले की टयूबिंग फ्लश और तेजी से खदेड़ने और सिरिंज के साथ वापस बफर बफर के साथ भरें. 4. सुई छोर पर वाल्व बंद करें. बफर बोतल में टयूबिंग रखें. टेस्ट करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रणाली सही बंद है बनाने के लिए दबावदबाव नापने का यंत्र बल्ब पंप और गेज देख ly. तंत्र अब छिड़काव प्रक्रिया के लिए तैयार है.

चित्रा 4
चित्रा 4 बफर वितरण के लिए स्थिति में परफ्यूज़न उपकरण.

चित्रा 5
चित्रा 5 परफ्यूज़न सर्जरी मैं एक) आवरण और पेट की दीवार के माध्यम से एक पार्श्व चीरा करें. ख) डायाफ्राम में एक चीरा और दिल को उजागर डायाफ्राम में कटौती. हंसली के लिए पसलियों के दोनों ओर समानांतर कटौती करें. ग) hemostat साथ उरोस्थि की टिप दबाना है और सिर पर hemostat जगह है.

चित्रा 6
चित्रा 6 परफ्यूज़न सर्जरी द्वितीय. ) एक आरोही महाधमनी में कटौती निलय के माध्यम से छिड़काव सुई पास. ख) सुरक्षितछिड़काव दिल को दबाना hemostats की सुई का उपयोग एक सेट. एक संशोधित hemostat का एक दूसरा सेट भी सुई टिप में रिसाव रोकता है चारों ओर महाधमनी दबाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आईरिस कैंची का प्रयोग बाएं वेंट्रिकल के पीछे के अंत के लिए एक छोटा सा चीरा बनाते हैं.

7 चित्रा
7 चित्रा बफर पम्प दबाव नापने का यंत्र के लिए लाइन में दबाव बनाने के बल्ब के साथ छिड़काव. वाल्व खोलें (1) और सुई हब के लिए देते हैं. यह सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले शुरू कर रहे हैं बनाने के लिए महत्वपूर्ण है. 80 मिमी Hg के एक दबाव नापने का यंत्र बल्ब और पंप बफर जलसेक अवधि के दौरान इस दबाव को बनाए रखने.

संख्या 8
8 चित्रा बफर एक बार लगानेवाला साथ परफ्यूज़न लगभग समाप्त हो गया है (200 मिलीलीटर) बफर वाल्व (1) स्विच करने के लिए लगानेवाला के लिए प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं. दबाव धीरे - धीरे एक को बढ़ा जा सकता है130 मिमी Hg की अधिकतम.

9 चित्रा
9 चित्रा विच्छेदन मैं) कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर सिर को हटा दें. ख) गर्दन से नाक के midline के साथ त्वचा में एक चीरा बनाने के लिए और खोपड़ी बेनकाब. ग) शेष गर्दन की मांसपेशियों ट्रिम इतना है कि खोपड़ी के आधार संपर्क में है. सिर पकड़ ताकि कपाल सतह में एक बड़ी खोलने (रंध्र मैग्नम) पहुँचा जा सकता है. ध्यान से रंध्र मैग्नम में परितारिका कैंची की एक जोड़ी की तेज अंत डालने और एक काट कर. Contralateral पक्ष के लिए एक ही पैंतरेबाज़ी दोहराएँ. सेरिबैलम के आसपास खोपड़ी स्पष्ट rongeurs का प्रयोग करें.

10 चित्रा
10 चित्रा विच्छेदन द्वितीय. एक सावधानी से) खोपड़ी के भीतरी सतह के साथ कैंची स्लाइड. टिप पर लिफ्ट के रूप में आप मस्तिष्क को नुकसान को रोकने के लिए काट रहे हैं. एक ही दोहराना के लिएविपरीत दिशा. खोपड़ी छील rongeurs मस्तिष्क से दूर का प्रयोग करें. ख) खोपड़ी के साथ चित्रण हटा दिया है और मस्तिष्क अवगत कराया. ग) एक रंग का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क की सबसे पूर्वकाल स्थान पर घ्राण बल्ब और तंत्रिका कनेक्शन तोड़. ध्यान से मस्तिष्क के नीचे को हटायें की आसानी के लिए कनेक्शन को तोड़ साथ रंग टिप गाइड. मस्तिष्क निकालें और यह लगानेवाला की एक शीशी में डाल दिया.

Discussion

एक सफल ऑपरेशन के लिए अतिरिक्त नोट्स:

  1. एक बार डायाफ्राम का उल्लंघन है, तेजी से पूर्व में होना के रूप में hypoxia और hypercapnia अपरिवर्तनीय शारीरिक परिवर्तन है कि बाद के विश्लेषण उलझाना कर सकते हैं आरंभ हो जाएगा.
  2. जब सुई डाला और जगह में clamped, अवशिष्ट दबाव रक्त सुई (फ़्लैश बैक) के आधार पर धक्का होगा. वास्तव में, बड़े जानवरों सख्ती रक्त निष्कासित हो सकता है. यह महत्वपूर्ण है कि रक्त में कम से कम हवा बुलबुले कि छिड़काव पूरा करने के लिए एक बाधा उपस्थित शुरू से बचने के लिए सुई का आधार तक पहुँचने. अगर कोई रक्त सुई आधार पर मनाया जाता है, बफर के साथ यह छिड़काव रिग की दुकान बंदरगाह करने के लिए संलग्न द्वारा सुई हटाने और फिर से भरना. एक बार बफर टिप के माध्यम से चला गया है, सुई दिल में reinserted है किया जा सकता है.
  3. महाधमनी भीतर सुई के उचित स्थान महत्वपूर्ण है, यह महाधमनी चाप के रूप में दूर के रूप में नहीं पहुँचना चाहिए.
  4. यदि एकाधिक perfusions को जगह ले रहे हैं यह आवश्यक नहीं हैशुरुआत हर समय से ओ सेटअप. उपयोगकर्ता के लिए दोनों और प्रत्येक बोतल (में पशु 200mls / समाधान) में बफर लगानेवाला के लिए उचित मात्रा की जरूरत है. बोतलें भी अगर जरूरत है refilled किया जा सकता है. सबसे महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए छिड़काव लाइन कि पशु सेटअप (उत्पादन वाल्व) से चलाता है निस्तब्धता है. छिड़काव के पूरा होने के बाद इस लाइन में 4% paraformaldehyde के होगा. बफर बोतल से टयूबिंग निकालें और एक 50 मिलीलीटर पानी से भरा करने के लिए बाहर फ्लश लगानेवाला सिरिंज का उपयोग करें. सुनिश्चित करें आउटलेट वाल्व paraformaldehyde के समुचित निपटान के लिए एक बेकार संग्रह बीकर में रखा गया है. इस तीन बार दोहराएँ. उसी में 2.3 दिखाया विधि का उपयोग कर बफर के साथ फिर से भरना.
  5. निर्धारण के लिए इस विधि के प्रयोग की आवश्यकताओं के अनुसार दोनों बफर और लगानेवाला अन्य fixatives (जैसे EM के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में) को बदलने की क्षमता के साथ उच्च अनुकूलनीय है.
  6. प्रणाली भी अक्सर रहते ऊतक की निकासी के लिए इस्तेमाल किया है. इस के लिएप्रक्रिया एक बस में ही (बफर बोतल, जबकि अभी भी पूरे सिस्टम से जुड़े एक बर्फ बाल्टी में रखा गया है और लगानेवाला बोतल खाली लेकिन सील के रूप में सेटअप है) के बफर के वितरण का उपयोग करता है यह इष्टतम दबाव में ठंड बफर छिड़काव का आश्वासन दिया. यहाँ से प्रणाली या तो डाई सीधे जोड़ने बफर करने के लिए (अगर मात्रा एक मुद्दा नहीं है) या बफर / बफर बीच में डाई समाधान की एक न्यूनतम राशि के साथ एक सिरिंज का उपयोग करें द्वारा fixable रंगों के अर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता है - लगानेवाला कदम.
  7. संवहनी कास्टिंग के मामले में दबाव की निगरानी बफर कदम महत्वपूर्ण लेकिन दलदलापन और solidifying कास्टिंग समाधान की प्रकृति के कारण या तो एक 50ml सिरिंज प्रत्यक्ष वितरण या उपकरण के लिए एक डिस्पोजेबल माध्यमिक लगाव के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए (टयूबिंग वाल्व, और पकड़े कंटेनर) मौजूदा प्रणाली के साथ इंटरफेस करने के लिए इस्तेमाल किया जा. हमारे प्रयोगशालाओं संवहनी कास्टिंग और छिड़काव उपकरण की डिजाइन के निर्माण से पहले. इसलिए हम सेंट नहीं कर सकते हैंखाया कि दबाव माप वितरण साइट पर एक सटीक माप होगा. नंबर करने के लिए चिपचिपा तरल पदार्थ के सफल प्रसव प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम तंत्रिका संचार प्रौद्योगिकी के लिए केंद्र (CNCT), एक P41 संसाधन के बायोमेडिकल इमेजिंग और बायोइन्जिनियरिंग के राष्ट्रीय संस्थान (NIBIB, EB002030 P41) के द्वारा वित्त पोषित है और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (एनआईएच) द्वारा समर्थित केंद्र द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) Ketaset NDC 0856-2013-01 10 mL vial
Surgery:
Needle tip, 27 GA x 1.25" Materiel Services 25251
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) Fine Science Tools 14519-14
Straight iris scissors Fine Science Tools 14058-11
Standard tweezers Fine Science Tools 11027-12
Pair of fine (Graefe) tweezers Fine Science Tools 11050-10
1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) surgicaltools.com 17.21.51
2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) Fine Science Tools 13013-14
1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) Fine Science Tools 13013-14
15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) Fisnar 5601137
Perfusion:
HyPerfusion system or equivalent
Phosphate buffered saline, pH 7.4
4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4
Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10"
Crushed ice
Water bath (37 °C)
Timer
50 ml syringe Medline Industries NPMJD50LZ
Dissection:
Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) Fine Science Tools 14054-13
Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers Fine Science Tools 16020-14
Straight iris scissors (~9 cm) Fine Science Tools 14058-11
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") Fine Science Tools 10091-12
Post-Fixation & Storage:
50 ml glass vial
40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l)

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References

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Comments

1 Comment

  1. Thank you for your nice JoVE article. I'm trying to put together a low cost perfusion system for training purposes and really liked your approach. Do you have a part list for the perfusion apparatus? If this was made by a shop at UMich or UW, would it be possible for me to either get the part list or order a replica?

    Sincerely,

    Mehrdad Jazayeri, Ph.D.
    Assistant Professor, Department of Brain and Cognitive Sciences
    Investigator, McGovern Institute for Brain Research
    MIT 46-6041
    43 Vassar Street
    Cambridge, MA 02139, USA
    Phone: 617-715-5418
    Fax: 617-253-5659
    Email: mjaz@mit.edu

    Reply
    Posted by: Mehrdad J.
    December 10, 2013 - 1:21 AM

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